Summary
Presentert her er en protokoll for feltidentifikasjon av Matricaria kamille ved hjelp av et bærbart qPCR-system. Denne lett-å-utføre protokollen er ideell som en metode for å bekrefte identiteten til en botanisk art på steder der tilgangen til laboratorieutstyr og kompetanse er begrenset, for eksempel gårder og varehus.
Abstract
Kvalitetskontroll i botaniske produkter begynner med råvareforsyningen. Tradisjonelt utføres botanisk identifikasjon gjennom morfologisk vurdering og kjemiske analytiske metoder. Men mangelen på tilgjengelighet av botanikere, spesielt de siste årene, kombinert med behovet for å forbedre kvalitetskontroll for å bekjempe påkjenningene på forsyningskjeden forårsaket av økende etterspørsel etter forbrukere og klimaendringer, nødvendiggjør alternative tilnærminger. Målet med denne protokollen er å legge til rette for identifisering av botaniske arter ved hjelp av et bærbart qPCR-system på feltet eller i alle omgivelser, der tilgangen til laboratorieutstyr og ekspertise er begrenset. Target DNA forsterkes ved hjelp av fargebasert qPCR, med DNA hentet fra botaniske referansematerialer som fungerer som en positiv kontroll. Målet DNA identifiseres ved sin spesifikke forsterkning og matcher sin smeltetopp mot den positive kontrollen. En detaljert beskrivelse av trinnene og parameterne, fra praktisk feltprøveinnsamling, til DNA-ekstraksjon, PCR-forsterkning, etterfulgt av datatolkning, er inkludert for å sikre at leserne kan replikere denne protokollen. Resultatene produsert i tråd med tradisjonelle laboratorie botaniske identifikasjonsmetoder. Protokollen er enkel å utføre og kostnadseffektiv, slik at kvalitetstesting på råvarer så nær opprinnelsesstedet til forsyningskjeden som mulig.
Introduction
Praksisen med å bruke planter til å opprettholde og forbedre helsen dateres tilbake til tusenvis av år. På grunn av påkjenninger på forsyningskjeden brakt av økt forbrukeretterspørsel1, uholdbar høsting praksis og klimaendringer2, botanisk utroskap blir en økende bekymring i mat og kosttilskudd industrien3. Tilstedeværelsen av ikke-deklarerte eller feilidentifiserte botaniske arter kan føre til redusert effekt, eller til og med sikkerhetsproblemer. For eksempel kan svart cohosh (Actaea racemosa), som brukes til behandling av premenstruelt ubehag, erstattes med en rimelig asiatisk art med begrenset klinisk datastøtte for effekten4. I et mer alvorlig tilfelle førte substitusjon av Aristolochia fangchi for Stephania terandra i en klinisk studie for vekttap ved hjelp av kinesiske urter til alvorlig nefrotoksisitet og nyresvikt hos noen deltakere5,6. De to forskjellige artene delte et kinesisk fellesnavn "Fang Ji". Disse sakene understreker behovet for strengere kvalitetskontroll, og starter med identifiseringav råvarer 7, helst så nær opprinnelsesstedet til forsyningskjeden som mulig, slik at ressursene effektivt kan allokeres til materialet av riktig identitet.
En rekke ortogonale tilnærminger kan brukes til botanisk identifikasjon. Tradisjonelt utføres botanisk identifikasjon gjennom morfologisk vurdering8,,9 og kjemiske analytiske metoder10,,11,,12,,13. Morfologisk identifikasjon er basert på forskjeller i makroskopiske og mikroskopiske egenskaper av plantematerialer hvis det finnes forskjeller (figur 1). Men mangelen på treningsprogrammer på klassisk botanikk de siste årene har resultert i mangel på eksperter14, noe som gjør denne tilnærmingen upraktisk for rutinemessig kvalitetskontroll. Dens anvendelse i pulveriserte botaniske materialer er også begrenset. Kjemiske analytiske metoder er mye brukt i farmakokineier og laboratorier, men er ikke ideelle for felttesting på grunn av størrelsen på instrumenter som høy ytelse tynn lag kromatografi (HPTLC), høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) og nuclear magnetic resonans spektroskopi (NMR) (figur 2) og miljøkrav. Nylig har genomiske metoder dukket opp som en alternativ teknikk for botaniske arters autentisering og substitusjonsdeteksjon og har vist seg å være effektiv og presis. Genomiske metoder utnytte høy troskap og spesifisitet av genetisk informasjon iplantematerialer 15,16,17,18,19. Molekylære diagnostiske verktøy er tilgjengelige i form av bærbare enheter, og inkluderer ofte automatiserte datatolkningsverktøy som senker barrieren mot teknologibruk, noe som gjør denne tilnærmingen ideell forfeltidentifikasjon 20,,21,,22,,23,,24. Når molekylær analysemetoden er designet ogvalidert 25,,26,27,kan den utføres av ethvert personell med grunnleggende molekylærbiologitrening. Blant de forskjellige bærbare verktøyene som er tilgjengelige, er sanntids-PCR på DNA-sekvenser en av de kostnadseffektive valgene28. Kombinasjonen av en bærbar enhet, sammen med tilpasset og validert molekylær analyse, tillater verifisering av botaniske arter og ingredienser utenfor laboratoriet, for eksempel i gårder og botaniske materiallagre, noe som reduserer tid og kostnader forbundet med tradisjonelle metoder.
