Summary
هنا هو بروتوكول لتحديد الميدان من Chamomميلا Matricaria باستخدام نظام qPCR المحمولة. ويعتبر هذا البروتوكول الذي يسهل تنفيذه مثالياً كوسيلة لتأكيد هوية الأنواع النباتية في المواقع التي يكون فيها الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً، مثل المزارع والمستودعات.
Abstract
مراقبة الجودة في المنتجات النباتية يبدأ مع المواد الخام المعروضة. تقليدياً، يتم إجراء تحديد النباتات من خلال التقييم المورفولوجي وطرق التحليل الكيميائي. غير أن عدم توافر علماء النبات، لا سيما في السنوات الأخيرة، إلى جانب الحاجة إلى تعزيز مراقبة الجودة لمكافحة الضغوط على سلسلة العرض الناجمة عن زيادة الطلب الاستهلاكي وتغير المناخ، يتطلب اتباع نهج بديلة. والهدف من هذا البروتوكول هو تيسير تحديد الأنواع النباتية باستخدام نظام QPCR محمول في الميدان أو في أي مكان، حيث يكون الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً. يتم تضخيم الحمض النووي الهدف باستخدام qPCR القائم على الصبغة ، مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية النباتية بمثابة عنصر تحكم إيجابي. يتم تحديد الحمض النووي الهدف من خلال تضخيم محددة ومطابقة ذروة ذوبان ضد السيطرة الإيجابية. وقد أدرج وصف مفصل للخطوات والمعلمات، من عملية جمع العينات الميدانية، إلى استخراج الحمض النووي، والتضخيم PCR، متبوعاً بتفسير البيانات، لضمان أن القراء يمكنهم تكرار هذا البروتوكول. تتماشى النتائج التي تم إنتاجها مع أساليب التعرف النباتية التقليدية في المختبر. وهذا البروتوكول سهل التنفيذ وفعال من حيث التكلفة، مما يتيح إجراء اختبارات نوعية على المواد الخام في أقرب وقت ممكن من نقطة منشأ سلسلة التوريد.
Introduction
ممارسة استخدام النباتات للحفاظ على وتحسين الصحة يعود إلى آلاف السنين. بسبب الضغوط على سلسلة التوريد التي جلبتها زيادة الطلب المستهلك1, ممارسات الحصاد غير المستدامة وتغير المناخ2, الزنا النباتية أصبحت مصدر قلق متزايد في صناعة المكملات الغذائية والغذائية3. قد يؤدي وجود أنواع نباتية غير معلنة أو غير محددة إلى انخفاض الفعالية، أو حتى إلى قضايا السلامة. على سبيل المثال ، يمكن استبدال كوهوش السوداء(Actaea racemosa) ، المستخدمة لعلاج الانزعاج ما قبل الحيض ، مع الأنواع الآسيوية منخفضة الثمن مع دعم محدود للبيانات السريرية لفعاليتها4. في حالة أكثر خطورة، استبدال أرييستوولوتشي fangchi ل ستيفانيا تيراندرا في دراسة سريرية لفقدان الوزن باستخدام الأعشاب الصينية أدى إلى تسمم الكلية الشديد والفشل الكلوي في بعض المشاركين5,6. وتقاسم النوعان المختلفان اسما صينيا شائعا هو "فانغ جي". وتبرز هذه الحالات الحاجة إلى مراقبة أكثر صرامة للجودة، بدءاً من تحديد المواد الخام7،ويفضل أن يكون أقرب إلى نقطة منشأ سلسلة التوريد قدر الإمكان، حتى يمكن تخصيص الموارد بكفاءة لمواد الهوية الصحيحة.
ويمكن استخدام عدد من الأساليب المتعامدة لتحديد هوية النباتات. تقليديا، يتم إجراء تحديد النباتات من خلال التقييم المورفولوجي8،,9 وطرق التحليل الكيميائي10،11،12،13. ويستند تحديد المورفولوجية على الاختلافات في السمات العيانية والمجهرية للمواد النباتية إذا كانت هناك اختلافات (الشكل 1). ومع ذلك ، فإن عدم وجود برامج تدريبية على علم النبات الكلاسيكي في السنوات الأخيرة أدى إلى نقص في الخبراء14، مما يجعل هذا النهج غير عملي لمراقبة الجودة الروتينية. كما أن تطبيقه في المواد النباتية المسحوقة محدود أيضاً. وتستخدم على نطاق واسع أساليب التحليل الكيميائي في الأدوية والمختبرات، ولكنها ليست مثالية للاختبار الميداني نظرا لحجم الأدوات مثل جودة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة عالية الأداء (HPTLC)، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، والمجهر الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) (الشكل 2)،ومتطلبات البيئة. وقد ظهرت مؤخراً طرق الجينوم كتقنية بديلة للتحقق من صحة الأنواع النباتية واكتشافها للاستعاضة عنها، وأثبتت أنها فعالة ودقيقة. أساليب الجينوم تستغل الدقة العالية وخصوصية المعلومات الوراثية في المواد النباتية15،16،17،18،19. تتوفر أدوات التشخيص الجزيئي في شكل أجهزة محمولة، وغالبا ما تتضمن أدوات تفسير البيانات الآلية التي تقلل من حاجز استخدام التكنولوجيا، مما يجعل هذا النهج مثاليا لتحديد الحقل20،21،22،23،24. مرة واحدة وقد تم تصميم طريقة التحليل الجزيئي والتحقق من صحة25،26،27، يمكن أن يؤديها أي أفراد مع التدريب البيولوجيا الجزيئية الأساسية. من بين الأدوات المحمولة المختلفة المتاحة ، PCR في الوقت الحقيقي على تسلسل الحمض النووي هو واحد من الخيارات فعالة من حيث التكلفة28. ويتيح الجمع بين جهاز محمول، إلى جانب التحليل الجزيئي المخصص والمتحقق منه، التحقق من الأنواع والمكونات النباتية خارج المختبر، كما هو الحال في المزارع ومستودعات المواد النباتية، مما يقلل من الوقت والتكاليف المرتبطة بالطرق التقليدية.
والهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طريقة لتحديد النباتات في الحالات التي يكون فيها الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً أو غير متاح، وذلك باستخدام نظام qPCR محمول. وقد ثبت الأسلوب على حقل من Chamomilla Matricaria (الشكل 3A) ، المعروف باسم البابونج الألماني ، وتستخدم على نطاق واسع لخصائصه المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة29. ويمكن الخلط بينه وبين الأنواع ذات الصلة ذات المظهر أو الرائحة المماثلة، وخاصة من أجناس Chamaemelum، Tanacetum، والأححوان30،31،32. من بين الأنواع ذات الصلة، Chamaemelum نبيلي، المعروف أيضا باسم البابونج الروماني، هو واحد ملحوظ مع مستويات الإنتاج مماثلة في التجارة(الشكل 3B). تم تصميم الطريقة التي تم إثباتها ليس فقط لتحديد الأنواع النباتية المستهدفة M. chamomilla، ولكن أيضا الكشف عن قريب لها ، C. nobile، على أساس تضخيم محدد من تسلسل الحمض النووي.
يشرح هذا المقال، بالتفصيل، كيفية تنفيذ تحديد الحقل النباتية من M. chamomilla باستخدام qPCR القائم على صبغة التشابك وتحليل منحنى تذوب على جهاز محمول. ويتضمن البروتوكول جمع العينات النباتية من الحقل، واستخراج الحمض النووي في الموقع، وإعداد تفاعل PCR في الوقت الحقيقي. لضمان استنتاج صحيح، الهدف النباتية M. chamomilla وغير المستهدفة الحمض النووي الجينومي C. نتيل، المستخرجة مسبقا من المواد المرجعية النباتية المعتمدة، وتستخدم كتحكم إيجابي. وتتجلى خصوصية هذه الطريقة من خلال إجراء اختبارات تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile بشكل فردي على العينات والضوابط. يتم استخدام التحكم السلبي غير القالب لاستبعاد نتائج إيجابية كاذبة الناجمة عن التلوث PCR.
Protocol
1. عينة جمع
- قم بإعداد منطقة اختبار في الحقل بسطح مستو وأفقي.
- تحديد النبات التمثيلي الذي يعكس خصائص غالبية النباتات في حقل زهرة البابونج (الشكل 4).
- اختيار رأس زهرة من النباتات ممثل باستخدام قفازات معقمة.
- ضع العينة في أنبوب جمع 2.0 مل.
- كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.4 وجمع منشور (حوالي 0.5-0.7 سم) من نفس المصنع.
ملاحظة: M. زهرة chamomilla وأوراق صغيرة بما يكفي للجلوس في الجزء السفلي من أنبوب جمع 2.0 مل. بالنسبة للنباتات الأخرى ذات المساحة السطحية الأكبر، يمكن استخدام لكمة أو مقصات ورقية (شطفها في 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام) لعزل عينات الأنسجة للاختبار. عندما يتطلب أخذ عينات متعددة، شطف لكمة الورق أو مقص بين التعامل مع عينات مختلفة.
2. استخراج الحمض النووي
- سخني حاضنة الحمام الجاف إلى 95 درجة مئوية.
- إلى كل أنبوب جمع، إضافة 100 μL من محلول الاستخراج من مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي (المدرجة في جدول المواد). للحصول على كفاءة أفضل في استخراج الحمض النووي، طحن عينة الأنسجة في محلول الاستخراج باستخدام حشرات الأنسجة.
- أغلق الأنبوب. تأكد من أن الأنسجة النباتية مغطاة بمحلول الاستخراج طوال عملية الاستخراج.
- ضع أنابيب الجمع في حاضنة حمام جاف محمّى مسبقاً وحضن أنابيب الجمع عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- بعد 10 دقائق، أخرج الأنابيب من حاضنة الحمام الجاف.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول التخفيف من نفس مجموعة استخراج الحمض النووي ومزج الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
- كرر نفس الخطوة لاستخراج المنشورات.
- يهز لخلط الحل أكثر من ذلك. لا يبدو أن الأنسجة النباتية عادة ما تكون متدهورة بعد هذه المعاملة. قد يتغير لون السائل ويصبح غائما.
