Biology

पोर्टेबल क्यूपीसीआर सिस्टम का उपयोग करके मैट्रिकिया चामोमिला की फील्ड पहचान

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/60940

Zhengxiu Yang¹, Zheng Quan², Tiffany Chua³, Leo Li¹, Yanjun Zhang³, Silva Babajanian², Francesco Buongiorno⁴, Isabella Della Noce⁴, Lorenzo Colombo⁴, Steven Newmaster⁵, Tricia Chua³, Peter Chang³, Gary Swanson³, Zhengfei Lu²

¹Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., ²Corporate Quality Laboratory, Herbalife International of America, Inc., ³Corporate Quality, Herbalife International of America, Inc., ⁴Hyris Ltd, ⁵Natural Health Product Research Alliance, University of Guelph

Summary

यहां प्रस्तुत एक पोर्टेबल क्यूपीसीआर प्रणाली का उपयोग कर मैट्रिकिया कैमोमिला की क्षेत्र पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल है । यह आसान करने के लिए प्रदर्शन प्रोटोकॉल स्थानों पर एक वनस्पति प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने के लिए एक विधि के रूप में आदर्श है, जहां प्रयोगशाला उपकरण और विशेषज्ञता के लिए उपयोग सीमित है, जैसे खेतों और गोदामों के रूप में ।

Abstract

वनस्पति उत्पादों में गुणवत्ता नियंत्रण कच्चे माल की आपूर्ति के साथ शुरू होता है। परंपरागत रूप से, वनस्पति पहचान रूपात्मक मूल्यांकन और रासायनिक विश्लेषणात्मक तरीकों के माध्यम से की जाती है। हालांकि, वनस्पति विज्ञानियों की उपलब्धता की कमी, विशेष रूप से हाल के वर्षों में, उपभोक्ता मांग और जलवायु परिवर्तन में वृद्धि करके लाई गई आपूर्ति श्रृंखला पर तनाव का मुकाबला करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण बढ़ाने की आवश्यकता के साथ मिलकर वैकल्पिक दृष्टिकोण की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य क्षेत्र पर या किसी भी सेटिंग में पोर्टेबल क्यूपीसीआर प्रणाली का उपयोग करके वनस्पति प्रजातियों की पहचान की सुविधा प्रदान करना है, जहां प्रयोगशाला उपकरणों और विशेषज्ञता तक पहुंच सीमित है। लक्ष्य डीएनए डाई आधारित qPCR का उपयोग कर परिलक्षित होता है, डीएनए के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत वनस्पति संदर्भ सामग्री से निकाला । लक्ष्य डीएनए की पहचान इसके विशिष्ट प्रवर्धन और सकारात्मक नियंत्रण के खिलाफ इसके पिघलने वाले शिखर से होती है । कदम और मापदंडों का एक विस्तृत विवरण, हाथ पर क्षेत्र नमूना संग्रह से, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर प्रवर्धन, डेटा व्याख्या के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया गया है कि पाठकों को इस प्रोटोकॉल को दोहराने कर सकते हैं । परिणाम पारंपरिक प्रयोगशाला वनस्पति पहचान विधियों के साथ संरेखित उत्पादित। प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आसान है और लागत प्रभावी है, कच्चे माल पर गुणवत्ता परीक्षण को सक्षम करने के रूप में संभव के रूप में आपूर्ति श्रृंखला की उत्पत्ति के बिंदु के करीब ।

Introduction

स्वास्थ्य को बनाए रखने और बेहतर बनाने के लिए वनस्पति विज्ञान का उपयोग करने का अभ्यास हजारों साल पहले की तारीखें हैं। उपभोक्ता मांग में वृद्धि , अधारणीय कटाई पद्धतियों और^{जलवायु}परिवर्तन²द्वारा लाई गई आपूर्ति श्रृंखला पर जोर देने के कारण वनस्पति में मिलावट खाद्य और आहार पूरक^{उद्योग}में बढ़ती चिंता बनती जा रही है । अघोषित या गलत पहचान वाली वनस्पति प्रजातियों की उपस्थिति से प्रभावकारिता, या यहां तक कि सुरक्षा के मुद्दे भी कम हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, प्रीमेंस्ट्रुअल असुविधा के इलाज के लिए उपयोग किए जाने वाले काले कोहोश(एक्टेए रेसमोसा)को कम कीमत वाली एशियाई प्रजातियों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जिसकी प्रभावकारिता⁴के लिए सीमित नैदानिक डेटा समर्थन है। एक अधिक गंभीर मामले में, चीनी जड़ी बूटियों का उपयोग करके वजन घटाने के लिए एक नैदानिक अध्ययन में स्टीफनिया टेरेंड्रा के लिए अरिस्टोलोचिया फेंगची के^{प्रतिस्थापन}ने कुछ प्रतिभागियों^{5, 6}^,में गंभीर नेफ्रोटॉक्सिकिटी और गुर्दे की विफलता का नेतृत्व किया। दो विभिन्न प्रजातियों ने एक चीनी आम नाम "फेंग जी" साझा किया । ये मामले अधिक कठोर गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता को उजागर करते हैं, जो कच्चे माल की पहचान के साथ शुरू होता^है,अधिमानतः आपूर्ति श्रृंखला की उत्पत्ति के बिंदु के करीब संभव हो, इसलिए संसाधनों को कुशलतापूर्वक सही पहचान की सामग्री के लिए आवंटित किया जा सकता है ।