Målet med denne protokollen er å innføre en metode for botanisk identifisering i situasjoner der tilgang til laboratorieutstyr og ekspertise er begrenset eller utilgjengelig, ved hjelp av et bærbart qPCR-system. Metoden er demonstrert på et felt av Matricaria kamille (Figur 3A), kjent som tysk kamille, mye brukt for sine antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper29. Det kan forveksles med relaterte arter med lignende utseende eller lukt, spesielt fra slekten Chamaemelum, Tanacetumog Chrysanthemum30,31,32. Blant de relaterte artene, Chamaemelum nobile, også kjent som romersk kamille, er en merkbar en med sammenlignbare produksjonsnivåer i handel (Figur 3B). Metoden demonstrert ble designet for å ikke bare identifisere målet botaniske arter M. kamille, men også oppdage sin nære slektning, C. nobile, basert på spesifikk forsterkning av DNA-sekvenser.
Denne artikkelen forklarer i detalj hvordan du utfører felt botanisk identifikasjon av M. kamille ved hjelp av intercalating fargestoffbasert qPCR og smeltekurve analyse på en bærbar enhet. Protokollen inkluderer innsamling av botaniske prøver fra feltet, DNA-ekstraksjon på stedet, og satt opp av sanntids PCR-reaksjon. For å sikre en gyldig konklusjon brukes mål botanisk m. kamille og ikke-mål botanisk C. nobile genomisk DNA, pre-ekstrahert fra sertifiserte botaniske referansematerialer, som positiv kontroll. Spesifisiteten av denne metoden er demonstrert ved å utføre både M. kamille og C. nobile identifikasjonstester individuelt på prøver og kontroller. Negativ kontroll som ikke er mal, brukes til å utelate falske positive resultater forårsaket av PCR-kontaminering.
Protocol
1. Eksempelsamling
- Sett opp et testområde i feltet med en flat og horisontal overflate.
- Identifiser en representativ plante som gjenspeiler egenskapene til de fleste plantene i kamilleblomstfeltet (figur 4).
- Velg et blomsterhode fra den representative planten ved hjelp av sterile hansker.
- Plasser prøven i et 2,0 ml oppsamlingsrør.
- Gjenta trinn 1,3 til 1,4 og samle et pakningsvedlegg (ca. 0,5–0,7 cm lang) fra samme plante.
MERK: M. kamilleblomst og blad er små nok til å sitte nederst på et 2,0 ml oppsamlingsrør. For andre planter med større overflateareal, kan en papirpunsj eller saks (skylles i 70% etanol før bruk) brukes til å isolere vevsprøver for testing. Når det er behov for flere prøvetakinger, skyll papirpuns eller saks mellom håndtering av forskjellige prøver.
2. DNA-ekstraksjon
- Forvarm det tørre badet inkubatoren til 95 °C.
- Til hvert oppsamlingsrør legger du til 100 μL av avsugsløsningen fra plante-DNA-ekstraksjonssettet (oppført i Materials tabell). For bedre DNA ekstraksjon effektivitet, male vevsprøven i ekstraksjonsløsningen ved hjelp av en vevsskadedyr.
- Lukk røret. Sørg for at det botaniske vevet er dekket med ekstraksjonsløsningen gjennom hele ekstraksjonsprosessen.
