Summary
Здесь представлен протокол для полевой идентификации Matricaria chamomilla с использованием портативной системы qPCR. Этот простой в работе протокол идеально подходит как метод подтверждения идентичности ботанического вида в местах, где доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен, таких как фермы и склады.
Abstract
Контроль качества в ботанической продукции начинается с поставок сырья. Традиционно ботаническая идентификация проводится с помощью морфологической оценки и химических аналитических методов. Однако отсутствие наличия ботаников, особенно в последние годы, в сочетании с необходимостью усиления контроля качества для борьбы с нагрузками на цепочку поставок, обусловленной ростом потребительского спроса и изменением климата, требует альтернативных подходов. Цель этого протокола заключается в облегчении идентификации ботанических видов с помощью портативной системы кЗКПЧ на местах или в любых условиях, где доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен. Целевая ДНК усиливается с помощью qPCR на основе красителя, при этом ДНК извлекается из ботанических справочных материалов, выступающей в качестве положительного контроля. Целевая ДНК идентифицируется по ее специфическому усилению и соответствию ее пика плавления положительному контролю. Для обеспечения того, чтобы читатели могли воспроизвести этот протокол, было включено подробное описание шагов и параметров, от практического сбора образцов на местах до извлечения ДНК, усиления ПЦР с последующим толкованием данных. Подготовленные результаты согласуются с традиционными методами лабораторной ботанической идентификации. Протокол прост в работе и рентабельн, что позволяет проводить качественное тестирование сырья как можно ближе к точке происхождения цепочки поставок.
Introduction
Практика использования растительных растений для поддержания и улучшения здоровья восходит к тысячам лет. Из-за напряжений на цепочку поставок,вызванную повышенным потребительским спросом 1,неустойчивой практикойуборки урожая и изменением климата 2,ботаническая фальсификация становится растущей проблемой в пищевой и пищевой промышленностидобавок 3. Наличие необъявленных или неправильно идентифицированных ботанических видов может привести к снижению эффективности или даже к проблемам безопасности. Например, черный кохош(Actaea racemosa),используемый для лечения предменструального дискомфорта, может быть заменен недорогими азиатскими видами с ограниченной клинической поддержкой данных дляего эффективности 4. В более серьезном случае, замена Aristolochia fangchi для Стефании terandra в клиническом исследовании для потери веса с использованием китайских трав привело к тяжелой нефротоксичности и почечной недостаточности у некоторыхучастников 5,6. Два разных вида имеют китайское общее название "Fang Ji". Эти случаи подчеркивают необходимость более строгого контроля качества, начиная с идентификациисырья 7,предпочтительно как можно ближе к точке происхождения цепочки поставок, чтобы ресурсы могли эффективно распределяться на материал правильной идентификации.
Для ботанической идентификации можно использовать ряд ортогональных подходов. Традиционно, ботаническая идентификация проводится с помощьюморфологической оценки 8,,9 и химическиханалитических методов10,11,,12,,13. Морфологическая идентификация основана на различиях в макроскопических и микроскопических особенностях растительных материалов, если существуют различия(рисунок 1). Однако отсутствие учебных программ по классической ботанике в последние годы привело к нехваткеспециалистов 14,что делает такой подход нецелесообразным для регулярного контроля качества. Его применение в порошковых ботанических материалах также ограничено. Химические аналитические методы широко используются в фармакопеях и лабораториях, но не идеально подходят для полевых испытаний из-за размера таких инструментов, как высокопроизводительность тонкого слоя хроматографии (HPTLC), высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC), и ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (NMR) (Рисунок 2), и требования к окружающей среде. В последнее время геномные методы стали альтернативным методом аутентификации и обнаружения замещения ботанических видов и доказали свою эффективность и точное использование. Геномные методы используют высокую точность и специфичность генетической информациив растительных материалах 15,,16,,17,,18,,19. Молекулярно-диагностические инструменты доступны в виде портативных устройств, и часто включают автоматизированные инструменты интерпретации данных, которые снижают барьер для использования технологии, что делает этот подходидеальным для идентификации поля 20,,21,,22,23,24. После того, как метод молекулярного анализа был разработан и проверен25,26,27, он может быть выполнен любым персоналом с базовой молекулярной биологии подготовки. Среди различных портативных инструментов, доступных, в режиме реального времени ПЦР на последовательности ДНК является одним из экономически эффективныхвариантов 28. Сочетание портативного устройства, наряду с индивидуальным и проверенным молекулярным анализом, позволяет проверить ботанические виды и ингредиенты за пределами лаборатории, например, на фермах и складах ботанических материалов, сокращая время и затраты, связанные с традиционными методами.