ملاحظة: يمكن تخزين المحلّل المخفف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها إن لم يكن يسير على الفور. ليس من الضروري إزالة الحطام الخلوي من الأنسجة النباتية قبل التخزين. السائل في الأنابيب يحمل قوالب الحمض النووي للمصب تضخيم PCR.
3. PCR رد الفعل الإعداد
- تكوين جهاز qPCR ظروف الدراجات الحرارية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. تطبيق ملف تعريف الدراجات الحرارية PCR المذكورة في (الجدول 1) ، والذي يبدأ مع درجة حرارة ثابتة خطوة لdenaturation الأولية ، تليها 25 دورة من التضخيم ، وينتهي مع درجة الحرارة المنحدر للحصول على منحنى ذوبان عالية الدقة.
- ذوبان خلط الرئيسي qPCR وال التمهيديات (الجدول 2) في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- تخطيط رد الفعل الذي سيتم تحميله في كل بئر: الآبار التي تحتوي على سيطرة إيجابية مع الأنواع المستهدفة، والسيطرة الإيجابية مع الأنواع غير المستهدفة، والعينات، والسيطرة السلبية(الشكل 5).
- في هذا المثال، يتم استخدام عشرة آبار - خمسة لاختبار تحديد البابونج الألماني والخمسة المتبقية لاختبار تحديد البابونج الروماني. ولكل نوع من أنواع اختبار تحديد الأنواع، يحتوي بئر واحد على سيطرة إيجابية مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع المستهدفة، ويحتوي بئر واحد على سيطرة إيجابية مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع غير المستهدفة، ويتم تعبئة بئرين معاينات من الزهور والأوراق من الحمض النووي المستخرجة من الحقل، ويتم تخصيص بئر واحد للسيطرة السلبية. ويصف الجدول 3 كل نوع من أنواع الآبار.
- إعداد رد فعل ماجستير مزيج وفقا لدليل لكل اختبار تحديد الأنواع النباتية. يحتوي مزيج رئيسي نموذجي للتفاعل على مزيج رئيسي qPCR عالمي (2x) ، واوباير أولية مخصصة للأنواع الأمامية والالعكسية ، ومياه خالية من النوى. الجدول 4 يسرد تكوين نظام التفاعل.
ملاحظة: إذا لم تستخدم على الفور، تخزين التفاعل qPCR ماجستير مزيج في +2 درجة مئوية إلى +8 درجة مئوية في برودة أو ثلاجة صغيرة. - خلط دقيق التفاعل الرئيسي مزيج عن طريق pipetting قبل الاستخدام.
- ضع خرطوشة qPCR وجهًا فوق سطحًا مستوًا ومستقرًا.
- قم بتحميل 18 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتفاعل الذي تم تكوينه في الخطوة 3.4 في آبار الخراطيش وفقًا للآبار المحددة في الخطوة 3.3. لهذا العرض التوضيحي، إضافة البابونج البابونج تحديد اختبار التفاعل الرئيسي مزيج رد فعل ماجستير في الآبار المسمى لاختبار GC (GCT في الآبار 1، 3، 5، 7، 9) والبابونج الروماني تحديد اختبار التفاعل الرئيسي مزيج في آبار المسمى لاختبار RC (RCT في الآبار 2، 4، 6، 8، 10) (انظر الشكل 5).
- نقل 2 ميكرولتر من الحمض النووي عينة من افراط من أنابيب استخراج الحمض النووي والضوابط الإيجابية الحمض النووي المستخرجة مسبقا في آبار خرطوشة محملة مسبقا مع مزيج سيد qPCR. بعد إضافة كل قالب الحمض النووي إلى مزيج سيد qPCR، بلطف مزيج الحل عن طريق الأنابيب.
ملاحظة: تجنب المخلفات الخلوية العائمة عند نقل الحمض النووي من أنبوب استخراج الحمض النووي. استخدام minicentrifuge لفصل الحطام فوق والخلايا، إذا لزم الأمر. - ختم بعناية خرطوشة مع فيلم لاصق. قم بتحميل الكارتريدج على غرفة الدراجات الحرارية ثم أغلقها.
- تعيين أداة qPCR لتشغيل.
Representative Results
بعد البروتوكول الموصوف في القسم 1، تم استخراج الحمض النووي النباتي من رأس زهرة وأوراق في اابر بعد حضانة الحرارة من أنبوب جمع في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في الدراسة الحالية، أظهر المكبر لونًا أصفر ومخضرًا لكل من الزهور والأوراق، مما يشير إلى أن مجموعة متنوعة من المركبات الطبيعية تم إطلاقها في المكبر مع الحمض النووي النباتي(الشكل 6). وعلى الرغم من أن التضخيم الموثوق به لل PCR قد تحقق لاحقاً في ثلاث 3333 لكل قالب الحمض النووي المستخرج في الميدان، فقد تم إجراء تقييم جودة الحمض النووي في المختبر كمرجع. وتراوح تركيز مستخلصات الحمض النووي للرأس الزهرة، الذي يحدده قياس الفلوروم، بين 3.69 إلى 5.36 نانوغرام/ميكرولتر، في حين تراوح تركيز مستخلصات الحمض النووي في الأوراق بين 6.42-9.29 نانوغرام/ميكرولتر. A260/A280 و260/A230 نسب امتصاص من الزهور وورقة مستخلصات الحمض النووي تم قياسها بواسطة القياس الطيفي. ومع ذلك، ونظراً للتداخل بين الحمض النووي وطيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية الكيميائية النباتية، لم يكن من الممكن قياس هذه النسب من الموثوقية (لم تظهر البيانات).