- Plasser oppsamlingsrørene i en forvarmet tørrbad inkubator og inkuber oppsamlingsrørene ved 95 °C i 10 min.
- Etter 10 min, ta rørene ut av det tørre badet inkubatoren.
- Tilsett 100 μL av fortynningsløsningen fra samme DNA-avsugssett og bland oppløsningen ved å pipesett opp og ned flere ganger.
- Gjenta det samme trinnet for pakningsvedksjon.
- Rist for å blande løsningen videre. Plantevevet ser vanligvis ikke ut til å bli degradert etter denne behandlingen. Den flytende fargen kan endres og bli overskyet.
MERK: Den fortynnede oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur over natten hvis den ikke fortsetter umiddelbart. Det er ikke nødvendig å fjerne cellulære rester fra plantevev før lagring. Væsken i rørene inneholder DNA-malene for nedstrøms PCR-forsterkning.
3. Oppsett av PCR-reaksjon
- Konfigurer termocyklopforholdene for qPCR-instrumentet i henhold til produsentens spesifikasjoner. Påfør PCR termocykliseringsprofilen som er oppført i (tabell 1), som starter med et konstant temperaturtrinn for innledende denning, etterfulgt av 25 sykluser med forsterkning, og slutter med temperaturrampe for å oppnå en smeltekurve med høy oppløsning.
- Tin qPCR Master Mix og primere (tabell 2) ved romtemperatur før bruk.
- Planlegg reaksjonen som skal lastes i hver brønn: brønner som inneholder positiv kontroll med målarter, positiv kontroll med ikke-målarter, prøver og negativ kontroll (figur 5).
- I dette eksemplet brukes ti brønner – fem for den tyske kamilleidentifikasjonstesten og de resterende fem for den romerske kamilleidentifikasjonstesten. For hver type artsidentifikasjonstest inneholder en brønn positiv kontroll med DNA hentet fra målrettede arters referansemateriale, en brønn inneholder positiv kontroll med DNA hentet fra ikke-målrettede arters referansemateriale, to brønner er fylt med blomst og blad DNA-prøver hentet fra feltet, og en brønn er allokert for en negativ kontroll. Tabell 3 beskriver hver brønntype.
- Forbered en reaksjon master-mix i henhold til manualen for hver botaniske arter identifikasjon test. En typisk reaksjon master-mix inneholder universell qPCR Master Mix (2x), fremover og omvendt arter-spesifikke primere, og kjerner-fritt vann. Tabell 4 viser reaksjonssystemsammensetningen.
MERK: Hvis du ikke bruker umiddelbart, må qPCR-reaksjonsstandardblandingen oppbevares ved +2 °C til +8 °C i en kjøler eller et minikjøleskap. - Bland reaksjonsmesterblandingen grundig ved å pipettering før bruk.
- Plasser qPCR-patronen med forsiden opp på et flatt og stabilt underlag.
- Legg 18 μL av reaksjonsstandardblandingen som er konfigurert i trinn 3,4 i patronbrønnene i henhold til brønnene som er definert i trinn 3.3. For denne demonstrasjonen, legg til den tyske kamilleidentifikasjonstestreaksjonsstandardblandingen i brønner merket for GC-test (GCT i brønner 1, 3, 5, 7, 9) og den romerske kamilleidentifikasjonstesten masterblanding i brønner merket for RC-test (RCT i brønner 2, 4, 6, 8, 10) (se figur 5).
- Overfør 2 μL prøve-DNA fra supernatanten av DNA-ekstraksjonsrør og forhåndsut ekstrahert DNA-positive kontroller til patronbrønner forhåndslastet med qPCR master mix. Etter å ha lagt hver DNA-mal til qPCR master mix, bland forsiktig løsningen ved å pipettering.
MERK: Unngå flytende cellulært avfall ved overføring av DNA fra DNA-ekstraksjonsrøret. Bruk minicentrifuge for å skille overnatant og cellulær rusk, om nødvendig. - Forsegle patronen forsiktig med selvklebende film. Legg sylinderampullen på termocyklerende kammer og lukk den.
- Angi at qPCR-instrumentet skal kjøres.