वनस्पति पहचान के लिए कई ऑर्थोगोनल दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। परंपरागत रूप से, वनस्पति पहचान रूपात्मक मूल्यांकन^{8, 9}और रासायनिक विश्लेषणात्मक तरीकों^{10, 11,}^,⁹ ^12,^,^,¹³के माध्यम से की जाती है।^,¹² यदि अंतर मौजूद है तो नीरस पहचान पौधों की सामग्रियों की स्थूल और सूक्ष्म विशेषताओं में अंतर पर आधारित है। हालांकि, हाल के वर्षों में शास्त्रीय वनस्पति विज्ञान पर प्रशिक्षण कार्यक्रमों की कमी के परिणामस्वरूप विशेषज्ञों की कमी हुई है^14,जिससे यह दृष्टिकोण नियमित गुणवत्ता नियंत्रण के लिए अव्यावहारिक हो गया है। पाउडर वनस्पति सामग्री में इसका आवेदन भी सीमित है। फार्माकोपोईस और प्रयोगशालाओं में रासायनिक विश्लेषणात्मक विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमेटोग्राफी (एचपीटीएलसी), उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी), और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर)(अंक 2)और पर्यावरण आवश्यकताओं जैसे उपकरणों के आकार के कारण क्षेत्र परीक्षण के लिए आदर्श नहीं हैं। हाल ही में, जीनोमिक तरीके वनस्पति प्रजातियों के प्रमाणीकरण और प्रतिस्थापन का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में उभरे हैं और कुशल और सटीक साबित हुए हैं । जीनोमिक तरीके पौधों की सामग्री^{15 , 16 , 17},^,18^,^,¹⁹में आनुवंशिक सूचनाओं की उच्च निष्ठा और विशिष्टता का दोहन^करतेहैं ।^,¹⁶¹⁷ आणविक नैदानिक उपकरण पोर्टेबल उपकरणों के रूप में उपलब्ध हैं, और अक्सर स्वचालित डेटा व्याख्या उपकरण शामिल होते हैं जो प्रौद्योगिकी उपयोग की बाधा को कम करते हैं, जिससे यह दृष्टिकोण क्षेत्र पहचान^{20, 21,}^22,^,^,^23,^,²⁴^,के लिए आदर्श^{बनाता}है। एक बार आणविक विश्लेषण विधि डिजाइन और^25,^{26, 27}मान्य किया गया^है,यह^{बुनियादी}आणविक जीव विज्ञान प्रशिक्षण के साथ किसी भी कर्मियों द्वारा किया जा सकता है ।^, उपलब्ध विभिन्न पोर्टेबल उपकरणों में से, डीएनए दृश्यों पर वास्तविक समय पीसीआर लागत प्रभावी विकल्पों में से एक है²⁸। एक पोर्टेबल डिवाइस का संयोजन, अनुकूलित और मान्य आणविक विश्लेषण के साथ, प्रयोगशाला के बाहर वनस्पति प्रजातियों और अवयवों के सत्यापन की अनुमति देता है, जैसे खेतों और वनस्पति सामग्री गोदामों में, पारंपरिक तरीकों से जुड़े समय और लागत को कम करता है।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उन स्थितियों में वनस्पति पहचान के लिए एक विधि पेश करना है जहां पोर्टेबल क्यूपीसीआर प्रणाली का उपयोग करके प्रयोगशाला उपकरणों और विशेषज्ञता तक पहुंच सीमित या अनुपलब्ध है। इस विधि का प्रदर्शन मैट्रिका कैमोमिला (चित्रा 3 ए)के क्षेत्र में किया जाता है, जिसे आमतौर पर जर्मन कैमोमाइल के नाम से जाना जाता है, जो इसके विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सीडेंट गुणों²⁹के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह समान उपस्थिति या गंध की संबंधित प्रजातियों के साथ भ्रमित किया जा सकता है, विशेष रूप से जेनेरा चमेमलम, तानेटम,और गुलदाउदी^30,^31,^,³²से।^, संबंधित प्रजातियों में, चामेमेलम नोबिल,जिसे रोमन कैमोमाइल के नाम से भी जाना जाता है, वाणिज्य में तुलनीय उत्पादन स्तर(चित्रा 3B)के साथ एक उल्लेखनीय है। प्रदर्शित विधि को न केवल लक्षित वनस्पति प्रजातियों एम चामोमिलाकी पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, बल्कि डीएनए दृश्यों के विशिष्ट प्रवर्धन के आधार पर इसके करीबी रिश्तेदार, सी नोबिलका भी पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया था।

यह लेख विस्तार से बताता है कि इंटरकैलिटिंग डाई-आधारित क्यूपीसीआर का उपयोग करके एम चामोमिला की फील्ड बॉटनिकल पहचान कैसे करें और पोर्टेबल डिवाइस पर कर्व विश्लेषण पिघलाएं। प्रोटोकॉल में क्षेत्र से वनस्पति नमूनों का संग्रह, साइट पर डीएनए निष्कर्षण, और वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थापना शामिल है । एक वैध निष्कर्ष सुनिश्चित करने के लिए, लक्षित वनस्पति एम चामोमिला और गैर-लक्षित वनस्पति सी नोबिल जीनोमिक डीएनए, प्रमाणित वनस्पति संदर्भ सामग्रियों से पूर्व-निकाले गए, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। इस विधि की विशिष्टता का प्रदर्शन एम चामोमिला और सी नोबिल पहचान परीक्षणों दोनों को नमूनों और नियंत्रणों पर व्यक्तिगत रूप से करके किया जाता है। गैर-टेम्पलेट नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग पीसीआर संदूषण के कारण झूठे सकारात्मक परिणामों को बाहर करने के लिए किया जाता है।

Protocol

1. नमूना संग्रह

एक सपाट और क्षैतिज सतह के साथ क्षेत्र में एक परीक्षण क्षेत्र स्थापित करें।
एक प्रतिनिधि पौधे की पहचान करें जो कैमोमाइल फूल क्षेत्र(चित्र 4)में अधिकांश पौधों की विशेषताओं को दर्शाता है।
बाँझ दस्ताने का उपयोग कर प्रतिनिधि संयंत्र से एक फूल सिर उठाओ।
नमूना को 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें।
चरण 1.3 से 1.4 तक दोहराएं और एक ही पौधे से एक पत्रक (लगभग 0.5-0.7 सेमी लंबा) एकत्र करें।
नोट: एम चामोमिला फूल और पत्ती 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब के नीचे बैठने के लिए काफी छोटे हैं। बड़ी सतह क्षेत्र के साथ अन्य वनस्पति विज्ञानियों के लिए, एक कागज पंच या कैंची (उपयोग से पहले 70% इथेनॉल में कुल्ला) परीक्षण के लिए ऊतक के नमूनों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जब कई नमूने की आवश्यकता होती है, तो विभिन्न नमूनों की हैंडलिंग के बीच पेपर पंच या कैंची कुल्लाएं।