واستُخدمت الصبغة الفلورية المتداخلة لرصد تضخيم شظايا الهدف في الوقت الحقيقي. وبما أن كلا من التمهيديين M. chamomilla وC. nobile يستهدفان منطقة الفضاء 2 (ITS2) الداخلية المنسوخة، التي تحتوي على عشرات إلى مئات النسخ في الجينوم النباتي، فإن 25 دورة تضخيم PCR كافية لتوليد ما يكفي من الـ تضخيمات لتحديد أنواع البابونج. في الشكل 7، كانت قيمة Ct لتحكم M. chamomilla الإيجابي في اختبار تحديد M. chamomilla أقل من 25 (GCP_GCT) ، في حين أنه بعد 25 دورة تضخيم ، كان الفلور من نفس التحكم في اختبار تحديد C. nobile أقل من عتبة الكشف (GCP_RCT). ومن ناحية أخرى، وبعد 25 دورة، كانت الفلورية للرقابة الإيجابية C. nobile في اختبار تحديد M. chamomilla أقل من عتبة الكشف (RCP_GCT)، في حين كانت قيمة التصوير المقطعي لنفس عنصر التحكم في اختبار تحديد النسل C. nobile أقل من 25 (RCP_RCT). ويدل تضخيم الضوابط الإيجابية المستهدفة وغير المستهدفة في مقايسات كل منها على خصوصية مقايسة تحديد الهوية في M. chamomilla. بالنسبة لعينة الحمض النووي، فإن استخراج رأس زهرة الحقل وورقة الحمض النووي أسفر عن قيم 15.18 و19.41 في اختبار تحديد M. chamomilla على التوالي (Sample1(FLOWER) _GCT و Sample2(LEAF) _GCT). ولم يتم تضخيم كل من هذه العينات في اختبار تحديد هوية الـ C. nobile (sample1(FLOWER) _RCT و Sample2(LEAF) _RCT). وقد تطابقت أنماط التضخيم بين العينتين مع نمط التضخيم في السيطرة الإيجابية M. chamomilla. ولم تُضخَّم الضوابط السلبية في كل من اختبارات تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile (NC_GCT و NC_RCT)، باستثناء احتمال حدوث إيجابيات كاذبة ناجمة عن التلوث باللرابطة. وللتأكد من تضخيم محدد في الضوابط الإيجابية والعينات، تم تشغيل كسور من المنتج النهائي PCR من كل بئر على جل agarose 2٪ في المختبر (الشكل 8). بالنسبة لاختبار تحديد الهوية M. chamomilla، أسفرت كلتا العينتين الميدانيتين عن أمبليكونات تعمل في نفس وضع التحكم الإيجابي M. chamomilla مع حجم يقدر قليلاً فوق 100 بريتيش كلبت (الحجم النظري 102 bp). بالنسبة لاختبار تحديد هوية C. nobile، أسفرت السيطرة الإيجابية عن الأنواع غير المستهدفة C. nobile إلى نطاق يتراوح بين 50 و 100 نقطة بريتيش بتروليوم، وهو ما يتناسب مع الحجم النظري البالغ 65 نقطة بريتيش بتروليوم. ولم تُظهر بقية الممرات أي منتج تضخيم محدد، وهو ما كان متفقاً مع عدم وجود إشارة فلورية لهذه الآبار، كما لوحظ في الاختبار الميداني.
وبعد تضخيم نظام PCR، تم إجراء تحليل لمنحنى الذوبان لتقييم خصائص الانفصام للحمض النووي المزدوج (dsDNA) أثناء التسخين. كما ارتفعت درجة الحرارة خلال الدورة النهائية لتحليل منحنى الذوبان، والزيادات في درجة الحرارة تسبب amplicons مزدوجة حبلا للتفكك. تم إطلاق الصبغة الفلورية المتداخلة تدريجيا في المحلل ، مما يقلل من كثافة الفلوريسين(الشكل 9A). تم استخدام نقطة انقلاب منحنى المشتق الأول لتحديد درجة حرارة الذوبان (Tm) (الشكل 9B) ، والتي تعتمد بشكل رئيسي على طول جزء الحمض النووي ومحتوى GC. يمكن أن يؤدي الجمع بين قيمة Ct ودرجة حرارة الذوبان إلى زيادة خصوصية تحليل qPCR. في الدراسة الحالية، حدث ذروة درجة حرارة الذوبان من M. chamomilla التحكم الإيجابي PCR amplicon عند 85.6 درجة مئوية (GCP_GCT) وكان متميزا عن ذروة درجة حرارة ذوبان C. nobile التحكم الإيجابي PCR amplicon عند 79.1 درجة مئوية (RCP_RCT). أنتجت ابلليكون PCR من رأس زهرة الحقل وورقة قمم درجة حرارة ذوبان في 85.2 درجة مئوية و 84.8 درجة مئوية، على التوالي (Sample1(FLOWER) _GCT و Sample2(LEAF) _GCT). لتقييم ذوبان التغيرات في درجة الحرارة التي تقاس بنظام qPCR المحمولة، تم جمع نقاط بيانات إضافية للتأكد من أن درجات حرارة ذوبان العينة كانت دائما قريبة من درجة حرارة الذوبان التي تم الحصول عليها من التحكم الإيجابي M. chamomilla (داخل 2 درجة مئوية) وكانت بعيدة عن درجة حرارة ذوبان امباليكون التحكم الإيجابي C. nobile (الشكل 10). وكانت ذروة درجات الحرارة الذائبة تُبلّغ عنها أحياناً في آبار أخرى. ومع ذلك، كانت قيمها Ct لا تقل عن 25 ولم تكن قمم درجات الحرارة الذائبة قريبة من M. chamomilla أو C. nobile التحكم الإيجابي (أكثر من 2 درجة مئوية عن بعضها البعض).