Representative Results
Etter protokollen beskrevet i avsnitt 1 ble botanisk DNA fra blomsterhode og blad ekstrahert inn i det overnaturlige etter varmeinkubasjon av oppsamlingsrøret ved 95 °C i 10 min. I den nåværende studien viste supernatanten en gul og grønn farge for både blomst og blad, noe som indikerer at en rekke naturlige forbindelser ble sluppet ut i det overnaturlige med botanisk DNA (figur 6). Selv om pålitelig PCR-forsterkning ble oppnådd senere i triplikate for alle feltutvunnet DNA-mal, ble DNA-kvalitetsvurdering utført i laboratoriet som referanse. Konsentrasjonen av dnaekstrakt av blomsterhoder, bestemt av fluorometri, varierte fra 3,69–5,36 ng/μL, mens konsentrasjonen av blad-DNA-ekstrakt varierte fra 6,42–9,29 ng/μL. A260/A280 og A260/A230 absorbansforhold av blomst og blad DNA ekstrakter ble målt ved spektrometri. Men på grunn av overlappingen mellom DNA og fytokjemisk UV-absorpsjonsspektrum, kunne disse forholdene ikke måles pålitelighet (data vises ikke).
Intercalating fluorescerende fargestoff ble brukt til å overvåke forsterkning av målfragmenter i sanntid. Siden både de spesifikke primerne M. kamille og C. nobile retter seg mot den interne transkriberte spacer 2 (ITS2)-regionen, som har titalls til hundrevis av kopier i plantegenomet, er 25 PCR-forsterkningssykluser tilstrekkelige til å generere nok amplicons for identifisering av kamillearter. I figur 7var Ct-verdien for M. kamille positiv kontroll i M. kamilleidentifikasjonstest mindre enn 25 (GCP_GCT), mens etter 25 forsterkningssykluser var fluorescensen av samme kontroll i C. nobile identifikasjonstest under deteksjonsterskelen (GCP_RCT). På den annen side, etter 25 sykluser, var fluorescensen for C. nobile positiv kontroll i M. kamilleidentifikasjonstest under deteksjonsterskelen (RCP_GCT), mens Ct-verdien for samme kontroll i C. nobile identifikasjonstest var mindre enn 25 (RCP_RCT). Forsterkningen av mål- og ikke-målrettede positive kontroller i sine respektive analyser viser spesifisiteten til M. kamilleidentifikasjonsanalysen. For prøve-DNA ga feltblomsthodet og blad-DNA-ekstraktet Ct-verdier på henholdsvis 15,18 og 19,41 i M. kamilleidentifikasjonstest (henholdsvis Sample1(FLOWER)_GCT og Sample2(LEAF)_GCT). Begge disse prøvene ble ikke forsterket i C. nobile identifikasjonstest (Sample1 (FLOWER) _RCT og Sample2 (LEAF) _RCT). Forsterkningsmønstrene til begge prøvene matchet forsterkningsmønsteret til M. kamillepositiv kontroll. Negative kontroller ble ikke forsterket i både M. kamille- og C. nobileidentifikasjonstester (NC_GCT og NC_RCT), unntatt muligheten for falske positiver forårsaket av PCR-kontaminering. For ytterligere å bekrefte spesifikk forsterkning i positive kontroller og prøver, ble fraksjoner av PCR-sluttprodukt fra hver brønn kjørt på 2% agarose gel i laboratoriet (figur 8). For M. chamomilla identifikasjonstest ga begge feltprøvene amplicons som kjører i samme posisjon som M. kamille positiv kontroll med en estimert størrelse litt over 100 bp (teoretisk størrelse 102 bp). For C. nobile identifikasjonstest ga ikke-målarter C. nobile positiv kontroll et bånd mellom 50 og 100 bp, som passet den teoretiske størrelsen på 65 bp. Resten av banene viste ingen spesifikk forsterkningsprodukt, som var i samsvar med fraværet av fluorescerende signal for disse brønnene, som observert i felttesting.