2. डीएनए निष्कर्षण

ड्राई बाथ इनक्यूबेटर को 95 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
प्रत्येक संग्रह ट्यूब के लिए, संयंत्र डीएनए निष्कर्षण किट (सामग्रीकी तालिका में सूचीबद्ध) से निष्कर्षण समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। बेहतर डीएनए निष्कर्षण दक्षता के लिए, ऊतक मूसल का उपयोग करके निष्कर्षण समाधान में ऊतक नमूने को पीसें।
ट्यूब बंद करो। सुनिश्चित करें कि वनस्पति ऊतक निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान निष्कर्षण समाधान के साथ कवर किया जाता है।
संग्रह ट्यूबों को पहले से गरम सूखे स्नान इनक्यूबेटर में रखें और संग्रह ट्यूबों को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
10 मिनट के बाद, ट्यूबों को सूखे स्नान इनक्यूबेटर से बाहर निकालें।
एक ही डीएनए निष्कर्षण किट से कमजोर पड़ने के समाधान के 100 μL जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा समाधान मिश्रण।
पर्चा निकालने के लिए एक ही कदम दोहराएं।
समाधान को और मिलाने के लिए हिलाएं। आमतौर पर इस उपचार के बाद पौधे के ऊतक अपमानित नहीं होते हैं। तरल रंग बदल सकता है और बादल बन सकते हैं।
नोट: पतला समाधान कमरे के तापमान पर रात भर संग्रहीत किया जा सकता है अगर तुरंत आगे नहीं बढ़ रहा है । भंडारण से पहले पौधे के ऊतकों से सेलुलर मलबे को हटाना आवश्यक नहीं है। ट्यूबों में तरल डाउनस्ट्रीम पीसीआर प्रवर्धन के लिए डीएनए टेम्पलेट्स रखता है।

3. पीसीआर रिएक्शन सेटअप

निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार क्यूपीसीआर उपकरण थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों को कॉन्फ़िगर करें। (तालिका1)में सूचीबद्ध पीसीआर थर्मोसाइक्लिंग प्रोफाइल लागू करें, जो प्रारंभिक विकृति के लिए एक निरंतर तापमान चरण के साथ शुरू होता है, इसके बाद प्रवर्धन के 25 चक्र, और एक उच्च-संकल्प पिघलने वाले वक्र प्राप्त करने के लिए तापमान रैम्पिंग के साथ समाप्त होता है।
उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स और प्राइमर(टेबल 2)को पिघलाएं।
प्रत्येक कुएं में लोड की जाने वाली प्रतिक्रिया की योजना बनाएं: लक्ष्य प्रजातियों के साथ सकारात्मक नियंत्रण वाले कुओं, गैर-लक्षित प्रजातियों, नमूनों और नकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 5)के साथ सकारात्मक नियंत्रण।
1. इस उदाहरण में, दस कुओं का उपयोग किया जाता है - जर्मन कैमोमाइल पहचान परीक्षण के लिए पांच और रोमन कैमोमाइल पहचान परीक्षण के लिए शेष पांच। प्रजातियों की पहचान परीक्षण के प्रत्येक प्रकार के लिए, एक अच्छी तरह से लक्षित प्रजातियों के संदर्भ सामग्री से निकाले गए डीएनए के साथ सकारात्मक नियंत्रण होता है, एक अच्छी तरह से गैर लक्षित प्रजातियों के संदर्भ सामग्री से निकाले गए डीएनए के साथ सकारात्मक नियंत्रण होता है, दो कुओं फूल और पत्ती डीएनए क्षेत्र से निकाले गए नमूनों से भर रहे हैं, और एक अच्छी तरह से एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए आवंटित किया जाता है । तालिका 3 प्रत्येक अच्छी प्रकार का वर्णन करता है।
प्रत्येक वनस्पति प्रजाति पहचान परीक्षण के लिए मैनुअल के अनुसार एक प्रतिक्रिया मास्टर-मिश्रण तैयार करें। एक विशिष्ट प्रतिक्रिया मास्टर-मिक्स में सार्वभौमिक क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (2x), फॉरवर्ड और रिवर्स प्रजातियों-विशिष्ट प्राइमर और नाभिक मुक्त पानी शामिल हैं। तालिका 4 प्रतिक्रिया प्रणाली संरचना को सूचीबद्ध करता है।
नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं कर रहे हैं, तो क्यूपीसीआर रिएक्शन मास्टर-मिक्स को कूलर या मिनी फ्रिज में +2 डिग्री सेल्सियस से +8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
उपयोग से पहले पिपिंग द्वारा प्रतिक्रिया मास्टर-मिक्स को अच्छी तरह से मिलाएं।
क्यूपीसीआर कारतूस को एक फ्लैट और स्थिर सतह पर आमने-सामने रखें।
3.3 चरण में परिभाषित कुओं के अनुसार कारतूस के कुओं में 3.4 चरण में कॉन्फ़िगर किए गए रिएक्शन मास्टर-मिक्स के 18 माइक्रोन लोड करें। इस प्रदर्शन के लिए, जीसी परीक्षण (कुओं में जीसीटी 1, 3, 5, 7, 9) और रोमन कैमोमाइल पहचान परीक्षण प्रतिक्रिया मास्टर-मिक्स के लिए लेबल किए गए कुओं में जर्मन कैमोमाइल पहचान परीक्षण प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण जोड़ें (वेल्स 2, 4, 6, 8, 10 में आरसीटी) (चित्रा 5देखें)।
डीएनए निष्कर्षण ट्यूबों के सुपरनैंट से नमूना डीएनए के 2 माइक्रोन ट्रांसफर और पूर्व से निकाले गए डीएनए सकारात्मक नियंत्रण को क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के साथ प्रीलोडेड कारतूस कुओं में। क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण में प्रत्येक डीएनए टेम्पलेट को जोड़ने के बाद, धीरे-धीरे समाधान को पिपिंग करके मिलाएं।
नोट: डीएनए निष्कर्षण ट्यूब से डीएनए स्थानांतरित करते समय फ्लोटिंग सेलुलर मलबे से बचें। यदि आवश्यक हो तो सुपरनेट और सेलुलर मलबे को अलग करने के लिए मिनीसेंट्रफ्यूज का उपयोग करें।
चिपकने वाली फिल्म के साथ कारतूस को सावधानी से सील करें। थर्मोसाइक्लिंग कक्ष पर कारतूस लोड करें और इसे बंद करें।
क्यूपीसीआर इंस्ट्रूमेंट को चलाने के लिए सेट करें।