Цель этого протокола заключается в внедрении метода ботанической идентификации в ситуациях, когда доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен или недоступен с использованием портативной системы qPCR. Метод продемонстрирован на поле ромашки Matricaria (рисунок 3A), широко известный как немецкая ромашка, широко используется для его противовоспалительные и антиоксидантныесвойства 29. Его можно спутать с родственными видами аналогичной внешности или запаха, особенно с родами Chamaemelum, Tanacetumи Chrysanthemum30,,31,,32. Среди родственных видов, Chamaemelum nobile, также известный как римская ромашка, является заметным с сопоставимыми уровнями производства в торговле (Рисунок 3B). Продемонстрированная методика была разработана не только для идентификации целевого ботанического вида M. chamomilla, но идля обнаружения его близкого родственника, C. nobile,на основе специфического усиления последовательностей ДНК.
В этой статье подробно объясняется, как выполнить полевую ботаническую идентификацию M. chamomilla с помощью интеркаляции красителя на основе qPCR и анализа кривой расплава на портативном устройстве. Протокол включает в себя сбор ботанических образцов с поля, удаление ДНК на месте, а также создание реакции ПЦР в режиме реального времени. Для обеспечения обоснованного заключения в качестве положительного контроля используются целевые ботанические M. chamomilla и нецелеприбынные ботанические геномные ДНК C. nobile, предварительно извлеченные из сертифицированных ботанических справочных материалов. Специфика этого метода демонстрируется путем проведения как М. шамомиллы, так и C. nobile идентификационных тестов индивидуально на образцах и контрольных данных. Не-шаблон отрицательный контроль используется для исключения ложноположимых результатов, вызванных загрязнением ПЦР.
Protocol
1. Сбор образцов
- Настройка испытательного полигона в поле с плоской и горизонтальной поверхностью.
- Определите репрезентативное растение, которое отражает характеристики большинства растений в поле цветка ромашки(рисунок 4).
- Выберите головку цветка от представительного завода используя стерильные перчатки.
- Поместите образец в трубку для сбора 2,0 мл.
- Повторите шаги от 1,3 до 1,4 и соберите листовку (примерно 0,5-0,7 см в длину) с того же растения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цветок и лист М. шамомиллы достаточно малы, чтобы сидеть на дне трубки сбора 2,0 мл. Для других растительных растений с большей площадью поверхности, бумажный пунш или ножницы (промытые в 70% этанола до использования) могут быть использованы для изоляции образцов тканей для тестирования. Когда требуется несколько проб, промыть бумажный пунш или ножницы между обработкой различных образцов.
2. Извлечение ДНК
- Разогреть инкубатор сухой ванны до 95 градусов по Цельсию.
- К каждой коллекторной трубке добавьте 100 МКЛ раствора экстракции из набора для извлечения ДНК растений (перечислено в таблице материалов). Для лучшей эффективности извлечения ДНК, молоть образец ткани в экстракции раствора с помощью ткани пестик.
- Закройте трубку. Убедитесь, что ботаническая ткань покрыта раствором экстракции на протяжении всего процесса экстракции.
- Поместите трубки для сбора в разогретый инкубатор сухой ванны и инкубировать трубки коллекции при 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
- Через 10 минут вынюхив трубки из инкубатора сухой ванны.
- Добавьте 100 МКЛ раствора разбавления из одного и того же набора для извлечения ДНК и смешайте раствор, несколько раз смояв трубку вверх и вниз.
- Повторите тот же шаг для извлечения листовок.
