Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kovalent vedlegg av enkeltmolekyler for AFM-basert Force Spectroscopy

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60934
Automatic Translation
1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

Summary

Kovalent vedlegg av sondemolekyler til atomkraftmikroskopi (AFM) cantilever tips er en viktig teknikk for undersøkelse av deres fysiske egenskaper. Dette gjør at vi kan bestemme strekkkraften, desorpsjonskraften og lengden på polymerer via AFM-basert enkeltmolekylkraftspektroskopi med høy reproduserbarhet.

Abstract

Atomkraftmikroskopi (AFM)-basert enkeltmolekylkraftspektroskopi er et ideelt verktøy for å undersøke interaksjonene mellom en enkelt polymer og overflater. For et ekte enkeltmolekyleksperiment er kovalent tilknytning av sondemolekylet avgjørende fordi bare da kan hundrevis av kraftforlengelsesspor med ett og samme enkeltmolekyl oppnås. Mange spor er i sin tur nødvendig for å bevise at et enkelt molekyl alene er undersøkt. I tillegg er passivisering avgjørende for å forhindre uønskede interaksjoner mellom enkeltprobemolekylet og AFM cantilever-spissen, samt mellom AFM-cantilever-spissen og den underliggende overflaten. Funksjonaliseringsprotokollen som presenteres her er pålitelig og kan enkelt brukes på en rekke polymerer. Karakteristiske enkeltmolekylhendelser (dvs. strekninger og platåer) oppdages i kraftforlengelsessporene. Fra disse hendelsene kan fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde oppnås. Dette er spesielt viktig for den nøyaktige undersøkelsen av stimuli-responsive systemer på enkeltmolekylnivå. Som eksemplariske systemer poly(etylen glykol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) og polystyren (PS) er strukket og desorbed fra SiOx (for PEG og PNiPAM) og fra hydrofobe selvmonterte monolayer overflater (for PS) i vandig eskeidige omgivelser.

Introduction

Siden oppfinnelsen på 1980-tallet1har atomkraftmikroskopet (AFM) blitt en av de viktigste bildeteknikkene i naturvitenskap med subnanometer romlig oppløsning, sub-piconewton kraftoppløsning og muligheten for måling i ulike løsemiddel- og temperaturforhold2,3,4,5,6,7.

Bortsett fra bildebehandling8,9, AFM brukes til å utføre enkelt molekyl kraft spektroskopi (SMFS) gir innsikt i klebende interaksjoner mellom en enkelt polymer og overflater, fysiske egenskaper av enkelt polymerer og utfoldende mekanismer av proteiner7,10,11,12,13,14,15,16. I et vanlig SMFS-eksperiment blir den funksjonaliserte cantilever-spissen brakt i kontakt med en overflate slik at polymeren ved AFM cantilever tipper fysisorber til denne overflaten. Ved å trekke Tilbake AFM cantilever spissen fra overflaten, en endring i nedbøyning av AFM cantilever konverteres til en kraft som fører til en kraft-forlengelse kurve4. Fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde kan bestemmes som avhengig av ulike parametere som trekkhastighet, botid på overflaten, innrykkdybde inn i overflaten, temperatur, løsningsmiddel17,18 og forskjellige overflater som faste underlag, polymerfilmer eller støttet lipidbilag19,,20,,21,,22. Videre kan en polymer undersøkes i forskjellige romlige retninger, og dermed undersøke friksjonsegenskapene til polymeren23,24,25,26.

En kovalent tilknytning av den undersøkte polymeren til en AFM cantilever tips er avgjørende for slike studier. Dermed forhindrer et høyt utbytte av enkeltmolekylhendelser med en og samme polymer bundet til en AFM cantilever tips noen skjevhet av resultatene på grunn av kalibrering av fjærkonstanten av AFM cantilever27,28, varierende festepunkter29 eller varierende polymerer (med forskjellige konturlengder) som i tilfelle nanofiskeeksperimenter30,31,32. Også interaksjoner med andre polymerer samt snitteffekter kan forebygges mye18,28. For kovalent vedlegg av en polymer til AFM cantilever tips, ulike typer kjemiske modifikasjoner kan brukes, hvorav mange er oppsummert i boken av Hermanson33. Amine og tiol-baserte koblingreaksjoner samt klikkkjemi representerer de mest brukte metodene i AFM cantilever tips funksjonalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 viser hvordan du bruker 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) / NHS kjemi for å feste et protein til en AFM cantilever tips. Men de nevnte funksjonelle gruppene har en tendens til å krysskoble, og dermed fører til tap av funksjonalitet43,44. Også karbodiimides viser en tendens til rask hydrolyser i løsning43. Maleimide og tiol grupper er generelt mer stabile og viser ikke krysskoblinger reaksjoner. Den presenterte protokollen er en optimalisering av tidligere publiserte protokoller gitt i referanser35,39.

Her presenteres en pålitelig funksjonaliseringsprotokoll som enkelt kan justeres til et stort antall forskjellige polymerer, uavhengig av egenskaper som konturlengde eller hydrofobiitet. Tre forskjellige polymerer ble valgt som eksempel: hydrofil polyetylenglykol (PEG) og poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) samt høy molar masse hydrofobe polystyren (PS). For å sikre en kovalent bindende evne med et passende linkermolekyl, ble de tre polymerene valgt for å ha en telechelsk tiol moiety som funksjonell sluttgruppe. Linkermolekylet i seg selv er vanligvis en kort PEG-polymer med to aktive steder, en silane-gruppe i den ene enden og en maleimidgruppe i den andre enden. Førstnevnte muliggjør et kovalent vedlegg til AFM cantilever-spissen og sistnevnte en bindende reaksjon med den tiolske gruppen av den funksjonaliserte høy molarmassepolymeren. Videre fungerer inaktive PEG linker molekyler som et passiviseringslag for å forhindre uønskede interaksjoner mellom sondepolymeren og AFM-cantilever-spissen, samt mellom AFM-kantileverspissen og den underliggende overflaten.