Etter PCR-forsterkning ble det utført en analyse av smeltekurve for å vurdere dissosiasjonsegenskapene til dobbelttrådet DNA (dsDNA) under oppvarming. Etter hvert som temperaturen økte i løpet av den siste syklusen for analyse av smeltekurve, førte temperaturøkningene til at de dobbelttrådsamplikonene tok avstand. Den intercalating fluorescerende fargestoff ble gradvis sluppet inn i løsningen, redusere fluorescens intensitet (Figur 9A). Bøyningspunktet for den første derivatkurven ble brukt til å bestemme smeltetemperaturen (Tm) (figur 9B), som hovedsakelig avhenger av DNA-fragmentlengde og GC-innhold. Kombinere Ct verdi med smeltetemperatur kan øke spesifisiteten av qPCR analyse. I den nåværende studien forekom smeltetemperaturtoppen på M. kamille positiv kontroll PCR amplicon ved 85,6 °C (GCP_GCT), og den var forskjellig fra smeltetemperaturtoppen på C. nobile positiv kontroll PCR amplicon ved 79,1 °C (RCP_RCT). PCR-ampliconen fra feltblomsthodet og bladet produserte smeltetemperaturtopper på henholdsvis 85,2 °C og 84,8 °C (henholdsvis Sample1(FLOWER)_GCT og Sample2(LEAF)_GCT). For å vurdere smeltetemperaturvariasjoner målt ved det bærbare qPCR-systemet, ble det samlet inn flere datapunkter for å bekrefte at prøvesmeltetemperaturen alltid var nær smeltetemperaturen oppnådd fra M. kamillepositiv kontroll (innen 2 °C) og var langt borte fra smeltetemperaturen til C. nobile positiv kontrollamlikon (figur 10). Smeltetemperaturtopper ble noen ganger rapportert i andre brønner. Ct-verdiene deres var imidlertid ikke mindre enn 25, og smeltetemperaturtoppene var ikke i nærheten av M. kamille eller C. nobile positiv kontroll (mer enn 2 °C fra hverandre).
Oppsummert kan feltet M. chamomilla identifikasjonstest tolkes basert på beslutningsregler oppsummert i tabell 5. Med alle de positive kontrollene som testet positivt for de antatte botaniske artene, negative for de andre artene, og negative kontroller som testet negativt, ble begge feltprøvene fastslått å inneholde M. kamille, men ikke C. nobile. I tillegg, for å justere felttestresultater med andre analytiske teknikker, ble feltkonklusjoner ytterligere bekreftet av en tidligere validert DNA-barkodingsmetode25 (data som ikke vises).
Figur 1: Morfologisk identifisering av botaniske materialer. (A) Hibiscus rosa-sinensis blomster, Curcuma longa røtter, Malva Sylvestris blader, Rosmarinus officinalis blader, Coriandrum sativum frø, Zingiber officinale røtter. (B) Petroselinum crispum og Apium graveolens flak er vanskelig å skille mellom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kjemisk identifisering av botaniske materialer. (A) HPTLC-instrument og et representativt HPTLC-kromatrammet. (B) HPLC-instrument og et representativt HPLC-kromatrammet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Matricaria kamille og Chamaemelum nobile i feltet. (A) Matricaria kamille, tilpasset fra Wikipedia under CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, tilpasset fra Wikipedia under CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Innsamling av M. kamilleanleggsdeler fra feltet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Oppsett av testbrønner i demonstrasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Felt-DNA-ekstrakt i oppsamlingsrør. Botanisk vev forblir i det opprinnelige røret og er dekket av gulaktig DNA-ekstrakt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Fluorescensplott som viser akkumulering av PCR-produkter over 25 sykluser med termocykling. M. kamille positiv kontroll og C. nobile positiv kontroll viser Ct-verdier mindre enn 25 i M. kamille- og C. nobile-identifikasjonstester. Feltblomst- og bladprøvene ble forsterket av M. kamilleidentifikasjonstest med Ct-verdier på 15,18 og 19,41. Resten av brønnene ble ikke forsterket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Gelelektroforese av pcrforsterkningsprodukter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Analyse av smeltetemperatur. (A)Fluorescenssignalet i hver brønn reduseres med den økende temperaturen. (B)Identiteten til PCR-produktene ble bekreftet av smeltetemperaturtoppen i smeltekurveanalyse. Feltblomsten og bladprøvene viser topper ved 85,2 °C og 84,8 °C. Disse er nær toppen produsert av M. kamille positiv kontroll. C. nobile positiv kontroll produsert en topp på 79,1 °C, som er forskjellig fra de tre andre prøvene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Maksimal variasjon i smeltetemperatur mellom positiv kontroll og feltprøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Scenen | Syklus | Temperatur | Tid |
| Konstant temperatur | 1 | 95 °C | 60-tallet |
| Forsterkning | 25 | 95 °C | 30s |
| 60 °C | 30s | ||
| Smeltekurve | 1 | 60 °C | Rampe 0,05 °C/s |
| 95 °C |
Tabell 1: qPCR termocycling forhold for M. kamille og C. nobile identifikasjonstester.
| Analyse | Primer navn | Sekvens 5'-3' | Posisjon | Regionen | Amplicon Størrelse | |
| Matricaria recutita | ZL3 (andre personer) | TCGTCGGTCGCAAGGATAAG | Frem | DENS2 | 102 to år | |
| Zl4 (andre personer) | TAAACTCAGCGGGTAGTCCC LEILIGHET | Omvendt | ||||
| Chamaemelum nobile | Zl11 (andre personer) | TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA | Frem | DENS2 | 65 bp | |
| ZL12 (andre personer) | TCGAAGCGTCATTAAGACAAC | Omvendt | ||||
Tabell 2: Primer par for M. kamille og C. nobile identifikasjonstester.
| Godt posisjonering | Vel navn | Beskrivelse | |
| 1 | GC_PosCtrl_GC_Test | Tysk kamille positiv kontroll under GC Test | |
| 2 | GC_PosCtrl_RC_Test | Tysk kamille positiv kontroll under RC Test | |
| 3 | RC_PosCtrl_GC_Test | Romersk kamille positiv kontroll under GC Test | |
| 4 | RC_PosCtrl_RC_Test | Romersk kamille positiv kontroll under RC Test | |
| 5 | Field_Sample_GC_Test | Prøve av bladvev under GC Test | |
| 6 | Field_Sample_RC_Test | Prøve av bladvev under RC Test | |
| 7 | Field_Sample_GC_Test | Prøve av blomstervev under GC Test | |
| 8 | Field_Sample_RC_Test | Prøve av blomstervev under RC Test | |
| 9 | NegCtrl_GC_Test | Eksempel på negativ kontroll under GC-test | |
| 10 | NegCtrl_RC_Test | Eksempel på negativ kontroll under RC-test | |
Tabell 3: Brønntyper og beskrivelser for identifikasjonstester for M. kamille og C. nobile.
| Reagent | GC_Test | RC_Test |
| Universell qPCR-blanding* | 10 μL | 10 μL |
| ZL3 primer (10 μM) | 0,4 μL | Na |
| ZL4 primer (10 μM) | 0,4 μL | Na |
| ZL11 primer (10 μM) | Na | 0,4 μL |
| ZL12 primer (10 μM) | Na | 0,4 μL |
| H2O (Kjernefri) | 7,2 μL | 7,2 μL |
| * inneholder Hot Start Taq DNA Polymerase | ||
Tabell 4: Master-mix sammensetning for M. kamille og C. nobile identifikasjonstester.
| Vel navn | Forventet resultat | Positive resultatkriterier | Negative resultatkriterier |
| Oppdaget / tilstede | Ikke oppdaget / fraværende | ||
| GC_PosCtrl_GC_Test | Oppdaget | Ct < 25 og 84 <= Tm <= 86 | - |
| GC_PosCtrl_RC_Test | Ikke oppdaget | - | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| RC_PosCtrl_GC_Test | Ikke oppdaget | - | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| RC_PosCtrl_RC_Test | Oppdaget | Ct < 25 og 79 <= Tm <= 81 | - |
| Field_Sample_Leaf_GC_Test | Presentere | Ct < 25 og 84 <= Tm <= 86 | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| Field_Sample_Leaf_RC_Test | Fraværende | - | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| Field_Sample_Flower_GC_Test | Presentere | Ct < 25 og 84 <= Tm <= 86 | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| Field_Sample_Flower_RC_Test | Fraværende | - | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| NegCtrl_GC_Test | Ikke oppdaget | - | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
| NegCtrl_RC_Test | Ikke oppdaget | - | Ingen Ct-verdi innen 25 sykluser |
Tabell 5: Regler for qPCR resultattolkning.
Discussion
Utformingen av primere og malvalg er de avgjørende trinnene for å oppnå en effektiv og spesifikk qPCR-forsterkning. Etter å ha identifisert en passende mal, brukes primer designprogramvare vanligvis til å hjelpe valg av primere basert på designvariabler som primerlengde, smeltetemperatur og GC-innhold33,,34. Optimalisering og validering kan utføres under forventede eksperimentelle forhold i analysen for å sikre spesifisitet, følsomhet og robusthet av en PCR-reaksjon35. Sub-optimal primer design kan resultere i primer-dimer dannelse, hvor primer interaksjoner produsere ikke-spesifikke produkter36.