Representative Results

धारा 1 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, फूल सिर और पत्ती से वनस्पति डीएनए 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह ट्यूब के इनक्यूबेशन गर्मी के बाद सुपरनेट में निकाला गया। वर्तमान अध्ययन में, सुपरनैंट ने फूल और पत्ती दोनों के लिए पीले और हरे रंग का रंग दिखाया, जो यह दर्शाता है कि विभिन्न प्रकार के प्राकृतिक यौगिकों को वनस्पति डीएनए(चित्रा 6)के साथ सुपरनैंट में जारी किया गया था। यद्यपि सभी क्षेत्र निकाले गए डीएनए टेम्पलेट के लिए ट्रिपलीकेट में बाद में विश्वसनीय पीसीआर प्रवर्धन हासिल किया गया था, लेकिन संदर्भ के रूप में प्रयोगशाला में डीएनए गुणवत्ता मूल्यांकन किया गया था। फ्लोरोमेट्री द्वारा निर्धारित फूल सिर डीएनए निकालने की एकाग्रता 3.69-5.36 एनजी/μL से लेकर, जबकि पत्ती डीएनए निकालने की एकाग्रता 6.42-9.29 एनजी/μL से लेकर । एक_{२६०/एक}_२८० और एक_{२६०/फूल}और पत्ती डीएनए अर्क के एक_२३० अवशोषण अनुपात स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा गया । हालांकि, डीएनए और फाइटोकेमिकल यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रम के बीच ओवरलैप के कारण, इन अनुपातों को विश्वसनीयता मापा नहीं जा सका (डेटा नहीं दिखाया गया)।

वास्तविक समय में लक्ष्य टुकड़ों के प्रवर्धन की निगरानी के लिए इंटरकैल्टिंग फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग किया गया था। चूंकि दोनों विशिष्ट प्राइमर एम कैमोमिला और सी नोबिल आंतरिक लिखित स्पेसर 2 (ITS2) क्षेत्र को लक्षित करते हैं, जिसमें पौधे जीनोम में सैकड़ों प्रतियां होती हैं, 25 पीसीआर प्रवर्धन चक्र कैमोमाइल प्रजातियों की पहचान के लिए पर्याप्त एम्प्लिकॉन उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं। चित्रा 7में, एम चामोमिला पहचान परीक्षण में एम चामोमिला सकारात्मक नियंत्रण के लिए सीटी मूल्य 25 (GCP_GCT) से कम था, जबकि 25 प्रवर्धन चक्रों के बाद, सी नोबिल पहचान परीक्षण में एक ही नियंत्रण का फ्लोरेसेस डिटेक्शन दहलीज (GCP_RCT) से नीचे था। दूसरी ओर, 25 चक्रों के बाद, एम चामोमिला पहचान परीक्षण में सी नोबिल पॉजिटिव कंट्रोल के लिए फ्लोरेसेंस डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड (RCP_GCT) से नीचे था, जबकि सी नोबिल आइडेंटिफिकेशन टेस्ट में एक ही कंट्रोल के लिए सीटी वैल्यू 25 (RCP_RCT) से कम थी । अपने संबंधित परख में लक्ष्य और गैर-लक्ष्य सकारात्मक नियंत्रणों का प्रवर्धन एम चामोमिला पहचान परख की विशिष्टता को प्रदर्शित करता है। नमूना डीएनए के लिए, फील्ड फ्लावर हेड और लीफ डीएनए निकालने से एम चामोमिला पहचान परीक्षण में क्रमशः 15.18 और 19.41 के सीटी मूल्य मिले (नमूना1 (फूल) _GCT और नमूना 2 (लीफ) _GCT)। इन नमूनों के दोनों सी nobile पहचान परीक्षण (Sample1 (फूल) _RCT और Sample2 (पत्ती) _RCT) में परिलक्षित नहीं थे । दोनों नमूनों के प्रवर्धन पैटर्न एम चामोमिला सकारात्मक नियंत्रण के प्रवर्धन पैटर्न से मेल खाते हैं । पीसीआर संदूषण के कारण झूठी सकारात्मकता की संभावना को छोड़कर, एम चामोमिला और सी नोबिल पहचान परीक्षणों (NC_GCT और NC_RCT) दोनों में नकारात्मक नियंत्रण परिलक्षित नहीं हुए थे। सकारात्मक नियंत्रण और नमूनों में विशिष्ट प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक कुएं से पीसीआर अंत उत्पाद के अंश प्रयोगशाला(चित्रा 8)में 2% एगर उठे जेल पर चलाए गए थे। एम चामोमिला पहचान परीक्षण के लिए, दोनों क्षेत्र के नमूनों में एम चामोमिला सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही स्थिति में चल रहे एम्प्लिकोन्स मिले, जिसका अनुमानित आकार १०० बीपी (सैद्धांतिक आकार १०२ बीपी) से थोड़ा ऊपर है । सी नोबिल पहचान परीक्षण के लिए, गैर-लक्षित प्रजाति सी नोबिल पॉजिटिव कंट्रोल से ५० और १०० बीपी के बीच एक बैंड मिला, जो ६५ बीपी के सैद्धांतिक आकार को फिट कर रहा था । बाकी गलियों में कोई विशिष्ट प्रवर्धन उत्पाद नहीं दिखाया गया, जो इन कुओं के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल के अभाव से सहमत था, जैसा कि क्षेत्र परीक्षण में देखा गया था ।