Protocol

MERK: Se figur 1 for en skjematisk oversikt.

1. Oppsett av reagens

MERK: Polymerene som brukes til denne protokollen er: maleimid-polyetylenglykol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), tiol-polyetylenglykol-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), tiol avsluttet poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) og tiol avsluttet polystyren (PS-SH, 1,3 mDa).

  1. Forbered den veldefinerte og høye molarmassen PNiPAM-SH via atomoverføring radikal polymerisering, etterfulgt av konvertering og reduksjon av den funksjonelle sluttgruppen for innføring av en tiol moiety, som beskrevet i litteraturen18. Se figur 1 for detaljerte strukturer.
  2. For lagring av kjemikaliene, forberede mindre aliquots i et tørt hanskebokssystem med nitrogen atmosfære for å unngå eksponering for atmosfærisk oksygen og fuktighet. PEG og PNiPAM er hygroskopiske45,,46 og de funksjonelle endegruppene peg, PNiPAM og PS er kjent for å bli lett oksidert når de oppbevares ved omgivelsesforhold33,,47,48. Alle kjemikalier må lagres ved -20 °C.
  3. Bruk analytiske løsemidler eller høyere. Videre bruker du ultrarent vann til å skylle AFM cantilevers chips og glass fordi enkeltmolekyleksperimenter er svært følsomme for all forurensning.

2. Oppsett av utstyr

MERK: Bruk pinsett og beger laget av rustfritt stål eller glass. Bruk inverterte pinsett for et trygt grep (f.eks. modell R3 SA har en lav fjærkonstant).

  1. Forbered RCA (ultrarent vann, hydrogenperoksid og ammoniakk (5:1:1)) løsning for å rengjøre glass og pinsett.
  2. Sett fartøyene i et beger og fyll det med RCA til glass eller pinsett er fullt dekket.
  3. Varm opp begeret fra trinn 2,2 i 1 t ved 80 °C.
  4. Skyll karene deretter med ultrarent vann til ingen skarp lukt er konstaterbar lenger (minst tre ganger).
  5. Tørt glass og pinsett i en ovn (120 °C).

3. Tips funksjonalisering

MERK: Alle trinn skal utføres i en røykhette for å unngå innånding av organiske damper. I tillegg er hansker, labfrakk og øyebeskyttelse nødvendig. Bruk nitril- eller latekshansker for hvert trinn for å unngå kontaminering. Bruk løsemiddelbestandige hansker når du bruker toluen. Alle trinn, med mindre annet er spesifisert, gjøres ved RT. Bruk ferskt utstyr og hansker for hvert trinn for å unngå mulig krysskontaminering.