- Встряхните, чтобы смешать раствор дальше. Ткань растения, как правило, не кажется, деградировали после этого лечения. Цвет жидкости может измениться и стать облачным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный раствор может храниться при комнатной температуре на ночь, если не происходит немедленно. Перед хранением не стоит удалять клеточный мусор из растительной ткани. В жидкости в трубках содержится шаблоны ДНК для усиления ПЦР ниже по течению.
3. Настройка реакции ПЦР
- Настройте условия термоцикла прибора qPCR в соответствии со спецификациями производителя. Применить PCR термоциклинг профиль, перечисленный в (Таблица 1), который начинается с постоянной температуры шаг для первоначального денатурации, а затем 25 циклов усиления, и заканчивается повышением температуры, чтобы получить высокое разрешение плавления кривой.
- Оттепель qPCR Мастер Mix и грунтовки (Таблица 2) при комнатной температуре до использования.
- План реакции, которые будут загружены в каждой скважине: скважины, содержащие положительный контроль с целевыми видами, положительный контроль с нецелемых видов, образцы, иотрицательный контроль (рисунок 5).
- В этом примере используется десять скважин : пять для немецкого теста на идентификацию ромашки и остальные пять для римского теста по идентификации ромашки. Для каждого типа теста на идентификацию видов, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из эталонного материала целевых видов, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из справочного материала не целевых видов, две скважины заполнены образцами ДНК цветка и листьев, извлеченными из поля, и одна скважина выделена для отрицательного контроля. Таблица 3 описывает каждый тип хорошо.
- Подготовь реакцию мастер-микс в соответствии с руководством для каждого ботанического вида идентификации теста. Типичная реакция мастер-микс содержит универсальный qPCR Master Mix (2x), вперед и обратного видов конкретных грунтовки, и нуклеазы свободной воды. В таблице 4 перечислен состав системы реакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать немедленно, хранить qPCR реакции мастер-микс при 2 градусов по Цельсию до 8 градусов по Цельсию в кулер или мини-холодильник. - Тщательно смешать реакцию мастер-микс путем пипетки перед использованием.
- Поместите картридж qPCR лицом вверх на плоскую и стабильную поверхность.
- Загрузите 18 мкл мастер-микса реакции, настроенного в шаге 3.4 в картриджные скважины в соответствии с скважинами, определенными в шаге 3.3. Для этой демонстрации, добавить немецкий ромашки идентификации тест реакции мастер смеси в скважины помечены для испытания GC (GCT в скважинах 1, 3, 5, 7, 9) и римской ромашки идентификации тест реакции мастер-микс в скважины помечены для RC испытаний (RCT в скважинах 2, 4, 6, 8, 10) (см. Рисунок 5).
- Передача 2 МКЛ образцов ДНК из супернатанта трубок для извлечения ДНК и предварительно извлеченных положительных элементов ДНК в картриджные скважины, предварительно загруженные мастер-миксом qPCR. После добавления каждого шаблона ДНК в мастер-микс qPCR, аккуратно смешайте раствор с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте плавающего клеточного мусора при передаче ДНК из трубки извлечения ДНК. При необходимости используйте миницентрифуг для разъегония супернатантного и клеточного мусора. - Аккуратно загерметив картридж клейкой пленкой. Загрузите картридж на термоциклинговую камеру и закройте его.
- Установите инструмент qPCR для запуска.
Representative Results
В соответствии с протоколом, описанным в разделе 1, ботаническая ДНК из цветочной головы и листа была извлечена в супернатант после тепловой инкубации трубки сбора при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. В текущем исследовании, супернатант показал желтый и зеленоватый цвет для цветка и листа, указывая, что различные природные соединения были выпущены в супернатант с ботанической ДНК (Рисунок 6). Хотя надежное усиление ПЦР было достигнуто позже в три раза для всех полевых извлеченных шаблонов ДНК, оценка качества ДНК была проведена в лаборатории в качестве эталона. Концентрация экстракта ДНК головы цветка, определяемая флюорометрией, колебалась от 3,69 до 5,36 нг/йл, в то время как концентрация экстракта ДНК листьев колебалась от 6,42 до 9,29 нг/мл. Коэффициенты поглощения цветов и листьев A260/A280 и A260/A230 были измерены спектрофотометрией. Однако из-за перекрытия между ДНК и фитохимическим спектром поглощения УФ эти соотношения не могут быть измерены надежностью (данные не показаны).