पीसीआर प्रवर्धन के बाद, हीटिंग के दौरान डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) की वियोजन विशेषताओं का आकलन करने के लिए एक पिघलने वक्र विश्लेषण किया गया था। के रूप में तापमान पिघल वक्र विश्लेषण के लिए अंतिम चक्र के दौरान ramped, तापमान में वृद्धि के कारण डबल स्ट्रैंड एम्प्लिकॉन अलग करने के लिए । इंटरकैलेटिंग फ्लोरोसेंट डाई को धीरे-धीरे समाधान में जारी किया गया, फ्लोरेसेंस तीव्रता(चित्रा 9 ए)कम हो गई। पहले व्युत्पन्न वक्र के मोड़ बिंदु का उपयोग पिघलने वाले तापमान(टीएम) (चित्रा 9B)को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जो मुख्य रूप से डीएनए टुकड़ा लंबाई और जीसी सामग्री पर निर्भर करता है। पिघलने के तापमान के साथ सीटी मूल्य का संयोजन क्यूपीसीआर विश्लेषण की विशिष्टता को बढ़ा सकता है। वर्तमान अध्ययन में एम चामोमिला पॉजिटिव कंट्रोल पीसीआर एम्प्लिकॉन का पिघलता तापमान पीक 85.6 डिग्री सेल्सियस (GCP_GCT) पर हुआ और यह सी नोबिल पॉजिटिव कंट्रोल पीसीआर एम्प्लिकॉन के पिघलने के तापमान पीक से 79.1 डिग्री सेल्सियस (RCP_RCT) पर अलग था। फील्ड फ्लावर हेड और लीफ से पीसीआर एम्प्लिकॉन ने क्रमशः 85.2 डिग्री सेल्सियस और 84.8 डिग्री सेल्सियस पर पिघलने का तापमान चोटियों का उत्पादन किया (नमूना 1 (फूल) _GCT और नमूना 2 (लीफ) _GCT)) । पोर्टेबल क्यूपीसीआर प्रणाली द्वारा मापा गया पिघलने वाले तापमान विविधताओं का आकलन करने के लिए, अतिरिक्त डेटापॉइंट इस बात की पुष्टि करने के लिए एकत्र किए गए थे कि नमूना पिघलने का तापमान हमेशा एम चामोमिला सकारात्मक नियंत्रण (2 डिग्री सेल्सियस के भीतर) से प्राप्त पिघलने वाले तापमान के करीब था और सी नोबिल सकारात्मक नियंत्रण एम्प्लिकॉन(चित्रा 10)के पिघलने के तापमान से बहुत दूर थे। पिघलते तापमान चोटियों कई बार अन्य कुओं में सूचित किया गया । हालांकि, उनके सीटी मान 25 से कम नहीं थे और पिघलने वाले तापमान की चोटियां एम चामोमिला या सी नोबिल पॉजिटिव कंट्रोल (2 डिग्री सेल्सियस से अधिक अलग) के करीब नहीं थीं ।

संक्षेप में, फील्ड एम चामोमिला पहचान परीक्षण तालिका 5में संक्षेप में निर्णय नियमों के आधार पर व्याख्या की जा सकती है । ख्यात वनस्पति प्रजातियों के लिए सकारात्मक परीक्षण सभी सकारात्मक नियंत्रण के साथ, अन्य प्रजातियों के लिए नकारात्मक, और नकारात्मक परीक्षण नकारात्मक नियंत्रण, दोनों क्षेत्र के नमूनों को एम chamomilla लेकिन सी nobileनहीं शामिल करने के लिए निर्धारित किया गया । इसके अलावा, अन्य विश्लेषणात्मक तकनीकों के साथ क्षेत्र परीक्षण परिणामों को संरेखित करने के लिए, क्षेत्र के निष्कर्षों को पहले से मान्य डीएनए बार्कोडिंग विधि²⁵ (डेटा नहीं दिखाए गए) द्वारा पुष्टि की गई थी।

चित्र 1: वनस्पति सामग्री की रूपात्मक पहचान। (A) हिबिस्कस रोजा-सिनेन्सिस फूल, करक्यूमा लोंगा जड़ें, मालवा सिल्वेस्ट्रिस पत्तियां, रोसारिनस ऑफिसिनालिस पत्तियां, कोरिनड्रम साटिवियम बीज, जिंजिबर डिसिनेल जड़ें । (ख) पेट्रोसेलिनम क्रिस्पम और एपियम ग्रेवोलेंस गुच्छे में अंतर करना मुश्किल है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2: वनस्पति सामग्री की रासायनिक पहचान। (ए)एचपीटीएलसी इंस्ट्रूमेंट और एक प्रतिनिधि एचपीटीएलसी क्रोमेटोग्राम । (ख)एचपीएलसी इंस्ट्रूमेंट और एक प्रतिनिधि एचपीएलसी क्रोमेटोग्राम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 3: खेत में मैट्रिकया चमोमिला और चमेमलम नोबिल। (A) मैट्रिकिया चमोमिला, सीसी बाय-एसए 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg के तहत विकिपीडिया से अनुकूलित। (ख) Chamaemelum नोबिल, सीसी BY-SA ३.०, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG के तहत विकिपीडिया से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4: खेत से एम चामोमिला पौधे के हिस्सों को इकट्ठा करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 5: प्रदर्शन में परीक्षण कुओं का लेआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 6: संग्रह ट्यूबों में फील्ड डीएनए निकालने। वनस्पति ऊतक मूल ट्यूब में रहता है और पीले रंग के डीएनए निकालने से ढका हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 7: फ्लोरेसेंस प्लॉट थर्मोसाइक्लिंग के 25 चक्रों पर पीसीआर उत्पादों के संचय को दिखाता है। एम चामोमिला पॉजिटिव कंट्रोल और सी नोबिल पॉजिटिव कंट्रोल शो सीटी वैल्यूज क्रमशः एम चामोमिला और सी नोबिल आइडेंटिफिकेशन टेस्ट में 25 से कम । क्षेत्र के फूल और पत्ती के नमूनों को एम चामोमिला पहचान परीक्षण द्वारा 15.18 और 19.41 के सीटी मूल्यों के साथ परिलक्षित किया गया था। बाकी कुएं परिलक्षित नहीं हुए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 8: फील्ड पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 9: पिघलते तापमान विश्लेषण। (क)प्रत्येक कुएं में फ्लोरेसेंस सिग्नल बढ़ते तापमान के साथ कम हो जाता है । (ख)गलन वक्र विश्लेषण में पिघलते तापमान पीक से पीसीआर उत्पादों की पहचान की पुष्टि हुई । खेत फूल और पत्ती के नमूने 85.2 डिग्री सेल्सियस और 84.8 डिग्री सेल्सियस पर चोटियों दिखाते हैं। ये एम चामोमिला पॉजिटिव कंट्रोल द्वारा उत्पादित चोटी के करीब हैं। सी नोबिल पॉजिटिव कंट्रोल ने 79.1 डिग्री सेल्सियस पर चोटी का उत्पादन किया, जो अन्य तीन नमूनों से अलग है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 10: सकारात्मक नियंत्रण और क्षेत्र के नमूनों के बीच पिघलते तापमान पीक भिन्नता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मंच	चक्र	तापमान	समय
लगातार तापमान	1	95 डिग्री सेल्सियस	60 के दशक
प्रवर्धन	25	95 डिग्री सेल्सियस	30
प्रवर्धन	25	60 डिग्री सेल्सियस	30
पिघलने वक्र	1	60 डिग्री सेल्सियस	रैंप 0.05 डिग्री सेल्सियस/
पिघलने वक्र	1	95 डिग्री सेल्सियस	रैंप 0.05 डिग्री सेल्सियस/