  1. Utfør overflateaktivering ved å bruke oksygenplasma på AFM cantilever chip MLCT-Bio-DC.
    MERK: Effektiviteten av plasmabehandlingen for ytterligere funksjonaliseringstrinn skalerer med oksygeninnholdet i plasmakammeret.
    1. Bruk nyrengjortpiner til å plassere AFM cantilever chips i et plasmakammer (40 kHz, 600 W).
    2. Bruk spesialmodifisert aktiveringsprogram: evakuering (0,1 mbar) – flom med oksygen til et trykk på: 0,2 mbar (4 min) – plasmaprosess (strøm: 40%, varighet: 2 min, prosesstrykk: 0,2 mbar).
    3. Ventiler kammeret og fortsett med trinn 3.2.2 umiddelbart for å forhindre adsorpsjon av forurensninger til AFM cantilever chips fra luft.
  2. Silanization og PEGylation
    MERK: Timing er en kritisk parameter mellom trinnene. Forbered løsningene så friske som mulig i ventetiden. Maleimide grupper er underlagt hydrolyser i vandige medier og tioler lett bli oksidert til disulfider i løsning33,47 hindrer AFM tips funksjonalisering reaksjoner.
    1. Forbered en silane-PEG-mal oppløsning i toluen (1,25 mg/ml) i løsemiddelbestandige plast- eller glassrør og hell 6 ml av oppløsningen i flate Petri-retter, 3 ml hver.
      MERK: Hvis binding av flere probepolymerer observeres i SMFS-eksperimentet, kan blanding av silane-PEG-mal med ikke-funksjonell silane-PEG redusere antall forankringspunkter. For justering av passiviseringslaget PEG med forskjellige masser (dvs. konturlengder) kan brukes27.
    2. Inkuber AFM cantilever chips umiddelbart etter trinn 3.1.3 i silane-PEG-mal løsning (opptil 10 chips per Petri parabolen) for 3 t ved 60 °C35.
    3. Ta Petri retter ut av ovnen og la løsningen avkjøles i minst 10 min.
    4. Skyll hver AFM cantilever chip nøye. Reduser virkningen av kapillærkrefter på AFM cantilever når du passerer luftløsningsgrensesnittet, for eksempel ved å vippe disse sjetongene litt når de fordyper seg i løsningen.
      1. For PEG- og PS-polymerer, skyll tre ganger med toluen.
      2. For PNiPAM polymer, skyll en gang med toluen og to ganger med etanol.
    5. Velg minst to AFM cantilever chips som kontroll AFM cantilever chips, hoppe trinn 3.3 og skyll dem som følger for å øke polariteten av løsemiddel:
      1. For PEG- og PS-polymerer, skyll to ganger med etanol og en gang med ultrarent vann.
      2. For PNiPAM polymer, skyll to ganger med ultrarent vann.
        MERK: Kontroll av AFM cantilever-brikker har gått gjennom alle funksjonaliseringstrinn unntatt polymervedlegget (trinn 3.3). De tjener til å bevise rensligheten av funksjonaliseringsprosessen, AFM cantilever chip holder system, overflater og løsemidler som brukes for SMFS eksperimentet.
  3. Kovalent polymer vedlegg
    MERK: Selv om AFM cantilever-spissen forventes å være fullstendig dekket med maleimidegrupper, er det bare noen få bindende steder for enkeltsondepolymeren, fordi maleimide gjennomgår hydrolyser i vann som fører til inaktive PEGs47. Disse inaktive PEGs fungerer som et passiviseringslag, som beskrevet ovenfor.
    1. Inkuber AFM cantilever chips rett etter trinn 3.2.5 i en av følgende polymer løsninger i 3 ml Petri retter. Hvis den respektive polymeren ikke oppløses riktig, bruk et 40 °C-vannbad og rør oppløsningen godt.
      MERK: Da bruk av tiol avsluttet polymerer kan føre til dannelse av disulfidbindinger som hindrer reaksjonen med de maleimide gruppene av silane-PEG-mal, anbefales et reduksjonsmiddel, spesielt hvis trinn 3.3 påføres i vandige buffere for vannløselige polymerer33.
      1. For PEG- og PS-polymerer, bruk en konsentrasjon på 1,25 mg/ml i toluen i 1 t ved 60 °C.
      2. For PNiPAM polymerer, bruk en konsentrasjon på 1,25 mg/ml i etanol for 3 timer ved RT.
        MERK: Hvis binding av flere probepolymerer observeres i SMFS-eksperimentet, bør konsentrasjonen av polymeren reduseres.
    2. Skyll forsiktig hver AFM cantilever chip.
      1. For PEG- og PS-polymerer skyller du to ganger med toluen, to ganger med etanol og en gang med ultrarent vann etter 10 minutter nedkjøling.
      2. For PNiPAM polymerer, skyll to ganger med etanol og to ganger med ultrarent vann.
    3. Oppbevar hver AFM cantilever chip separat i en liten (1 ml) Petriskål fylt med ultrarent vann ved 4 °C til bruk i et eksperiment.

4. Overflateforberedelse

  1. Silisiumoksid wafer
    MERK: Denne overflaten ble brukt til SMFS med PEG og PNiPAM.
    1. Skjær et silisiumoksid wafer i små biter ved hjelp av en diamantkniv.
    2. Sett silisiumoksidbitene separat i mikrocentrifugerør og fyll disse rørene med etanol.
    3. Sonicate silisiumoksid stykker i 10 min.
    4. Skyll silisiumoksidbitene med etanol to ganger og tørk dem forsiktig under en nitrogenstrøm. Bruk silikonoksidbitene umiddelbart.
  2. Selvmontert monolayer av hydrofobe alkane thiol på gull (SAM)
    MERK: Denne overflaten ble brukt til SMFS med PS. Se litteratur39,49 for mer informasjon om SAMs.
    1. Bruk en gullbelagt silisiumwafer (A [100], 5 nm titan, 100 nm gull) til å utføre trinn 4.1.1 – 4.1.4.
    2. Inkuber overflatebitene i en 1-dodekaniooppløsning (2 mM) i 18 timer.
    3. Skyll de nylagde SAM-ene i etanol to ganger.
    4. Tørre SAMs med nitrogenstrømning for direkte bruk eller oppbevar dem i etanol i opptil 4 dager for senere bruk.

5. Datainnsamling

MERK: Alle målinger vist her ble utført i ultrarent vann med en Cypher ES AFM ved hjelp av et varme- og kjøleprøvestadium for temperaturvariasjon. Generelt kan alle AFMs som gir mulighet til å måle i væsker brukes.