Для мониторинга усиления фрагментов мишени в режиме реального времени использовался интеркалирующий флуоресцентный краситель. Поскольку как специфические грунтовки M. chamomilla, так и C. nobile нацелены на внутреннюю транскрибированную область пространства 2 (ITS2), которая имеет десятки и сотни копий в геноме растения, 25 циклов усиления ПЦР достаточны для создания достаточного количества ампликонов для идентификации ромашковых видов. На рисунке 7значение Ct для положительного контроля M. chamomilla в идентификационном тесте M. chamomilla было менее 25 (GCP_GCT), в то время как после 25 циклов усиления флуоресценция того же контроля в C. nobile identification test была ниже порога обнаружения (GCP_RCT). С другой стороны, после 25 циклов флуоресценция положительного контроля C. nobile в идентификационном тесте M. chamomilla была ниже порога обнаружения (RCP_GCT), в то время как значение Ct для того же контроля в C. nobile идентификационный тест был менее 25 (RCP_RCT). Усиление целевого и нецелевого позитивного контроля в их соответствующих анализах свидетельствует о специфике анализа идентификации М. шамомиллы. Для образца ДНК, голова цветка поля и экстракт ДНК листьев дали Ct значения 15.18 и 19.41 в M. chamomilla идентификационный тест, соответственно (Sample1 (FLOWER)_GCT и Sample2 (LEAF)_GCT). Оба этих образца не были усилены в тесте на идентификацию C. nobile (Sample1(FLOWER)_RCT и Sample2 (LEAF) _RCT). Модели усиления обоих образцов соответствовали модели усиления положительного контроля M. chamomilla. Отрицательный контроль не был усилен как в тестах на идентификацию M. chamomilla, так и C. nobile (NC_GCT и NC_RCT), исключая возможность ложных срабатываний, вызванных загрязнением ПЦР. Для дальнейшего подтверждения специфического усиления в положительном контроле и образцах, фракции конечного продукта ПЦР из каждой колодец были запущены на 2% агарозного геля влаборатории (рисунок 8). Для идентификационного теста M. chamomilla оба образца поля дали ампликоны, работающие в том же положении, что и положительный контроль M. chamomilla с расчетным размером чуть выше 100 bp (теоретический размер 102 bp). Для теста на идентификацию C. nobile нецелеприемный вид C. nobile положительный контроль дал полосу между 50 и 100 bp, что вписывается в теоретический размер 65 bp. В остальных полосах движения не было никакого конкретного продукта усиления, что было согласовано с отсутствием флуоресцентного сигнала для этих скважин, как это наблюдалось в ходе полевых испытаний.
После усиления ПЦР был проведен анализ кривой плавления для оценки диссоциациательных характеристик двойной ДНК (dsDNA) во время нагрева. По мере того как температура ramped вверх во время окончательного цикла для анализа кривого расплава, увеличения в температуре причинили двойн-прядь amplicons dissociate. Интеркалирующий флуоресцентный краситель постепенно высвобождается в раствор, снижая интенсивность флуоресценции(рисунок 9A). Точка перегиба первой производной кривой была использована для определения температуры плавления (Tm)(рисунок 9B),которая зависит главным образом от длины фрагмента ДНК и содержания GC. Сочетание значения Ct с температурой плавления может повысить специфичность анализа qPCR. В текущем исследовании пик температуры плавления M. chamomilla положительного контроля ПЦР ампликона произошел на уровне 85,6 градусов по Цельсию (GCP_GCT), и он отличается от пика температуры плавления C. nobile положительный контроль ПЦР ампликона на 79,1 градусов по Цельсию (RCP_RCT). ПЦР-ампликсон из головы и листьев полевых цветов достиг пиков температуры плавления на уровне 85,2 градусов по Цельсию и 84,8 градусов по Цельсию, соответственно (Sample1 (FLOWER)_GCT и Sample2 (LEAF)_GCT). Для оценки колебаний температуры плавления, измеренных портативной системой qPCR, были собраны дополнительные точки данных, чтобы подтвердить, что температура плавления образца всегда была близка к температуре плавления, полученной от положительного контроля M. chamomilla (в пределах 2 градусов по Цельсию) и была далека от температуры плавления C. nobile положительного контроля amplicon (Рисунок 10). Пики температуры плавления иногда сообщалось в других скважинах. Тем не менее, их значения Ct были не менее 25 и пики температуры плавления не были близки к M. chamomilla или C. nobile положительный контроль (более 2 градусов по Цельсию друг от друга).