तालिका 1: एम चामोमिला और सी नोबिल पहचान परीक्षणों के लिए क्यूपीसीआर थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति।

जाँच	प्राइमर नाम	अनुक्रम 5'-3'	स्थिति	क्षेत्र	एम्प्लिकॉन आकार
मैट्रिकया रिकुटा	ZL3	टीसीजीटीसीजीटीसीजीएजीएजी	आगे	आईटीएस2	102 बीपी
	ZL4	TAAACTCAGGGTAGTAGTCCC	उल्टा
चामेमेमलम नोबिल	ZL11	टीजीटीसीजीसीएसीजीटीजीजीजीजीजीगागगागगागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागागा	आगे	आईटीएस2	65 बीपी
	ZL12	TCGAAGCGTCATCCTAAGAAC	उल्टा

तालिका 2: एम चामोमिला और सी नोबिल पहचान परीक्षणों के लिए प्राइमर जोड़े।

अच्छी स्थिति	खैर नाम	विवरण
1	GC_PosCtrl_GC_Test	जीसी टेस्ट के तहत जर्मन कैमोमाइल सकारात्मक नियंत्रण
2	GC_PosCtrl_RC_Test	आर सी टेस्ट के तहत जर्मन कैमोमाइल सकारात्मक नियंत्रण
3	RC_PosCtrl_GC_Test	जीसी टेस्ट के तहत रोमन कैमोमाइल सकारात्मक नियंत्रण
4	RC_PosCtrl_RC_Test	रोमन कैमोमाइल आर सी टेस्ट के तहत सकारात्मक नियंत्रण
5	Field_Sample_GC_Test	जीसी टेस्ट के तहत पत्ती के ऊतकों का नमूना
6	Field_Sample_RC_Test	आरसी टेस्ट के तहत पत्ती के ऊतकों का नमूना
7	Field_Sample_GC_Test	जीसी टेस्ट के तहत फूलों के ऊतकों का नमूना
8	Field_Sample_RC_Test	आरसी टेस्ट के तहत फूलों के ऊतकों का नमूना
9	NegCtrl_GC_Test	जीसी टेस्ट के तहत नकारात्मक नियंत्रण नमूना
10	NegCtrl_RC_Test	आरसी टेस्ट के तहत निगेटिव कंट्रोल सैंपल

तालिका 3: एम चामोमिला और सी नोबिल पहचान परीक्षणों के लिए अच्छी तरह से प्रकार और विवरण।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ)	GC_Test	RC_Test
यूनिवर्सल क्यूपीसीआर मिक्स *	10 माइक्रोल	10 माइक्रोल
ZL3 प्राइमर (10 माइक्रोन)	0.4 माइक्रोन	ना
ZL4 प्राइमर (10 माइक्रोन)	0.4 माइक्रोन	ना
ZL11 प्राइमर (10 माइक्रोन)	ना	0.4 माइक्रोन
ZL12 प्राइमर (10 माइक्रोन)	ना	0.4 माइक्रोन
एच₂ओ (नाभिक मुक्त)	7.2 माइक्रोल	7.2 माइक्रोल
* हॉट स्टार्ट टैक डीएनए पॉलीमरेज शामिल है

तालिका 4: एम चामोमिला और सी नोबिल पहचान परीक्षणों के लिए मास्टर-मिक्स संरचना।

खैर नाम	अपेक्षित परिणाम	सकारात्मक परिणाम मानदंड	नकारात्मक परिणाम मानदंड
खैर नाम	अपेक्षित परिणाम	पता चला/वर्तमान	पता नहीं चला/अनुपस्थित
GC_PosCtrl_GC_Test	पाया	सीटी एंड एलटी; 25 और 84 <= टीएम <= 86	-
GC_PosCtrl_RC_Test	पता नहीं चला	-	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
RC_PosCtrl_GC_Test	पता नहीं चला	-	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
RC_PosCtrl_RC_Test	पाया	सीटी एंड एलटी; 25 और 79 <= टीएम <= 81	-
Field_Sample_Leaf_GC_Test	वर्तमान	सीटी एंड एलटी; 25 और 84 <= टीएम <= 86	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
Field_Sample_Leaf_RC_Test	अनुपस्थित	-	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
Field_Sample_Flower_GC_Test	वर्तमान	सीटी एंड एलटी; 25 और 84 <= टीएम <= 86	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
Field_Sample_Flower_RC_Test	अनुपस्थित	-	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
NegCtrl_GC_Test	पता नहीं चला	-	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं
NegCtrl_RC_Test	पता नहीं चला	-	25 चक्रों के भीतर कोई सीटी मूल्य नहीं

तालिका 5: क्यूपीसीआर परिणाम व्याख्या के लिए नियम।

Discussion

प्राइमर और टेम्पलेट चयन का डिजाइन एक कुशल और विशिष्ट क्यूपीसीआर प्रवर्धन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कदम हैं। एक उपयुक्त टेम्पलेट की पहचान करने के बाद, प्राइमर डिज़ाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग आमतौर पर प्राइमर लंबाई, पिघलने वाले तापमान और जीसी सामग्री^{33, 34}^,जैसे डिजाइन चर के आधार पर प्राइमर के चयन में सहायता करने के लिए किया^जाताहै। पीसीआर प्रतिक्रिया³⁵की विशिष्टता, संवेदनशीलता और मजबूती सुनिश्चित करने के लिए परख की अपेक्षित प्रायोगिक परिस्थितियों में अनुकूलन और सत्यापन किया जा सकता है। उप-इष्टतम प्राइमर डिजाइन के परिणामस्वरूप प्राइमर-डिमर गठन हो सकता है, जिसमें प्राइमर इंटरैक्शन गैर-विशिष्ट उत्पादों का उत्पादन करते हैं^36।

डीएनए संदूषण और प्राइमर-डाइमर्स की उपस्थिति के लिए इस अध्ययन जांच में उपयोग किए जाने वाले कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) परख को प्रभावित कर सकते हैं। परिणाम कोई प्रवर्धन, एक अच्छा संकेत है कि दोनों डीएनए संदूषण और प्राइमर-dimers एक चिंता का विषय नहीं है दिखाया । डीएनए संदूषण और प्राइमर-डाइमर कोई टेम्पलेट नियंत्रण के माध्यम से पिघल घटता में प्रकट होते हैं, और सकारात्मक नियंत्रण के पिघल घटता में अतिरिक्त चोटियों के रूप में । आमतौर पर, सकारात्मक नियंत्रण के पिघलने की वक्र में एक ही चोटी होने की उम्मीद है, जब तक कि टेम्पलेट में एटी-रिच सबडोमेन असमान पिघलने का कारण न बन जाएं। डबल चोटियों यूमेल्ट सॉफ्टवेयर³⁷का उपयोग कर पिघलने परख अनुकरण द्वारा भविष्यवाणी की जा सकती है। इस अध्ययन में एगरजिंग जेल पर पीसीआर प्रोडक्ट चलाने के गोल्ड स्टैंडर्ड का इस्तेमाल टारगेट पीसीआर प्रोडक्ट की मौजूदगी और संदूषण और प्राइमर-डाइमर न होने की पुष्टि के लिए किया गया।

वनस्पति सामग्री आणविक विश्लेषण में एक काफी चुनौती वनस्पति डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के बाद अच्छी गुणवत्ता वाले डीएनए प्राप्त कर रहा है । स्वास्थ्य लाभों से जुड़े सक्रिय रासायनिक यौगिकों के लिए वनस्पति सामग्रियों का कारोबार और उपभोग किया जाता है। डीएनए निष्कर्षण की प्रक्रिया में, इन रासायनिक यौगिकों को डीएनए निष्कर्षण समाधान में भी जारी किया जाएगा, जिससे पीसीआर अवरोध उत्पन्न होगा, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर प्रवर्धन में विफलताएं होंगी । वनस्पति विज्ञान से प्राप्त रासायनिक यौगिकों को दूर करने के लिए जैविक सॉल्वैंट्स और स्तंभों का उपयोग करते^हुएविभिन्न पौधे डीएनए शुद्धिकरण किट विकसित किए गए हैं । हालांकि, इन किटों की सहायता के लिए आवश्यक धुएं हुड और हाई-स्पीड अपकेंद्रित्र क्षेत्र में उपलब्ध नहीं हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, सरलीकृत डीएनए निष्कर्षण विधि एक वाणिज्यिक संयंत्र डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करता है (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। इसमें प्रजनन योग्य परिणामों के लिए सामान्य निरोधात्मक पदार्थों को बेअसर करने की क्षमता थी और एम चामोमिला और सी नोबिल के लिए लगातार परिणाम पेश किए गए थे। एम चामोमिला और सी नोबिल फूल दोनों सिर और पत्तियों विशिष्ट पिघल चोटियों के साथ पीसीआर एम्प्लिकोन मिले, यह दर्शाता है कि पीसीआर अवरोधकों की उपस्थिति चिंता का विषय नहीं था । पीसीआर अवरोधकों के उच्च स्तर वाले अन्य पौधों के लिए, उनके मूल निष्कर्षण में डीएनए को बढ़ाना कम कुशल हो सकता है। अवरोध को कम करने और प्रवर्धन दक्षता में सुधार करने के लिए, पूरे संयंत्र तक पहुंच के साथ, कम पॉलीसैकराइड और पॉलीफेनॉल सामग्री वाले अन्य पौधों के हिस्सों का उपयोग पहचान उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है। यदि विभिन्न पौधों के हिस्सों तक सीमित पहुंच है, तो फूलों के सिर से विच्छेदित छोटी पत्तियां या पंखुड़ियां, जिनमें आमतौर पर कम फेनोलिक सामग्री³⁹होती है, सफलता का बेहतर मौका प्रदान कर सकती है। चूंकि डीएनए दृश्य पूरे पौधे में सुसंगत होते हैं, इसलिए किसी भी पौधे के हिस्से का उपयोग प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। यदि पीसीआर प्रवर्धन अभी भी उप-क्षातिमल है, तो पीसीआर से पहले मूल डीएनए अर्क को और पतला किया जा सकता है, या अधिक परिष्कृत प्रयोगशाला शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है।

पीसीआर विश्लेषण के लिए एक और चुनौती डीएनए संदूषण के कारण झूठे सकारात्मक परिणाम हैं, जो डेटा व्याख्या को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं । यह आमतौर पर सक्रिय हाउसकीपिंग द्वारा नियंत्रित किया जाता है, समर्पित उपकरणों का उपयोग करके, और नामित क्षेत्रों में काम को प्रतिबंधित करता है। क्यूपीसीआर का उपयोग करके, सभी पीसीआर विश्लेषण को एक बंद प्रणाली में पूरा किया जा सकता है, जो एक ऐसे वातावरण में पीसीआर एम्प्लिकॉन संदूषण की संभावना को बहुत कम करता है जो अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं है। इसके अलावा, पर्यावरण डीएनए भी परख की विशिष्टता के कारण एक झूठी सकारात्मक नहीं दिखाना चाहिए, एक पिछले सत्यापन अध्ययन^४०के अनुसार ।

इसमें सुधार की गुंजाइश है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, वास्तविक समय में लक्ष्य खंड प्रवर्धन दिखाने के लिए इंटरकैल्टिंग डाई का उपयोग किया गया था। विधि की विशिष्टता को पिघलने के तापमान से और अधिक पुष्टि की जाती है, जो एम चामोमिला और सी नोबिल एम्प्लिकोन्स के बीच अलग है। इसलिए, इंटरकैल्टिंग डाई-आधारित पीसीआर कुशलतापूर्वक इस सवाल का जवाब दे सकती है कि क्षेत्र में यह पौधों की प्रजातियां क्या हैं? हालांकि, खेत से अलग एक ही पौधे पर वनस्पति पहचान प्रदर्शन की जरूरत के अलावा, कई परिस्थितियों में, गोदाम में वनस्पति पाउडर या अर्क भी एक साइट पर तेजी से पहचान के आकलन से लाभ होगा । इस प्रकार की सामग्रियों के लिए, अतिरिक्त प्रश्नों को संबोधित करने की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि "इस सामग्री में क्या है?", "क्या इसमें वनस्पति प्रजातियां शामिल हैं जिनकी मैं ढूंढ रहा हूं?", "क्या इसमें उन व्यभिचारियों को शामिल किया जाता है जिनसे मैं बचना चाहता हूं?", और "क्या यह अन्य वनस्पति प्रजातियों द्वारा पूर्ण या आंशिक रूप से प्रतिस्थापित किया जाता है जो हानिकारक हैं?"। इंटरकैलिटिंग डाई का उपयोग करने के बजाय, विभिन्न क्यूपीसीआर जांच को एक प्रतिक्रिया प्रणाली में विभिन्न वनस्पतिविज्ञान से एम्प्लिकलॉन को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, जबकि परख की उच्च विशिष्टता और दक्षता बनाए रखते हैं। जांच आधारित क्यूपीसीआर का विकास और एक पोर्टेबल क्यूपीसीआर प्रणाली का उपयोग जो कई चैनल डिटेक्शन प्रदान करता है, अधिक जटिल प्रश्नों का उत्तर देने के लिए वनस्पति सामग्री गोदामों और वितरण केंद्रों जैसे व्यापक पर्यावरण सेटिंग के लिए एक फिट-फॉर-उद्देश्य परख के रूप में क्षेत्र परीक्षण के आवेदन का विस्तार कर सकता है। इसके अलावा, कई जांच का उपयोग करने से उपयोगकर्ता को प्रत्येक प्रतिक्रिया प्रणाली में आंतरिक प्रवर्धन शामिल करने की भी अनुमति मिलती है, ताकि पीसीआर अवरोध संदिग्ध होने पर अधिक जानकारी उपलब्ध हो सके।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक ही उद्देश्य के लिए उपयोग की जाने वाली मौजूदा प्रौद्योगिकियों की तुलना में निम्नलिखित फायदे हैं। सबसे पहले, पारंपरिक रूपात्मक और रासायनिक पहचान विधियों के लिए, प्रक्रिया और उसके परिणामों को विशेषज्ञों द्वारा आयोजित और व्याख्या करने की आवश्यकता है । क्यूपीसीआर-आधारित पहचान परीक्षण बुनियादी आणविक जीव विज्ञान प्रशिक्षण वाले लोगों द्वारा आयोजित किए जा सकते हैं और अधिक मानकीकृत तरीके से व्याख्या की जा सकती है। दूसरा, सामान्य रूप से प्रयोगशाला में किए जाने वाले क्यूपीसीआर-आधारित प्रजातियों की पहचान और भेदभाव की तुलना में, पोर्टेबल उपकरण का उपयोग करके क्षेत्र पहचान प्रोटोकॉल को एक बड़े पदचिह्न वाले उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि एक उच्च गति अपकेंद्रित्र, डीएनए गुणवत्ता मूल्यांकन उपकरण, फ्लोरेसेंस डिटेक्टर के साथ थर्मल साइकिलर, और एक विशेष सॉफ्टवेयर चलाने वाला कंप्यूटर। इस प्रकार, डीएनए आधारित प्रजातियों की पहचान बिना किसी भी सेटिंग में अविलंब की जा सकती है। तीसरा, वनस्पति सामग्री की खोज करना एक ऐसा कार्य है जिसके लिए वैश्विक ऑपरेशन की आवश्यकता होती है। क्लाउड सेवाओं और कृत्रिम बुद्धि में प्रगति के साथ, एक पोर्टेबल डिवाइस प्रयोगशाला में विशेषज्ञों द्वारा विकसित और मान्य तरीकों को संभावित रूप से प्राप्त कर सकता है, दूरदराज के क्षेत्रों में गैर-विशेषज्ञों द्वारा संचालित किया जा सकता है, और तीसरे पक्ष से वस्तुनिष्ठ प्रमाणपत्र का उत्पादन कर सकता है। इसलिए, यह विकल्प रिमोट काम के साथ पहले से कहीं अधिक मजबूर है।

संक्षेप में, यहां प्रोटोकॉल ने पोर्टेबल क्यूपीसीआर प्रणाली का उपयोग करके एम चामोमिला की क्षेत्र पहचान का प्रदर्शन किया। इस तकनीक के सफल आवेदन से वनस्पति पहचान पर अत्यधिक सटीक परिणाम उत्पन्न होंगे और वनस्पति निर्माताओं और आपूर्तिकर्ताओं को समय पर और लागत-कुशल तरीके से वनस्पति सामग्री अर्हता प्राप्त करने में मदद मिलेगी।

Disclosures

हम प्रमाणित करते हैं कि झेंगक्सियू यांग, झेंग क्वान, टिफ़नी चुआ, लियो ली, यानजुन झांग, सिल्वा बाबाजानियन, ट्रिसिया चुआ, पीटर चांग, गैरी स्वानसन, झेंगफेई लू अमेरिका के हर्बलाइफ इंटरनेशनल, इंक के कर्मचारी हैं । हम प्रमाणित करते हैं कि फ्रांसेस्को बुओंगोरोनो, इसाबेला डेला एनोस और लोरेंजो कोलंबो हाइरिस लिमिटेड के कर्मचारी हैं जो इस लेख में उपयोग किए जाने वाले पोर्टेबल क्यूपीसीआर उपकरण का उत्पादन करते हैं।

Acknowledgments

हम जेम्स शान को फील्ड वीडियो रिकॉर्डिंग में उनके प्रयासों के लिए धन्यवाद देते हैं । हम जॉन बायरन और मैथ्यू सेमरौ को वीडियो संपादन में उनके काम के लिए धन्यवाद देते हैं। हम टेस्ट फील्ड का पता लगाने में उनके समर्थन के लिए अंसेन लुओ, हैरी डु और फ्रैंक देंग को धन्यवाद देते हैं । हम मारिया रूबिंस्की को पूरी पांडुलिपि पर उनकी बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं । सभी स्वीकार किए जाते हैं कि व्यक्ति अमेरिका के हर्बालाइफ इंटरनेशनल, इंक के कर्मचारी हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Battery	TNE	78000mAh	Provide field power supply
bCUBE	HYRIS	bCUBE 2.0	Portable qPCR instrument
Cartridges(16 Well)	HYRIS	NA	Consumables for bCUBE
Electric pipette	Eppendorf	NA	Handling liquid
Extract-N-Amp^TM plant PCR kit	SIGMA	XNAP2-1KT	Plant DNA extraction kit
German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials	AHP	2264	Used as positive control
Mini dry bath	Yooning	MiniH-100L	For DNA extraction
Nuclease-free water	AMBION	AM9937	qPCR reaction
Primer	Thermo Fisher Scientific	NA	qPCR reaction
Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials	ChromaDex	ASB-00030806-005	Used as positive control
Luna universal qPCR master mix	NEB	M3003L	qPCR reaction