  1. Sett den funksjonaliserte AFM cantilever-brikken inn i AFM.
  2. Lim den tilberedte overflaten i en prøveholder som er egnet for måling i væsker (f.eks. høyoppløselig replikering stilbeting e10RF eller et UV herdbart klebemiddel).
    MERK: Disse bindingsmidlene er svært inerte og motstandsdyktige mot et stort antall polare løsemidler. Motstanden til limet mot ikke-polare løsemidler (f.eks. toluen eller heksan) eller høye temperaturer bør kontrolleres før bruk.
  3. Senk AFM cantilever-brikken og probeprøven i væsken, her: ultrarent vann.
    MERK: En løsningsmiddeldråpe (ca. 100 μL) kan deponeres på AFM cantilever-chipholderen. Dekker AFM cantilever chip med løsemiddel reduserer kapillær krefter, som ellers ville fungere på AFM cantilever når du nærmer prøveoverflaten passerer gjennom luftløsningsmiddelgrensesnittet.
  4. Juster om nødvendig temperaturen og la systemet likevekt.
    MERK: Temperaturendringer kan føre til avbøyning av AFM-cantilever på grunn av en bimetallisk effekt for AFM cantilevers med et reflekterende belegg som aluminium eller gull. Likevekt bør utføres bort fra overflaten (flere μm) inntil det ikke observeres ytterligere endring av nedbøyningssignalet (opptil 15 min for MLCT-Bio-DC).
  5. Varier temperaturen tilfeldig for å utelukke eventuelle effekter av aldring av funksjonaliseringen. Pass på at temperaturene som påføres ikke fører til en irreversibel bøyning av AFM cantilever.
    MERK: Eventuelle temperatureffekter på løsemiddelegenskaper (for eksempel fordampning eller endringer i viskositet) kan hemme eksperimentene dine. I de presenterte eksemplene var temperaturen variert over en rekkevidde på opptil 40 K i trinn på 10 K tar vann som løsemiddel (f.eks. fra 278 K til 318 K).
  6. Nærmer deg overflaten for å bestemme InvOLS (inverse optisk spakfølsomhet) ved å ta kraftforlengelseskurver på en hard overflate (for eksempel silisiumoksid). For dette, ta avbøyningssignalet til fotodetektoren (i V) vs piezoavstand og bestem skråningen av delen som representerer innrykk av AFM cantilever spissen inn i den underliggende overflaten (frastøtende regime) ved hjelp av en lineær funksjon. For å redusere feil, ta gjennomsnittet av minst fem verdier for å oppnå den endelige InvOLS-verdien. For ytterligere detaljer, se litteraturen4,39.
    MERK: InvOLS kan bare bestemmes pålitelig på harde overflater. I tilfelle eksperimenter på myke overflater eller grensesnitt sørger for at du plasserer en hard overflate nær myke overflater. Deretter kan InvOLS-kalibreringen gjøres før eller etter dine myke overflateeksperimenter uten behov for å demontere AFM-oppsettet.
  7. For vårkonstant bestemmelse, flytt AFM cantilever til en høyde med verken attraktive eller frastøtende interaksjoner mellom AFM cantilever tips og overflate (flere μm). Deretter registrerer du et termisk støyspektrum der strømspektraltettheten (PSD) vs frekvens er plottet. Følgende trinn utføres vanligvis av automatiserte innebygde funksjoner i kommersiell AFM-programvare: For det første analyseres det oppkjøpte termiske støyspekteret ved å tilpasse en funksjon til PSD, for eksempel en enkel harmonisk oscillator (SHO). Passformen gjøres opp til minimum mellom første og andre resonans. For det andre bestemmes området under den monterte delen av PSD vs frekvensplottet som representerer gjennomsnittlig firkantet forskyvning av AFM-cantilever i vertikal retning. Til slutt brukes likeskilleteoremet til å få AFM cantilever force constant28,50.
    MERK: Et passende frekvensområde bør brukes bestående av den første resonanstoppen av AFM cantilever. For å få et tilfredsstillende signal-til-støy-forhold, bør minst 10 PSD-er akkumuleres med høyest mulig frekvensoppløsning.
  8. Start eksperimentet. Record force kart ved å ta force-extension kurver på en rutenett-lignende måte (f.eks 10 x 10 poeng for et område på 20 x 20 μm2) for å unngå lokale overflateeffekter (f.eks, urenheter, dislokasjoner) og til gjennomsnittlig ulike overflateområder.
    MERK: Typiske parametere er en trekkhastighet på 1 μm/s og en samplingsfrekvens på 5 kHz for å sikre tilstrekkelig oppløsning. Samplingsfrekvensen bør tilpasses når trekkhastigheten er variert. Trekkavstanden skal tilpasses konturen eller desorpsjonslengden til den målte polymeren (ca. dobbelt så lang).
  9. Bruk og varier dveletiden mot overflaten slik at enkeltpolymeren kan feste seg til overflaten (vanligvis 0 – 5 s).
  10. Gjenta bestemmelseav InvOLS og fjærkonstanten på slutten av eksperimentet for å kontrollere konsistensen og stabiliteten til systemet.
    MERK: For sterk vedheft mellom polymer og overflate kan kalibreringen gjøres etter selve eksperimentet for å bevare funksjonaliseringen.

6. Dataevaluering

MERK: For dataevaluering ble en spesialskrevet programvare basert på Igor Pro brukt til å utføre følgende trinn.