Таким образом, тест на идентификацию поля M. chamomilla может быть интерпретирован на основе правил принятия решений, обобщенных в таблице 5. При всех положительных контролях положительный результат тестирования для опоясвляемого ботанического вида, отрицательный для других видов, и отрицательный контроль тестирования отрицательный, оба образца поля были определены, чтобы содержать M. chamomilla, но не C. nobile. Кроме того, для согласования результатов полевых испытаний с другими аналитическими методами выводы на местах были дополнительно подтверждены ранее проверенным методом штрихкодированияДНК 25 (данные не показаны).
Рисунок 1: Морфологическая идентификация ботанических материалов. (A) Хибискус роза-sinensis цветы, корни куркумы лонга, Мальва Сильвестрс листья, Росмарина officinalis листья, Семена кориандра sativum, Цингибер officinale корни. (B) Петроселин хрустящий и apium graveolens хлопья трудно дифференцировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Химическая идентификация ботанических материалов. (A)инструмент HPTLC и репрезентативная хроматограмма HPTLC. (B)инструмент HPLC и репрезентативная хроматограмма HPLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Matricaria chamomilla и Chamaemelum nobile в поле. (A) Matricaria chamomilla, адаптированная из Википедии под CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, адаптированный из Википедии под CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сбор частей растения M. chamomilla с поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Макет испытательных скважин в демонстрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Полевой экстракт ДНК в трубках сбора. Ботаническая ткань остается в оригинальной трубке и покрыта желтоватым экстрактом ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Флуоресценция участок, показывающий накопление продуктов ПЦР в течение 25 циклов термоциклинг. Положительный контроль M. chamomilla и положительный контроль C. nobile показывают значения Ct менее 25 в идентификационных тестах M. chamomilla и C. nobile соответственно. Образцы полевого цветка и листьев были усилены идентификационный тест M. chamomilla со значениями Ct 15.18 и 19.41. Остальные скважины не были усилены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Гель электрофорез полевых продуктов усиления ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Анализ температуры плавления. (A)Сигнал флуоресценции в каждой хорошо уменьшается с повышением температуры. (B)Идентичность продуктов ПЦР была подтверждена пиком температуры плавления в анализе кривой плавления. Образцы полевых цветов и листьев показывают пики на уровне 85,2 градусов по Цельсию и 84,8 градусов по Цельсию. Они близки к пику производства M. chamomilla положительный контроль. Положительный контроль C. nobile достиг пика в 79,1 градусов по Цельсию, что отличается от трех других образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10: Пиковое изменение температуры плавления между положительным контролем и образцами поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Этапе | Цикл | Температура | Время |
| Постоянная температура | 1 | 95 КК | 60-е годы |
| Усиления | 25 | 95 КК | 30-е годы |
| 60 КК | 30-е годы | ||
| Кривая плавления | 1 | 60 КК | Рамп 0,05 градусов по Цельсию/с |
| 95 КК |
Таблица 1: условия термоциклов qPCR для идентификационных тестов M. chamomilla и C. nobile.
| Анализа | Название праймера | Последовательность 5'-3' | Позиции | Регионе | Размер Ампликсона | |
| Матрикария рекупита | ЗЛ3 | TCGTCGGTCGCAAGGATAAG | Вперед | ITS2 | 102 б.п. | |
| ЗЛ4 | ТАААКТКАГКГГТАГТКК | Обратный | ||||
| Chamaemelum нобиле | ЗЛ11 | TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA | Вперед | ITS2 | 65 б.п. | |
| ЗЛ12 | TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC | Обратный | ||||
Таблица 2: Праймер пары для M. chamomilla и C. nobile идентификационных тестов.