Ingen malkontroller (NTC) som brukes i denne studien, kontrollerer både DNA-kontaminering og tilstedeværelsen av primer-dimers som kan påvirke analysen. Resultatene viste ingen forsterkning, en god indikasjon på at både DNA-kontaminering og primer-dimers ikke er en bekymring. DNA-kontaminering og primer-dimers manifesteres i smeltekurver uten malkontroller, og som ekstra topper i smeltekurver av positive kontroller. Vanligvis forventes smeltekurven til en positiv kontroll å inneholde en enkelt topp, med mindre AT-rike underdomener i malen forårsaker ujevn smelting. Doble topper kan forutsies ved å simulere smeltende analyser ved hjelp av uMELT-programvaren37. I denne studien ble gullstandarden for å kjøre PCR-produktet på agarose gel brukt til å bekrefte tilstedeværelsen av mål-PCR-produkt og fravær av forurensning og primer-dimers.
En betydelig utfordring i botanisk materiale molekylær analyse er å skaffe god kvalitet DNA etter den botaniske DNA utvinning prosessen. Botaniske materialer handles og forbrukes for de aktive kjemiske forbindelsene som er forbundet med helsemessige fordeler. I prosessen med DNA ekstraksjon, disse kjemiske forbindelser vil også bli sluppet ut i DNA ekstraksjon løsning, potensielt forårsaker PCR hemming, og dermed resulterer i feil i PCR forsterkning. Ulike plante DNA rensing kits ved hjelp av organiske løsemidler og kolonner har blitt utviklet for å fjerne kjemiske forbindelser avledet fra planter38. Røykhette og høyhastighets sentrifuge som kreves for å hjelpe disse settene, er imidlertid ikke tilgjengelig i feltet.
I den gjeldende protokollen bruker den forenklede DNA-ekstraksjonsmetoden et kommersielt DNA-avtrekkssett for anlegg (se Materialseksjonstabell for detaljer). Det hadde evnen til å nøytralisere vanlige hemmende stoffer for reproduserbare resultater og ga konsistente resultater for M. kamille og C. nobile. Både M. kamille og C. nobile blomsterhoder og blader ga PCR amplicons med spesifikke smeltetopper, noe som indikerer at tilstedeværelsen av PCR-hemmere ikke var en bekymring. For andre planter med høyere nivåer av PCR-hemmere, forsterke DNA i sin opprinnelige utvinning kan være mindre effektiv. For å redusere hemming og forbedre forsterkningseffektiviteten, med tilgang til hele anlegget, kan andre plantedeler med lavere polysakkarid og polyfenolinnhold også brukes til identifikasjonsformål. Hvis det er begrenset tilgang til forskjellige plantedeler, yngre blader eller kronblad dissekert fra blomsterhoder, som vanligvis har lavere fenolisk innhold39, kan gi en bedre sjanse for suksess. Siden DNA-sekvenser er konsistente over hele anlegget, kan enhver plantedel brukes til å bekrefte artens identitet. Hvis PCR-forsterkning fortsatt er suboptimal, kan det opprinnelige DNA-ekstraktet fortynnes ytterligere før PCR, eller mer sofistikerte laboratorierenseprotokoller kan brukes.
En annen utfordring for PCR-analyse er falske positive resultater forårsaket av DNA-forurensning, noe som kan påvirke datatolkning negativt. Det styres vanligvis av aktiv rengjøring, ved hjelp av dedikert utstyr, og begrense arbeidet til utpekte områder. Ved hjelp av qPCR kan all PCR-analyse oppnås i et lukket system, noe som i stor grad reduserer sjansen for PCR ampliconforurensning i et miljø som ikke er godt kontrollert. Dessuten bør miljø-DNA heller ikke vise en falsk positiv på grunn av spesifisiteten av analysen, ifølge en tidligere valideringsstudie40.