  1. Konverter det rå nedbøyningssignalet (i Volt) til kraftverdier (i Newtons) ved multiplikasjon med den registrerte InvOLS og den bestemte fjærkonstanten.
  2. Trekk nedbøyningen av AFM cantilever (etter multiplikasjon av det rå nedbøyningssignalet med InvOLS) fra avstanden drevet av piezoelementene i vertikal retning for å oppnå den sanne forlengelsen (spissoverflateavstand)4.
  3. Korriger kraftforlengelseskurvene som er oppnådd for drift ved å tilpasse en lineær funksjon til grunnlinjen etter den siste hendelsen og trekke det samme fra kraftforlengelseskurven. Den monterte delen skal representere en tilstrekkelig forlengelse fra overflaten der verken attraktive eller frastøtende interaksjoner observeres mellom AFM cantilever-spiss og underliggende overflate. Deretter settes opprinnelig plan for nullaksen.
    MERK: Ved målinger på svært reflekterende overflater som gull, kan det oppstå forstyrrelser. Disse skyldes delvis refleksjon av laserstrålen fra overflaten og fra baksiden av AFM cantilever. Så, de oppnådde force-forlengelse kurver kan vise en sinusoidal kraft signal artefakt langs vertikal forlengelse. Dette er en artefakt som hindrer de endelige kraftverdiene. For å fortsatt ta hensyn til disse kraftforlengelseskurvene, er en korreksjon mulig (figur 2).
  4. Hvis forstyrrelsene vises i kraftforlengelseskurvene, velger du en representativ kraftutvidelseskurve (tilbaketrekkingskurve) som ikke viser andre hendelser enn muligens en topp med uspesifikk vedhesjon og samme sinusiotale artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2A).
    MERK: Jevn ut den representative kraftforlengelseskurven for å oppnå det lave frekvensmønsteret til interferensen.
  5. Velg en kraftutvidelseskurve som skal korrigeres (Figur 2B).
  6. Overlegg begge kraftforlengelseskurver fra trinn 6.4. og 6,5. for å sikre at begge viser samme sinusiolale artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2C).
  7. Trekk den (glatte) representative kraftforlengelseskurven fra kraftforlengelseskurven som skal korrigeres, noe som fører til en rett i stedet for en sinusoidal grunnlinje (figur 2D).
    MERK: Pass på at den uspesifikke vedhemingstoppen i den representative kurven er forskjellig fra enkeltmolekylhendelser som vises i kurvene som skal korrigeres. Faktisk er valget av den representative kurven avgjørende for en riktig korreksjon.

Representative Results

Eksemplene nedenfor viser resultater av enkeltmolekylsstrekking og desorpsjon av polymerene PEG, PNiPAM og PS. Alle AFM cantilever tips ble funksjonalisert med protokollen gitt ovenfor. PEG og PNiPAM ble målt på SiOx med temperaturvariasjon. For en detaljert diskusjon om de resulterende temperaturavhengige strekkkurvene for PEG og PNiPAM, se Kolberg et al.18 Et annet kraftforlengelsesmotiv er et platå med konstant kraft (f.eks. når de sorbing PS fra selvmonterte monolag av metyl avsluttet alkane thiols på gull (SAM) i vann4,,27,39,51).

Eksempel 1: Strekking av PEG og PNiPAM i vann
Den temperaturavhengige strekkatferden i vann ble målt ved hjelp av enkelt PNiPAM og PEG polymerer som er kovalent bundet til en AFM cantilever-spiss i den ene enden og physisorbed på en SiOx overflate i den andre enden. Etter kalibrerings- og ren kontrolleksperimenter (mindre enn 2% av kraftforlengelseskurvene viser enkeltmolekylhendelser), ble minst to kraftkart registrert for hver AFM cantilever. Det temperaturavhengige eksperimentet ble utført ved å registrere minst ett kraftkart ved hver temperatur. Når bare få strekkhendelser dukket opp, ble den respektive AFM cantilever kassert og neste AFM cantilever av brikken ble tatt (vanligvis i rekkefølgen C, B, D og E av MLCT-Bio-DC). For de eksemplariske dataene til PEG ble det observert en enkelt strekkhendelse i 95 av 500 målte kraftforlengelseskurver (19 %). For PNiPAM viste 252 av 600 kraftforlengelseskurver et strekkmønster (42 %). For en bedre sammenligning av kraftforlengelseskurvene ble det generert en enkelt hovedkurve for hver temperatur. For dette formålet ble bare de kurvene med en strekkhendelse til minst 500 pN, hvor konformasjonssvingninger og løsemiddeleffekter er ubetydelige, valgt52. Det endelige antall strekninger tatt i betraktning var 3 på 278 K, 7 på 298 K og 4 ved 318 K for PEG og 4 på 278 K, 3 på 298 K og 3 på 318 K for PNiPAM18.

Fremgangsmåten for generering av hovedkurver er gitt i figur 3. De valgte kraftforlengelseskurvene (figur 3A) skaleres til en lengde L0 (forlengelse med en kraft på 500 pN), se figur 3B. Vedhefttoppen viser en stor variasjon av uspesifikk vedheft mellom overflaten og AFM-cantilever-spissen, men påvirker ikke polymerstrekkingens oppførsel. Etter sammenslåing av de omskalerte kraftforlengelseskurvene er de i gjennomsnitt med en binominell utjevning som presentert i figur 3C. For dette konvolerer et gaussisk filter dataene med normaliserte koeffisienter avledet fra Pascals trekant på et nivå som tilsvarer utjevningsparameteren 2053. Til slutt oppnås en masterkurve for hver temperatur som angitt i figur 3D. Zoom-in viser området der temperatureffekten på kraftforlengelsesvirkemåten er mest uttalt.

En sammenligning av temperaturvirkemåten til PEG (A) og PNiPAM (B) finnes i figur 4. For PEG ble det observert en reduksjon av strekkkraften med økende temperatur. En økning på ca. 5 % av omskalert forlengelse ved 100 pN ble observert ved økning av temperaturen fra 278 til 318 K. For PNiPAM kan et motsatt temperaturavhengig skifte avsløres. En reduksjon på ca. 1 % av omskalert forlengelse ved 100 pN ble observert da temperaturen ble økt fra 278 til 328 K. I tillegg kunne den strekkfrie energien oppnås fra kraftforlengelsesmasterkurvene ved å bestemme området under kurven for en gitt kraftverdi. Dette kan brukes til å trekke ut energiske og entropiske bidrag av den strekkfrie energien ved hjelp av molekylærdynamikk (MD) simuleringer18.