| Ну позиции | Ну имя | Описание | |
| 1 | GC_PosCtrl_GC_Test | Немецкий положительный контроль ромашки под тестом GC | |
| 2 | GC_PosCtrl_RC_Test | Немецкий ромашка положительный контроль в рамках RC испытаний | |
| 3 | RC_PosCtrl_GC_Test | Римская ромашка положительный контроль под GC испытаний | |
| 4 | RC_PosCtrl_RC_Test | Римская ромашка положительный контроль под RC испытаний | |
| 5 | Field_Sample_GC_Test | Образец листовой ткани в рамках GC Test | |
| 6 | Field_Sample_RC_Test | Образец листовой ткани в соответствии с тестом RC | |
| 7 | Field_Sample_GC_Test | Образец цветочной ткани в рамках теста GC | |
| 8 | Field_Sample_RC_Test | Образец цветочной ткани в соответствии с тестом RC | |
| 9 | NegCtrl_GC_Test | Отрицательный контрольный образец в соответствии с тестом GC | |
| 10 | NegCtrl_RC_Test | Отрицательный контрольный образец в соответствии с тестом RC | |
Таблица 3: Ну типов и описаний для M. chamomilla и C. nobile идентификационных тестов.
| Реагента | GC_Test | RC_Test |
| Универсальный qPCR Микс | 10 йл | 10 йл |
| Грунтовка L3 (10 МКМ) | 0,4 мл | Na |
| Грунтовка L4 (10 МКМ) | 0,4 мл | Na |
| Грунтовка L11 (10 МКМ) | Na | 0,4 мл |
| Грунтовка L12 (10 МКМ) | Na | 0,4 мл |
| H2O (без нуклеазы) | 7,2 мл | 7,2 мл |
| Содержит Hot Start Taq ДНК полимеразы | ||
Таблица 4: Мастер-микс композиция для M. chamomilla и C. nobile идентификационных тестов.
| Ну имя | Ожидаемый результат | Критерии положительного результата | Критерии отрицательного результата |
| Обнаружено / Настоящее время | Не обнаружено / Отсутствует | ||
| GC_PosCtrl_GC_Test | Обнаружены | Ct Lt; 25 и 84 (lt) Тм (lt;) 86 | - |
| GC_PosCtrl_RC_Test | Не обнаружено | - | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| RC_PosCtrl_GC_Test | Не обнаружено | - | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| RC_PosCtrl_RC_Test | Обнаружены | Ct Lt; 25 и 79 Lt; Тм (lt;) 81 | - |
| Field_Sample_Leaf_GC_Test | Настоящее время | Ct Lt; 25 и 84 (lt) Тм (lt;) 86 | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| Field_Sample_Leaf_RC_Test | Отсутствует | - | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| Field_Sample_Flower_GC_Test | Настоящее время | Ct Lt; 25 и 84 (lt) Тм (lt;) 86 | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| Field_Sample_Flower_RC_Test | Отсутствует | - | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| NegCtrl_GC_Test | Не обнаружено | - | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
| NegCtrl_RC_Test | Не обнаружено | - | Нет значения Ct в течение 25 циклов |
Таблица 5: Правила интерпретации результатов qPCR.
Discussion
Проектирование грунтовок и выбор шаблонов являются важнейшими шагами в получении эффективного и специфического усиления qPCR. После определения подходящего шаблона, грунтовка дизайн программного обеспечения, как правило, используется для оказания помощи выбор грунтовки на основе переменных дизайна, таких как грунтовка длины, температура плавления, исодержание GC 33,34. Оптимизация и проверка могут быть выполнены в ожидаемых экспериментальных условиях анализа для обеспечения специфичности, чувствительности и надежности реакции ПЦР35. Субоптимальный дизайн грунтовки может привести к образованию грунтовки-димера, в результате чего взаимодействия грунтовки производят неспецифическиепродукты 36.