وباختصار، يمكن تفسير اختبار تحديد هوية الحقل M. chamomilla استنادا إلى قواعد القرار الموجزة في الجدول 5. مع جميع الضوابط الإيجابية اختبار إيجابي للأنواع النباتية المفترضة، سلبية للأنواع الأخرى، والضوابط السلبية اختبار سلبية، تم تحديد كل عينات الحقل لاحتواء M. chamomilla ولكن ليس C. nobile. وبالإضافة إلى ذلك، وبغية مواءمة نتائج الاختبارات الميدانية مع التقنيات التحليلية الأخرى، تأكدت الاستنتاجات الميدانية كذلك من خلال طريقة25 لتكويد الحمض النووي (لم تظهر بيانات).
الشكل 1: التعريف المورفولوجي للمواد النباتية. (أ) الكركديه روزا سينينسيس الزهور، Curcuma لونغا جذور، مالفا سيلفستريس يترك، Rosmarinus officinalis أوراق، بذور Sativum كورياندروم، Zingiberaysale الجذور. (B) بتروسيلينيوم crispum وApium فليكس graveolens من الصعب التفريق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحديد الكيميائي للمواد النباتية. (أ) أداة HPTLC وملخرة روموات HPTLC تمثيلية. (B) أداة HPLC وملسم كروماتو التمثيل HPLC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ماتريكاريا شاموميا وشاماميلوم نابل في الميدان. (أ) مشاميلة Matricaria ، مقتبس من ويكيبيديا تحت CC BY-SA 3.0 ، https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile، مقتبس من ويكيبيديا تحت CC BY-SA 3.0، https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: جمع أجزاء النباتات M. chamomilla من الحقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تخطيط اختبار الآبار في العرض التوضيحي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: استخراج الحمض النووي الميداني في أنابيب الجمع. يبقى النسيج النباتي في الأنبوب الأصلي ويغطيه مستخلص الحمض النووي المصفر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: مؤامرة الفلورنس التي تبين تراكم منتجات PCR على مدى 25 دورة من الدراجات الحرارية. م. chamomilla السيطرة الإيجابية والتحكم الإيجابي C. nobile إظهار قيم Ct أقل من 25 في M. chamomilla و C. اختبارات تحديد الهوية، على التوالي. تم تضخيم عينات زهرة الحقول وأوراق بواسطة اختبار تحديد M. chamomilla مع قيم Ct من 15.18 و 19.41. ولم يتم تضخيم بقية الآبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: جل الكهرباء من منتجات تضخيم PCR الحقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تحليل درجة الحرارة المذابة. (أ) إشارة الفلوريسنس في كل بئر تنخفض مع ارتفاع درجة الحرارة. (B) تم تأكيد هوية منتجات PCR من خلال ذروة درجة الحرارة الذائب في تحليل منحنى الذوبان. تظهر عينات زهرة الحقول وأوراق الذروة عند 85.2 درجة مئوية و84.8 درجة مئوية. هذه هي قريبة من الذروة التي تنتجها M. chamomilla السيطرة الإيجابية. أنتجت السيطرة الإيجابية C. nobile ذروة عند 79.1 درجة مئوية، وهو يختلف عن العينات الثلاث الأخرى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: ذوبان درجات الحرارة في ذروة الاختلاف بين عناصر التحكم الإيجابية وعينات الحقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المرحله | دوره | درجه الحراره | الوقت |
| درجة حرارة ثابتة | 1 | 95 درجة مئوية | 60s |
| التضخيم | 25 | 95 درجة مئوية | 30s |
| 60 درجة مئوية | 30s | ||
| ذوبان المنحنى | 1 | 60 درجة مئوية | منحدر 0.05 درجة مئوية / س |
| 95 درجة مئوية |
الجدول 1: ظروف الدراجات الحرارية qPCR لاختبارات تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile.