Eksempel 2: Desorps jon av PS fra en SAM-overflate i vann
Desorps' desorps fra en SAM-overflate i vann kan brukes til å bestemme desorpsjonskraften og lengden og dermed kvantifisere hydrofobe interaksjonen. Etter kalibrering ble minst to kraftkart registrert på to forskjellige steder på overflaten. Når polymervedlegget var vellykket, viste kraftforlengelseskurvene platåer av konstant kraft, som karakteristisk egenskap, se figur 5A og figur 5C. Platålignende desorpsjon observeres når dynamikken i probede bindinger er mye raskere enn trekkhastigheten til AFM cantilever-spissen (kvasi-likevekt). Desorpsjonskrefter av platålignende kraftforlengelseskurver gir direkte vedhendefrie energier ved å integrere kraftforlengelsessporet54. De har blitt brukt til å bestemme elektrostatiske, dispersive og hydrofobe interaksjoner samt friksjonsegenskaper av enkeltpolymerer på overflater i flytende miljø2,,4,,23,,51,,54,55.

Hvert platå med konstant kraft ble utstyrt med en sigmoidal kurve for å bestemme desorpsjonskraft og desorpsjonslengde, som deretter ble plottet i histogrammer. Histogrammene var utstyrt med en gaussisk for å trekke ut maksimal verdi og standardavvik. For en bedre oversikt ble desorpsjonskraften og lengdeverdiene vist sammen i et scatter-plott, som angitt i figur 5B og figur 5D.

For polystyren på SAM i vann tilsvarer de bestemte desorpsjonskreftene tidligere oppnådde verdier19,23. Som desorpsjonslengden korrelerer med polymerkonturlengden51,kan desorpsjonslengdefordelingen brukes som et bevis på den kovalente bindingen av den respektive polymeren til AFM cantilever-spissen via sin funksjonelle sluttgruppe. Dermed fungerer desorpsjonslengden som et fingeravtrykk.

For mer enn én polymer festet til AFM cantilever spissen, kan kaskader av platåer (diskrete trinn) observeres i kraftforlengelseskurvene56. Hvert platå representerer desorpsjon en polymer ved en annen forlengelse. Eksperimentet gitt i figur 5C og figur 5D viste et typisk tilfelle av to polymerer festet til AFM cantilever tips samtidig. Ved å montere det endelige bruddet, kunne det bli funnet en bimodal fordeling for desorpsjonslengden, mens desorpsjonskraften viste en smal fordeling. I dette tilfellet kan den mindre desorpsjonslengden bli funnet i 90% av kraftforlengelseskurvene, enten som et enkelt platå eller som et ekstra platå på lengre platå, som gitt i figur 5C. Den høyere desorpsjonslengden ble funnet i 37% av de oppnådde kraftforlengelseskurvene. Dermed kan desorpsjonslengdefordelingen brukes til å bestemme antall forskjellige polymerer festet til AFM cantilever-spissen. Generelt er en smal fordeling av desorpsjonslengdeverdiene en god indikasjon på at en og samme enkelt polymer ble undersøkt i de oppnådde kraftforlengelseskurvene. Samtidig kan en superposisjon av de respektive krefter-utvidelsen brukes til å avgjøre om en og samme enkelt polymer er målt.

Etter å ha bevist kovalent binding av en enkelt PS polymer, kan ytterligere eksperimenter med denne PS polymer utføres varierende substrat (solid overflate samt polymerfilmer), løsemiddelforhold, temperatur, trekkehastighet eller botid.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over tipsfunksjonaliseringsprosessen. Inkluderer kjemisk modifisering av AFM cantilever tips etter (1) plasmaaktivering (2) silanization / PEGylation og (3) polymer vedlegg. I tillegg vises de detaljerte kjemiske strukturene til polymerene som brukes, nemlig PEG, PNiPAM og PS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eliminering av forstyrrelser i kraftforlengelseskurver. (A)Finn en kraftforlengelseskurve som viser en sinusoidal kraftsignalartefakt langs utvidelsen, men som ikke har noen enkelt molekylstrekkhendelse. (B) Velg en kraftforlengelseskurvemed en enkelt molekylhendelse, som skal korrigeres fra den sinusikale artefakten. (C) Overlegg kurvene for å kontrollere om de sinusikale artefaktene i kurvene virkelig samsvarer. (D) Ved å trekke kraftforlengelseskurven (A) fra (B) oppnås en kraftforlengelseskurve med en rett grunnlinje. Selv om vedhemingstoppen ikke kan brukes til videre analyse, er kraftforlengelseskurven nå korrigert for artefakten som fører til mye mer nøyaktige kraftverdier i regionen av enkeltmolekylhendelsen (her: > 0,2 μm forlengelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Fastsettelse av masterkurver fra kraftforlengelseskurver av PEG ved 298 K. (A) Eksperimentelle data på 298 K, ved hjelp av 7 kraftforlengelseskurver. Etter omkalking til en lengde L0 med en kraft på 500 pN (B), kan kraftforlengelseskurvene slås sammen og i gjennomsnitt ved binominell utjevning som får en hovedkurve (C). De omskalerte kurvene gis som prikker mens hovedkurven vises som en heldekkende linje. Til slutt kan de oppnådde masterkurvene for ulike temperaturer sammenlignes (D). Zoom-in indikerer området der temperatureffekten på kraftforlengelsesvirkemåten er mest uttalt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning av temperaturavhengige hovedkurver av PNiPAM og PEG. For PEG observeres det en økning av omskalert forlengelse ved 100 pN (mellomkraftområde) ved økning av temperaturen (A),mens for PNiPAM avsløres et motsatt temperaturavhengig skifte (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Analyse av kraftforlengelseskurver av PS på SAM i vann. (A) Eksemplarisk kraftforlengelseskurve (blå) med sigmoidal passform på platået (lilla). I tillegg markerer pilene den bestemte kraften (rød) og lengden (grønn) på platået. Desorpsjonskraften og desorpsjonslengdeverdiene oppnådd av sigmoidal passer vises i en scatter-tomt, og de resulterende histogrammene er utstyrt med en gaussisk. (B) De bestemte gjennomsnittlige verdiene for desorpsjonskraft og desorpsjonslengde er (112 ± 6) pN og (659 ± 7) nm, hvor 93 % av kraftforlengelseskurvene viser slike enkeltplatåhendelser. (C) Eksemplarisk kraftforlengelseskurve (blå) for to polymerer festet til AFM cantilever-spissen samtidig. Her viser desorpsjonskraften en unimodal fordeling med en gjennomsnittlig kraftverdi på (117 ± 5) pN, mens en bimodal fordeling kan finnes for desorpsjonslengden som fører til gjennomsnittlige lengdeverdier på (656 ± 9) nm og (1050 ± 16) nm. (D) 90% av de samplede kraftforlengelseskurvene viser bare enkeltplatåhendelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