Нет шаблон управления (NTC), используемых в этом исследовании проверить как загрязнение ДНК и наличие грунтовки-димеры, которые могут повлиять на анализ. Результаты не показали никакого усиления, хороший признак того, что как загрязнение ДНК и грунтовки-димеры не являются проблемой. Загрязнение ДНК и грунтовки-димеры проявляются в кривых расплава без элементов управления шаблонами, а также в качестве дополнительных пиков в кривых расплава положительных элементов управления. Как правило, кривая расплава положительного контроля, как ожидается, будет содержать один пик, если БОГАТЫе AT субдомени в шаблоне вызывают неравномерное таяние. Двойные пики можно предсказать, имитируя анализы плавления с помощью программного обеспечения uMELT37. В этом исследовании, золотой стандарт запуска продукта ПЦР на агарозный гель был использован для подтверждения наличия целевого продукта ПЦР и отсутствие загрязнения и грунтовки-димеры.
Значительной проблемой в молекулярном анализе ботанического материала является получение высококачественной ДНК после ботанического процесса извлечения ДНК. Ботанические материалы торгуются и потребляются для активных химических соединений, которые связаны с пользой для здоровья. В процессе извлечения ДНК, эти химические соединения будут также выпущены в раствор извлечения ДНК, потенциально вызывая ингибирование ПЦР, тем самым приводя к сбоям в усилении ПЦР. Различные наборы очистки ДНК растений с использованием органических растворителей и колонн были разработаны для удаления химических соединений, полученных израстительных 38. Тем не менее, дым капот и высокоскоростные центрифуги, необходимые для оказания помощи эти комплекты не доступны в этой области.
В действующем протоколе упрощенный метод извлечения ДНК использует коммерческий набор для извлечения ДНК растений (подробнее см. таблицу материалов). Он имел способность нейтрализовать общие ингибирующие вещества для воспроизводимых результатов и производил последовательные результаты для M. chamomilla и C. nobile. И M. chamomilla и C. nobile цветочные головки и листья дали ПЦР ампликонов с конкретными пиками расплава, что свидетельствует о том, что наличие ингибиторов ПЦР не было проблемой. Для других растений с более высоким уровнем ингибиторов ПЦР, усиление ДНК в их первоначальной экстракции может быть менее эффективным. Для снижения ингибирования и повышения эффективности усиления, с доступом ко всему заводу, другие части растений с более низким содержанием полисахарида и полифенола также могут быть использованы для целей идентификации. Если есть ограниченный доступ к различным частям растений, молодые листья или лепестки, расчлененные из цветочных голов, которые, как правило, имеют более низкоесодержание фенола 39, может предложить больше шансов на успех. Так как последовательности ДНК являются последовательными по всему растению, любая часть растения может быть использована для подтверждения идентичности вида. Если усиление ПЦР все еще неоптимальным, оригинальный экстракт ДНК может быть дополнительно разбавлен до ПЦР, или более сложные протоколы лабораторной очистки могут быть использованы.
Еще одной проблемой для анализа ПЦР являются ложноположимые результаты, вызванные загрязнением ДНК, что может негативно сказаться на интерпретации данных. Обычно он контролируется активным ведением домашнего хозяйства, использованием специального оборудования и ограничением работы в специально отведенных местах. Используя qPCR, весь анализ ПЦР может быть выполнен в закрытой системе, что значительно снижает вероятность загрязнения ПЦР ампликона в среде, которая недостаточно хорошо контролируется. Кроме того, экологическая ДНК также не должна показывать ложноположительный из-за специфики анализа, согласно предыдущему исследованию проверки40.
Есть возможности для совершенствования. В представленном здесь протоколе интеркалирование красителя использовалось для доказательства усиления фрагмента цели в режиме реального времени. Специфика метода подтверждается характерной температурой плавления, которая отличается между M. chamomilla и C. nobile amplicons. Таким образом, интеркалирование ПЦР на основе красителя может эффективно ответить на вопрос "Что это за вид растений?" в этой области. Однако, помимо необходимости проведения ботанической идентификации на одном заводе, изолированном от поля, во многих случаях ботанические порошки или экстракты на складе также выиграют от быстрой оценки личности на месте. Для этих типов материалов, дополнительные вопросы, возможно, должны быть рассмотрены, такие как "Что в этом материале?", "Содержит ли он ботанических видов я ищу?", "Есть ли в нем прелюбодеяния я хочу избежать?", И "Является ли он заменить полностью или частично других ботанических видов, которые являются вредными?". Вместо того, чтобы использовать интеркалирующий краситель, различные зонды qPCR могут быть предназначены для целевой ампликонов из различных растительных в одной системе реакции, сохраняя при этом высокую специфичность и эффективность анализа. Разработка зонда на основе qPCR и использование портативной системы qPCR, которая предлагает несколько обнаружения каналов, может еще больше расширить применение полевых испытаний в качестве пригодного для использования анализа в более широких условиях, таких как склады ботанических материалов и распределительные центры, чтобы ответить на более сложные вопросы. Кроме того, использование нескольких зондов также позволяет пользователю включать внутреннее усиление в каждую систему реакции, так что больше информации будет доступно, когда ПЦР ингибирование подозревается.
Представленный здесь протокол имеет следующие преимущества по сравнению с существующими технологиями, используемыми для той же цели. Во-первых, для традиционных методов морфологической и химической идентификации процедура и ее результаты должны проводиться и интерпретироваться экспертами. Идентификационные тесты на основе qPCR могут проводиться людьми с базовой молекулярной биологией и интерпретироваться более стандартизированным образом. Во-вторых, по сравнению с идентификацией и дифференциацией видов на основе qPCR, обычно выполняемой в лаборатории, протокол идентификации поля с использованием портативного инструмента не требует инструментов с большим следом, таких как высокоскоростная центрифуга, оборудование для оценки качества ДНК, тепловой циклер с детектором флуоресценции и компьютер, работающий под специальным программным обеспечением. Таким образом, идентификация видов на основе ДНК может быть выполнена в любой обстановке без промедления. В-третьих, поиск ботанических материалов является задачей, которая требует глобальной работы. С достижениями в области облачных сервисов и искусственного интеллекта, портативное устройство потенциально может получать методы, разработанные и проверенные экспертами в лаборатории, управляться не-экспертами в отдаленных районах, и производить объективные сертификаты от третьих сторон. Таким образом, этот вариант является более убедительным, чем когда-либо с удаленной работы становится тенденцией.
Таким образом, протокол здесь продемонстрировал поле идентификации М. chamomilla с помощью портативной системы qPCR. Успешное применение этого метода даст очень точные результаты по ботанической идентификации и поможет ботаническим производителям и поставщикам своевременно и экономически эффективно квалифицировать ботанические материалы.
Disclosures
Мы подтверждаем, что Чжэнсяу Ян, Чжэн Цюань, Тиффани Чуа, Лео Ли, Янцзюнь Чжан, Сильва Бабаджанян, Триша Чуа, Питер Чанг, Гэри Свонсон, Чжэнфэй Лу являются сотрудниками Herbalife International of America, Inc. Мы подтверждаем, что Франческо Буонджорно, Изабелла Делла Ноче и Лоренцо Коломбо являются сотрудниками Hyris Ltd., которая производит портативный инструмент qPCR, используемый в данной статье.
Acknowledgments
Мы благодарим Джеймса Шана за его усилия в области видеозаписи. Мы благодарим Джона Байрона и Мэтью Семерау за их работу в области редактирования видео. Мы благодарим Ансена Луо, Гарри Ду и Фрэнка Денга за поддержку в поиске испытательного поля. Мы благодарим Марию Рубинских за ценные комментарии по всей рукописи. Все признанные лица являются сотрудниками Herbalife International of America, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Battery | TNE | 78000mAh | Provide field power supply |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | Portable qPCR instrument |
| Cartridges(16 Well) | HYRIS | NA | Consumables for bCUBE |
| Electric pipette | Eppendorf | NA | Handling liquid |
| Extract-N-AmpTM plant PCR kit | SIGMA | XNAP2-1KT | Plant DNA extraction kit |
| German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials | AHP | 2264 | Used as positive control |
| Mini dry bath | Yooning | MiniH-100L | For DNA extraction |
| Nuclease-free water | AMBION | AM9937 | qPCR reaction |
| Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reaction |
| Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Used as positive control |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reaction |
References
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