| تحليل | اسم التمهيدي | تسلسل 5 '-3' | موقف | المنطقه | حجم أمبيركون | |
| ماتريكاريا recutita | ZL3 | TCGTCGGTCGCAAGGATAAG | الي الامام | ITS2 | 102 نقطة ا | |
| ZL4 | TAAACTCAGCGGGTAGTCCC | عكس | ||||
| شاماميلوم نابيلي | ZL11 | TGTCGCACGTTGCTAGGAGCA | الي الامام | ITS2 | 65 نقطة أساس | |
| ZL12 | TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC | عكس | ||||
الجدول 2: زوجا التمهيدي لاختباري تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile.
| موقع جيد | اسم جيد | وصف | |
| 1 | GC_PosCtrl_GC_Test | التحكم الإيجابي للبابونج الألماني تحت اختبار GC | |
| 2 | GC_PosCtrl_RC_Test | التحكم الإيجابي البابونج الألمانية تحت اختبار RC | |
| 3 | RC_PosCtrl_GC_Test | البابونج الروماني السيطرة الإيجابية تحت GC اختبار | |
| 4 | RC_PosCtrl_RC_Test | البابونج الروماني السيطرة الإيجابية تحت اختبار RC | |
| 5 | Field_Sample_GC_Test | عينة من الأنسجة ورقة تحت GC اختبار | |
| 6 | Field_Sample_RC_Test | عينة من الأنسجة ورقة تحت اختبار RC | |
| 7 | Field_Sample_GC_Test | عينة من أنسجة الزهور تحت اختبار GC | |
| 8 | Field_Sample_RC_Test | عينة من أنسجة الزهور تحت اختبار RC | |
| 9 | NegCtrl_GC_Test | عينة تحكم سالبة تحت اختبار GC | |
| 10 | NegCtrl_RC_Test | عينة تحكم سالبة تحت اختبار RC | |
الجدول 3: أنواع الآبار وأوصافها لاختبارات تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile.
| الكاشف | GC_Test | RC_Test |
| مزيج qPCR العالمي* | 10 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
| ZL3 التمهيدي (10 μM) | 0.4 ميكرولتر | Na |
| ZL4 التمهيدي (10 μM) | 0.4 ميكرولتر | Na |
| ZL11 التمهيدي (10 μM) | Na | 0.4 ميكرولتر |
| ZL12 التمهيدي (10 μM) | Na | 0.4 ميكرولتر |
| H2O (خال من النوى) | 7.2 ميكرولتر | 7.2 ميكرولتر |
| * يحتوي على الساخن بدء طق DNA بوليميراز | ||
الجدول 4: تركيب المزيج الرئيسي لاختبارات تحديد الهوية M. chamomilla و C. nobile.
| اسم جيد | النتيجة المتوقعة | معايير النتيجة الإيجابية | معايير النتيجة السالبة |
| الكشف / الحاضر | لم يتم الكشف / غائبة | ||
| GC_PosCtrl_GC_Test | الكشف عن | Ct < 25 و 84 <= Tm <= 86 | - |
| GC_PosCtrl_RC_Test | لم يتم الكشف عن | - | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| RC_PosCtrl_GC_Test | لم يتم الكشف عن | - | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| RC_PosCtrl_RC_Test | الكشف عن | Ct < 25 و 79 <= Tm <= 81 | - |
| Field_Sample_Leaf_GC_Test | هذا | Ct < 25 و 84 <= Tm <= 86 | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| Field_Sample_Leaf_RC_Test | غائبه | - | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| Field_Sample_Flower_GC_Test | هذا | Ct < 25 و 84 <= Tm <= 86 | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| Field_Sample_Flower_RC_Test | غائبه | - | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| NegCtrl_GC_Test | لم يتم الكشف عن | - | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
| NegCtrl_RC_Test | لم يتم الكشف عن | - | لا توجد قيمة Ct في غضون 25 دورة |
الجدول 5: قواعد تفسير نتائج QPCR.
Discussion
تصميم التمهيدي واختيار قالب هي الخطوات الحاسمة في الحصول على كفاءة ومحددة QPCR التضخيم. بعد تحديد قالب مناسب ، وعادة ما يستخدم تصميم التمهيدي البرمجيات للمساعدة في اختيار التمهيديات على أساس متغيرات التصميم مثل طول التمهيدي ودرجة حرارة الذوبان ، و GC المحتوى33،34. يمكن إجراء التحسين والتحقق في ظل الظروف التجريبية المتوقعة من الفحص لضمان خصوصية وحساسية ومتانة تفاعل PCR35. قد ينتج تصميم التمهيدي دون الأمثل في تشكيل التمهيدي- الديم، حيث تنتج التفاعلات التمهيدية منتجات غير محددة36.