AFM-baserte SMFS er et av de viktigste verktøyene for å undersøke enkeltmolekylinteraksjoner i polymerfysikk. For et ekte enkeltmolekyleksperiment er kovalent tilknytning av sondepolymeren til en AFM-cantilever-spiss avgjørende.

Mange tidligere verk er basert på nanofiskeeksperimenter, spesielt for PNiPAM, hvor polymerer adsorseres på en overflate og deretter strekkes ved å tilfeldig plukke dem fra substratet ved hjelp av en AFM cantilever tips30,31. Dette kan endre resultatene og føre til feiltolkning av enkeltmolekylatferd. Der kan samarbeidseffekter dominere resultatene fordi interaksjoner med nærliggende polymerer ikke kan utelukkes. Dette har stor innvirkning på resultatene, spesielt for polymerer som viser betydelig forskjellig oppførsel i bulk sammenlignet med enkelt isolerte molekyler57,58.

Funksjonaliseringsprotokollen som presenteres her er pålitelig og kan lett brukes på forskjellige polymerer, uavhengig av konturlengde, hydrofobiitet eller den steriske hindringen av monomerene. I tillegg er det gitt en passivisering for å forhindre uønskede interaksjoner mellom enkeltprobepolymeren og AFM-cantilever-spissen, samt mellom AFM-cantilever-spissen og den underliggende overflaten. Videre vises evalueringen av kraftutvidelseskurver som viser strekkhendelser. Der foreslås det en prosedyre for fastsettelse av master force-extension kurver. Dette gir et bedre middel til å avsløre, for eksempel temperaturrelaterte effekter på kraftforlengelsesatferden. Videre er analysen av enkeltmolekyl desorpsjonhendelser med konstant kraftplatåer gitt. Også en enkel måte å korrigere sinusikotale kraftsignalartefakter i kraftforlengelseskurver er gitt som ellers kan svekke resultatene av eksperimentet.

Sammenlignet med Stetter et al.39, er funksjonaliseringsprosedyren som presenteres her redusert til tre trinn i stedet for fire og robustheten i prosedyren forbedres. Den store fordelen med å utføre PEGylation og silanization i ett trinn er å ha en bedre kontrollert reaksjon og å øke utbyttet. Videre må færre løsninger være forberedt og det kreves færre sneringsskritt. Dette reduserer innsatsen og tiden for forberedelse og øker reproduserbarheten. Videre er flytting av AFM-cantilevers alltid en kritisk del av funksjonaliseringsprosessen. En overføring fra en løsning til den andre risikerer alltid å påvirke funksjonaliseringskvaliteten på grunn av overføringer gjennom luftvanngrensesnittet eller for å miste AFM-cantilevers ved feil bruk av pinsett.

For å bevise riktig kovalent vedlegg av en enkelt polymer til en AFM cantilever tips forskjellige forhold må oppfylles. For det første er kontroll-AFM-cantilevers av betydelig betydning og bør være forberedt på hver funksjonalisering. Tilpasningsprosessen og væskecellen for å utføre eksperimentene anses bare å være rene, hvis et lite antall kraftutvidelseskurver viser strekninger eller platåer i kontrolleksperimentet (i de presenterte eksemplene mindre enn 2%).

Et klart strekkmønster uten ytterligere dråper eller maxima er avgjørende for å ha riktige enkeltmolekylsstretchinghendelser. I tillegg bør avhengigheten av bruddkraft på kraftbelastningshastigheten ved brudd eller fullstendig elastisk respons fra strekkkurven analyseres for å utelukke samtidig desorpsjon av flere polymerer59,60. For PEG og PNiPAM viste 19 % og 42 % av kraftforlengelseskurvene som ble tatt i forskjellige posisjoner av overflaten, et slikt strekkmønster. For å oppnå strekkhendelser må kissisorpsjonen av polymeren til den respektive underliggende overflaten være sterk. Ellers observeres en platålignende desorpsjonshendelse. Dette er enda mer avgjørende for påvisning av strekkhendelser ved høye krefter (opptil 500 pN eller mer). Siden denne sterke fysisorpsjonen ikke oppfylles for hver kraftforlengelseskurve, er utbyttet av slike hendelser mindre enn for rene platålignende desorpsjonshendelser. Som et alternativ kan sterkt befølgegrupper som kategorikoler eller chemisorption mellom polymer og underliggende overflate brukes. Dette krever imidlertid innføring av ytterligere funksjonelle grupper eller koblingssteder vedpolymer61,62.