Det er rom for forbedring. I protokollen som presenteres her, ble intercalating fargestoff brukt til å vise målfragmentforsterkning i sanntid. Spesifisiteten av metoden er ytterligere bekreftet av den karakteristiske smeltetemperaturen, som er forskjellig mellom M. kamille og C. nobile amplicons. Derfor kan intercalating fargestoffbasert PCR effektivt svare på spørsmålet "Hva er denne plantearten?" i feltet. Men i tillegg til behovet for å utføre botanisk identifikasjon på en enkelt plante isolert fra feltet, vil botaniske pulver eller ekstrakter på lageret også dra nytte av en rask identitetsvurdering på stedet. For disse materialtypene må det kanskje tas opp flere spørsmål, for eksempel "Hva er i dette materialet?", "Inneholder den den botaniske arten jeg leter etter?", "Inneholder den ekteskapstyv jeg vil unngå?", og "Er den erstattet helt eller delvis av andre botaniske arter som er skadelige?". I stedet for å bruke intercalating fargestoff, forskjellige qPCR sonder kan utformes for å målrette amplicons fra ulike planter i ett reaksjonssystem, samtidig opprettholde høy spesifisitet og effektivitet av analysen. Utvikling av sondebasert qPCR og utnyttelse av et bærbart qPCR-system som tilbyr flerkanalsdeteksjon, kan ytterligere utvide anvendelsen av felttesting som en egnet analyse til en bredere miljøinnstilling, for eksempel botaniske materiallager og distribusjonssentre for å svare på mer kompliserte spørsmål. I tillegg, ved hjelp av flere sonder også tillater brukeren å inkludere intern forsterkning i hvert reaksjonssystem, slik at mer informasjon vil være tilgjengelig når PCR hemming er mistenkt.
Protokollen som presenteres her har følgende fordeler sammenlignet med eksisterende teknologier som brukes til samme formål. For det første, for tradisjonelle morfologiske og kjemiske identifikasjonsmetoder, må prosedyren og resultatene utføres og tolkes av eksperter. qPCR-baserte identifikasjonstester kan utføres av personer med grunnleggende molekylærbiologitrening og tolkes på en mer standardisert måte. For det andre, sammenlignet med qPCR-basert artsidentifikasjon og differensiering som normalt utføres i laboratoriet, krever feltidentifikasjonsprotokollen ved hjelp av et bærbart instrument ikke instrumenter med et stort fotavtrykk, for eksempel en høyhastighets sentrifuge, DNA-kvalitetsevalueringsutstyr, termisk cycler med fluorescensdetektor og en datamaskin som kjører en spesiell programvare. Dermed kan DNA-basert artsidentifikasjon utføres i enhver setting uten forsinkelse. For det tredje er søk etter botaniske materialer en oppgave som krever en global operasjon. Med fremskritt innen skytjenester og kunstig intelligens kan en bærbar enhet potensielt motta metoder utviklet og validert av eksperter i laboratoriet, drives av ikke-eksperter i avsidesliggende områder og produsere objektive sertifiseringer fra tredjeparter. Derfor er dette alternativet mer overbevisende enn noensinne med eksternt arbeid blir trenden.
Oppsummert demonstrerte protokollen her feltidentifikasjon av M. kamille ved hjelp av et bærbart qPCR-system. Vellykket bruk av denne teknikken vil generere svært nøyaktige resultater på botanisk identifikasjon og hjelpe botaniske produsenter og leverandører kvalifisere botaniske materialer i tide og kostnadseffektiv måte.
Disclosures
Vi sertifiserer at Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu er ansatte i Herbalife International of America, Inc. Vi sertifiserer at Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce og Lorenzo Colombo er ansatte i Hyris Ltd. som produserer det bærbare qPCR-instrumentet som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi takker James Shan for hans innsats i feltvideoopptak. Vi takker Jon Byron og Matthew Semerau for deres arbeid med videoredigering. Vi takker Ansen Luo, Harry Du og Frank Deng for deres støtte til å finne testfeltet. Vi takker Maria Rubinsky for hennes verdifulle kommentarer til hele manuskriptet. Alle anerkjente personer er ansatte i Herbalife International of America, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Battery | TNE | 78000mAh | Provide field power supply |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | Portable qPCR instrument |
| Cartridges(16 Well) | HYRIS | NA | Consumables for bCUBE |
| Electric pipette | Eppendorf | NA | Handling liquid |
| Extract-N-AmpTM plant PCR kit | SIGMA | XNAP2-1KT | Plant DNA extraction kit |
| German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials | AHP | 2264 | Used as positive control |
| Mini dry bath | Yooning | MiniH-100L | For DNA extraction |
| Nuclease-free water | AMBION | AM9937 | qPCR reaction |
| Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reaction |
| Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Used as positive control |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reaction |
References
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M.
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