لا يوجد نموذج الضوابط (NTC) المستخدمة في هذه الدراسة للتحقق من كل من تلوث الحمض النووي ووجود التمهيدي- الخافتات التي يمكن أن تؤثر على الفحص. وأظهرت النتائج أي تضخيم، وهو مؤشر جيد على أن كلا من تلوث الحمض النووي والضمير التمهيدي ليست مصدر قلق. ويتضح تلوث الحمض النووي والضمير التمهيدي في منحنيات تذوب من خلال عدم وجود عناصر تحكم القالب، وكذرات إضافية في منحنيات تذوب من عناصر التحكم الإيجابية. عادةً ما يتوقع أن يحتوي منحنى الذوبان لعنصر تحكم موجب على ذروة واحدة، ما لم تتسبب النطاقات الفرعية الغنية بـ AT في القالب في ذوبان غير متساوٍ. ويمكن التنبؤ القمم المزدوجة عن طريق محاكاة ذوبان المقايسات باستخدام uMELT البرمجيات37. في هذه الدراسة، تم استخدام معيار الذهب لتشغيل المنتج PCR على هلام agarose لتأكيد وجود المنتج PCR الهدف وعدم وجود التلوث وdr-dimers.
وهناك تحد كبير في التحليل الجزيئي للمواد النباتية هو الحصول على الحمض النووي ذات النوعية الجيدة بعد عملية استخراج الحمض النووي النباتي. يتم تداول المواد النباتية واستهلاكها للمركبات الكيميائية النشطة المرتبطة بالفوائد الصحية. وفي عملية استخراج الحمض النووي، سيتم أيضاً إطلاق هذه المركبات الكيميائية في محلول استخلاص الحمض النووي، مما قد يسبب تثبيط PCR، مما يؤدي إلى فشل في تضخيم PCR. وقد تم تطوير مختلف مجموعات تنقية الحمض النووي النباتي باستخدام المذيبات العضوية والأعمدة لإزالة المركبات الكيميائية المستمدة من النباتات38. ومع ذلك، فإن غطاء الدخان والطرد المركزي عالي السرعة المطلوبين لمساعدة هذه المجموعات غير متوفرة في الميدان.
في البروتوكول الحالي، تستخدم طريقة استخلاص الحمض النووي المبسطة مجموعة استخراج الحمض النووي النباتية التجارية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). كان لديه القدرة على تحييد المواد المثبطة المشتركة لنتائج قابلة للتكاثر، وأسفر عن نتائج متسقة ل M. chamomilla وC. nobile. كل من M. chamomilla وC. رؤساء الزهور والأوراق التي أسفرت عن تضخيم PCR مع قمم تذوب محددة، مما يشير إلى أن وجود مثبطات PCR لم يكن مصدر قلق. بالنسبة للنباتات الأخرى ذات المستويات الأعلى من مثبطات PCR ، قد يكون تضخيم الحمض النووي في استخراجها الأصلي أقل كفاءة. للحد من تثبيط وتحسين كفاءة التضخيم، مع الوصول إلى المصنع كله، يمكن أيضا أجزاء أخرى من النباتات مع أقل محتوى السكريات والبوليفينول يمكن استخدامها لأغراض تحديد الهوية. إذا كان هناك وصول محدود إلى أجزاء نباتية مختلفة، والأوراق الأصغر سنا أو بتلات تشريح من رؤساء الزهور، والتي عادة ما يكون محتوى أقل الفينولية39، قد توفر فرصة أفضل للنجاح. وبما أن تسلسل الحمض النووي متسق عبر النبات بأكمله، يمكن استخدام أي جزء نباتي لتأكيد هوية الأنواع. إذا كان التضخيم PCR لا يزال دون المستوى الأمثل، يمكن أن يتم تخفيف استخراج الحمض النووي الأصلي أكثر قبل PCR، أو يمكن استخدام بروتوكولات تنقية المختبرات أكثر تطورا.
10- وثمة تحد آخر لتحليل الـ PCR يتمثل في النتائج الإيجابية الخاطئة الناجمة عن تلوث الحمض النووي، والتي يمكن أن تؤثر سلباً على تفسير البيانات. وعادة ما يتم التحكم فيها عن طريق التدبير المنزلي النشط ، وذلك باستخدام معدات مخصصة ، وتقييد العمل في مناطق معينة. باستخدام qPCR، يمكن إنجاز جميع تحليل PCR في نظام مغلق، مما يقلل إلى حد كبير من فرصة تلوث PCR أمبيرليكون في بيئة لا يتم التحكم فيها بشكل جيد. الى جانب ذلك ، يجب أن الحمض النووي البيئي أيضا لا تظهر إيجابية كاذبة بسبب خصوصية الفحص ، وفقا لدراسة التحقق السابقة40.
هناك مجال للتحسين. في البروتوكول المقدم هنا، تم استخدام صبغة التشابك لإظهار تضخيم جزء الهدف في الوقت الحقيقي. وتثبت خصوصية الطريقة كذلك من خلال درجة حرارة الذوبان المميزة، التي تتميز بين M. chamomilla وC. ناول أمبيرليكونات. ولذلك، يمكن للربط بين الصباغ PCR الإجابة بكفاءة على السؤال "ما هو هذا النوع النباتي؟" في هذا المجال. ومع ذلك، وبالإضافة إلى الحاجة إلى إجراء عملية تحديد نباتية في مصنع واحد معزول عن الحقل، فإن المساحيق أو المستخلصات النباتية في المستودع تستفيد أيضاً في كثير من الظروف من تقييم سريع للهوية في الموقع. بالنسبة لهذه الأنواع من المواد، قد تحتاج إلى معالجة أسئلة إضافية، مثل "ما هو في هذه المادة؟" و "هل تحتوي على الأنواع النباتية التي أبحث عنها؟" و "هل تحتوي على زناة أريد تجنبها؟" و "هل يتم استبدالها كليا أو جزئيا بالأنواع النباتية الأخرى الضارة؟". بدلا من استخدام صبغة التشابك، يمكن تصميم مسابير qPCR مختلفة لاستهداف amplicons من النباتات المختلفة في نظام رد فعل واحد، مع الحفاظ على خصوصية عالية وكفاءة من المقايسة. تطوير qPCR القائم على المسبار والاستفادة من نظام qPCR المحمولة التي توفر الكشف عن قنوات متعددة يمكن أن تزيد من تطبيق الاختبار الميداني كمقايسة مناسبة لهذا الغرض إلى بيئة أوسع، مثل مستودعات المواد النباتية ومراكز التوزيع للإجابة على أسئلة أكثر تعقيدا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام مسبارات متعددة يسمح أيضا للمستخدم بتضمين التضخيم الداخلي في كل نظام رد فعل، بحيث تكون هناك معلومات إضافية تكون متاحة عندما يشتبه في تثبيط PCR.
البروتوكول المعروض هنا له المزايا التالية بالمقارنة مع التكنولوجيات الموجودة المستخدمة لنفس الغرض. أولاً، بالنسبة لأساليب التعرف المورفولوجية والكيميائية التقليدية، يلزم أن يقوم الخبراء بإجراء الإجراء ونتائجه وتفسيرها. يمكن إجراء اختبارات تحديد الهوية qPCR من قبل أشخاص لديهم تدريب أساسي في البيولوجيا الجزيئية وتفسيرها بطريقة أكثر توحيدًا. ثانياً، بالمقارنة مع تحديد الأنواع القائمة على qPCR والتمايز الذي يتم عادة في المختبر، لا يتطلب بروتوكول تحديد الهوية الميداني باستخدام جهاز محمول أدوات ذات بصمة كبيرة، مثل جهاز طرد مركزي عالي السرعة، ومعدات تقييم جودة الحمض النووي، ودورة حرارية مع كاشف الفلور، وجهاز كمبيوتر يعمل على برنامج خاص. وهكذا، يمكن إجراء تحديد الأنواع القائمة على الحمض النووي في أي مكان دون تأخير. ثالثاً، البحث عن المواد النباتية هو مهمة تتطلب عملية عالمية. مع التقدم في الخدمات السحابية والذكاء الاصطناعي، يمكن للجهاز المحمول تلقي الأساليب التي تم تطويرها والتحقق من صحتها من قبل الخبراء في المختبر، ويتم تشغيلها من قبل غير الخبراء في المناطق النائية، وإنتاج شهادات موضوعية من أطراف ثالثة. لذلك، هذا الخيار هو أكثر إلحاحا من أي وقت مضى مع العمل عن بعد أصبح الاتجاه.
باختصار، أظهر البروتوكول هنا تحديدًا ميدانيًا لـ M. chamomilla باستخدام نظام qPCR محمول. والتطبيق الناجح لهذه التقنية سوف تولد نتائج دقيقة للغاية على تحديد النباتية ومساعدة مصنعي النباتات والموردين تأهيل المواد النباتية في الوقت المناسب وبطريقة فعالة من حيث التكلفة.
Disclosures
نحن نشهد أن Zhengxiu يانغ ، تشنغ تشيوان ، تيفاني تشوا ، ليو لي ، يانجون تشانغ ، سيلفا باباجانيان ، تريشيا تشوا ، بيتر تشانغ ، غاري سوانسون ، Zhengfei لو هم من موظفي Herbalife الدولية الأمريكية ، وشركة نحن نشهد أن فرانشيسكو Buongiorno، إيزابيلا ديلا نوس، ولورينزو كولومبو هم من موظفي شركة هيريس المحدودة التي تنتج أداة qPCR المحمولة المستخدمة في هذه المقالة.
Acknowledgments
نشكر جيمس شان على جهوده في تسجيل الفيديو الميداني. نشكر جون بايرون وماثيو سيراو على عملهما في تحرير الفيديو. ونشكر أنسن لوه، وهاري دو، وفرانك دينغ على دعمهم لتحديد موقع حقل الاختبار. نشكر ماريا روبنسكي على تعليقاتها القيمة على المخطوطة بأكملها. جميع الأشخاص المعترف بها هي موظفات في شركة Herbalife International of America, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Battery | TNE | 78000mAh | Provide field power supply |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | Portable qPCR instrument |
| Cartridges(16 Well) | HYRIS | NA | Consumables for bCUBE |
| Electric pipette | Eppendorf | NA | Handling liquid |
| Extract-N-AmpTM plant PCR kit | SIGMA | XNAP2-1KT | Plant DNA extraction kit |
| German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials | AHP | 2264 | Used as positive control |
| Mini dry bath | Yooning | MiniH-100L | For DNA extraction |
| Nuclease-free water | AMBION | AM9937 | qPCR reaction |
| Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reaction |
| Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Used as positive control |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reaction |
References
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M.
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