Faktisk gir massen (dvs. konturlengde) av polymeren et verdifullt fingeravtrykk. Selv om massen ikke direkte kan oversettes til den målte konturlengden av følgende grunner, er lengdefordelingen svært verdifull for å definere enkeltmolekylhendelser. I tilfelle av en PNiPAM polymer medƉ lav polydispersitet ( 1,28), fant vi betydelige forskjeller i forlengelsesverdiene for de oppnådde strekkhendelsene (og dermed i polymerlengden) i forsøkene. En grunn til dette kan være fastsettelse av polymerlengden og dens fordeling. I størrelse-eksklusjon kromatografi (SEC), bestemmes en relativ vekt av målpolymeren i forhold til standarder som PS eller poly (metylmetakrylat) (PMMA)63. Den antatte relative vekten forventes å avvike fra den absolutte molekylvekten fordi den hydrodynamiske radiusen til målpolymeren og standarden kan variere betydelig. I tillegg kan silane laget bli oligomerized av falskt vann i toluen under funksjonaliseringsprosessen. Vedlegget av slike oligomers til AFM cantilever tips fører til et mer fleksibelt lag med færre ankerpunkter64. Også festepunktet til polymeren til silisiumlaget kan ikke nødvendigvis være på toppen som fører til et skifte av de oppdagede lengdeverdiene29. Mens en polymermodell som ormlignende kjede (WLC) eller den fritt felles kjede (FJC) modellen ikke kan reprodusere den respektive kraftforlengelsesvirkemåten for PEG eller PNiPAM riktig over hele forlengelsesområdet18,,29,41,65,66, kan en slik polymermodell være verdifull for andre polymere og proteinsystemer10,15,67,68.68

Kovalent vedlegg av en enkelt PS polymer (med en konturlengde på mer enn 1 μm) anses bare å være vellykket, når et betydelig antall kraftforlengelseskurver viser et langt nok platå med konstant kraft (figur 5). Et platå som følge av desorbing en enkelt polymer er definert av en enkelt skarp dråpe av en konstant kraft til baseline ved en viss forlengelse, som gitt i figur 5A. Hvis flere polymerer er festet til AFM cantilever-spissen, observeres en kaskade av platåer56 (figur 5C). Platålengden (desorpsjonslengde), korrelerer med polymerkonturlengden51,må være betydelig lengre enn noen vedhefttopp på grunn av uspesifikk vedheft av AFM cantilever-spissen til den underliggende overflaten (her rundt 200 nm). Funksjoner som vises utelukkende i en enkelt kraftforlengelseskurve, bør ikke tolkes. I de presenterte eksperimentene viste minst 80 av 100 kurver et platå som varer lenger enn 200 nm i minst to kraftkart på to forskjellige steder på overflaten. Videre avslører fordelingen av desorpsjonslengder, ved hjelp av scatter-plott som gitt i figur 5B og 5D,om og hvor mange polymerer som er bundet til AFM cantilever-spissen. I tilfelle av PS fungerte en smal fordeling av desorpsjonskraft og lengde tatt fra platåer av kraftforlengelseskurvene som bevis på et vellykket kovalent vedlegg. Dette viste endelig suksessen til funksjonaliseringsprotokollen. Dermed anbefaler vi på det sterkeste å presentere slike kraft- og lengdefordelinger i publikasjoner.

Evaluering av kraftutvidelseskurver ved hjelp av innebygde algoritmer som utgjør mange forhåndsinnstilte parametere, bør gjøres med forsiktighet. Årsakene er for eksempel at en fast samplingsfrekvens ikke passer for hver brukt trekkhastighet, eller at en automatisert utjevning av kraftforlengelseskurvene kan gjennomsnittlig ut viktige detaljer. Vanligvis kan en riktig forståelse av den respektive evalueringsprosedyren forhindre feil i evalueringsprosedyren, noe som igjen kan påvirke de endelige funnene fra et AFM-basert SMFS-eksperiment sterkt.

Oppsummert presenterer vi en funksjonaliseringsprotokoll som er pålitelig og lett kan brukes på en rekke polymerer. Videre presenteres riktig evaluering av enkeltmolekylkraftforlengelseskurver, noe som tillater bestemmelse av fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde. De presenterte protokollene og prosedyrene er verdifulle for undersøkelse av stimuli-responsive systemer på enkeltmolekylnivå.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

B.N.B. og T.H. anerkjenner finansiering av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellence strategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, og gi HU 997/1-13 (prosjekt # 420798410). M.G. anerkjenner delvis støtte i rammen av LOEWE Project iNAPO av Hessen State Ministry of Higher Education, Research and the Arts. Vi takker Dr. Wolfgang Bronner og Dr. Agne Zukauskaite fra Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF for donasjon av høy kvalitets gullbelagte silisiumwafers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA - AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany - Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA - Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany - Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany - PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Tags

Kjemi Utgave 157 enkeltmolekyl kraftspektroskopi atomkraftmikroskop vedhemelse funksjonalisering PEGylation
Kovalent vedlegg av enkeltmolekyler for AFM-basert Force Spectroscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T.,… More

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter