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Summary
该协议介绍了化学活检方法的利用，然后对用于移植的肾移植进行质量评估的综合代谢和唇部分析。
Abstract
肾移植是全世界大量肾功能障碍患者的生命治疗。与传统透析相比，该手术与存活率的提高和患者生活质量的提高有关。令人遗憾的是，移植学缺乏可靠的器官质量评估方法。标准诊断技术仅限于宏观外观检查或侵入性组织活检，这些活检不能提供有关移植物的全面信息。拟议的方案旨在引入固相微萃取（SPME）作为综合代谢组学和脂肪分析的理想分析方法，用于对肾脏中所有用于移植的低分子化合物进行分析。SPME 探针体积小，可实现化学活检，无需任何组织收集即可直接从器官中提取代谢物。该方法的最小侵入性允许随着时间的推移执行多种分析：直接在器官采集后、保存过程中以及在接受者体内重新血管化之后。假设这种新颖的采样方法与高分辨率质谱仪相结合，将允许对一组特性化合物进行识别，这些化合物可以作为移植质量的生物标志物，并指示器官功能障碍可能发展。
Introduction
根据美国器官采购和移植网络，2019年美国有94，756名患者在等待肾脏移植;而在2018年，在欧洲，这个数字是10，791。每10分钟，有人被添加到国家移植等待名单在美国，估计每天有20人死亡等待移植1，2。,2肾移植是一种挽救生命的治疗，为世界各地大量的患有末期肾功能障碍的人。与传统透析相比，该手术与存活率提高和生活质量提高有关。
然而，移植面临着许多严重的问题，如器官短缺或缺乏有效的器官质量评估工具。标准方案仅限于宏观外观检查或侵入性组织活检，它们不能提供有关移植物质量的全面信息。虽然视觉评估允许识别眼睛可见的肿瘤、解剖异常或对移植物的广泛损伤，但这种方法是非常主观的，根据观察者的经验，其有效性各不相同。另一方面，活检可以提供关于预先存在的肾脏疾病的宝贵信息，因此被认为是一种客观和有证据的方法，在确定移植结果。然而，活检程序并非没有缺陷;有潜在的并发症的风险，如出血和额外的4-5小时的样品制备需要，这显著延长了冷缺血时间。因此，特别是在欧洲，直接组织分析的使用仅限于扩大标准捐赠者（ECD）和供者循环死亡后（DCD）3，4。3,4
代谢组学和唇部学最近被认为是有希望的方法，以更好地了解在器官保存过程中发生的生化途径的变化。代谢和唇膜分析能够监测系统对与器官切除有关的突然环境变化的即时反应，随后产生后果：缺血、氧化应激或炎症反应5、6、7、8。,7,85,肾脏是一个器官，在很大程度上与代谢过程有关，因此代谢物和脂质浓度的测量可能允许识别潜在的器官质量生物标志物，并更好地预测移植结果。
鉴于上述并发症和与当前器官质量评估方法相关的限制，需要一种侵入性较小的诊断解决方案，用于快速和复杂的器官质量评估。固相微萃取 （SPME） 符合这些要求，作为微创分析方法，能够覆盖广泛的代谢物和脂质。该技术基于将薄（±200μm），生物相容，钛镍合金探针覆盖选择性提取阶段覆盖到检查器官很短的时间。应该强调的是，SPME可以防止蛋白质提取，因此使得代谢抑制已经在样品采集阶段，这是一个显著的优势比替代方法。此外，该装置的小型化允许对器官,9、10、11,的少数结构进行重复和同时分析。
Protocol
所有动物都得到人道关怀，符合国家医学研究学会制定的"实验室动物护理原则"和加拿大安大略省国家卫生研究所发布的《实验室动物护理指南》。多伦多综合研究所动物护理委员会批准了所有研究。这项研究涉及人类主体，在托伦的比德戈什茨·尼古拉·哥白尼大学医学学院的生物伦理学委员会批准了这项研究。
注：获得相应道德委员会的批准。记得永远戴安全手套。请勿触摸 SPME 探头的提取阶段。建议使用停用的玻璃小瓶进行唇部分析。
1. 准备探头
- 准备涂有 7 mm 混合模式吸附剂的钛镍合金探头（40 毫米长;直径 0.2 mm）。探测数量取决于整个过程中的目标时间点和复制数（建议每个时间点 3 个）。
注：可根据研究模式、代谢物极性、样品基质等调整提取阶段的长度和类型。 - 准备由2：1氯仿：甲醇（v/v）组成的清洁混合物。将溶液的1.0 mL移至每个2.0 mL玻璃瓶，并放置一个探头，以前通过瓶盖刺穿，在每个小瓶中。
注：使用前，请清洁所有探头以清除污染颗粒。 - 将小瓶放在搅拌器上，将搅拌速度设置为 1，200 rpm。45 分钟后，停止设备，用 LC-MS 级水冲洗涂层。
- 由于涂料必须经过预处理步骤才能激活它们，因此准备由 1：1 甲醇：水（v/v）组成的预置混合物。将溶液的1.0 mL移至每个2.0 mL玻璃瓶，并放置一个探头，以前通过瓶盖刺穿，在每个小瓶中。
- 将小瓶放在涡流搅拌器上，将搅拌速度设置为 1，200 rpm。
- 60 分钟后，停止搅拌器，用 LC-MS 级水冲洗涂层。
- 根据标准手术设备灭菌方案对探头进行灭菌。
2. 提取
- 在取样前打开无菌包装，以确保无菌环境。
- 在每个时间点将两个探针直接插入肾脏皮层 10 分钟。涂层的整个长度必须由组织基体覆盖;不需要特定角度，但通常使用约 90 度。
注：整个医疗程序遵循给定机构的标准规程。不考虑修改有关 SPME 采样。该过程涉及以下六个采样时间点：
a） 肾切除前，由供体在体内;
b）-e） 1小时、3小时、5小时、7小时肾灌注、器官室外体;
f） 再灌注后，从接受者体内。 - 将探针从组织中拉出，然后用 LC-MS 级水冲洗涂层，以清除涂层表面剩余的血液。冲洗远离手术现场，并立即删除探头。
3. 运输和储存
- 将探头放在单独的小瓶中并关闭它们。
- 将小瓶放在装满干冰的发泡胶盒中或液氮中运输。
- 将样品存放在冰柜 （-80 °C） 中，或立即开始脱吸步骤。
4. 脱吸
- 准备由80：20乙酰胺：水（v/v）组成的脱吸溶液进行代谢分析，1：1异丙醇：甲醇（v/v）用于脂肪分析。
- 管道100μL溶液插入放入2.0 mL标签小瓶，并放置一个探头，以前刺穿盖，在每个小瓶。
- 将小瓶放在涡流搅拌器上，将搅拌速度设置为 1，200 rpm，持续 120 分钟。
- 从小瓶中拆下探头。获取的提取现已准备好进行工具分析。
5. LC-MS 分析
- 将含有提取物的小瓶放在 LC-MS 系统的自动采样器中。
注：本研究采用液相色谱（RP、HILIC）和高分辨率质谱仪和轨道rap质量分析仪。有关代谢分析参数，请转到步骤 5.2。有关唇部分析参数，请转到步骤 5.6。 - 使用五氟苯基 （PFP） 列（2.1 毫米 x 100 毫米，3 μm）进行反相分离。
- 将流速设置为 300 μL/min，自动采样器和柱温度分别设置为 4 °C 和 25 °C。
- 根据以下比例准备移动相：移动阶段 A：水：甲酸（99.9：0.1，v/v）和移动相 B：乙酰三叶酸：甲酸（99.9：0.1，v/v）。根据以下参数设置移动相流：启动移动相流（0-3分钟）：100% A，然后是线性梯度至 10% A（3-25 分钟），以 10% A 至 34 分钟不等的等式流，然后是 6 分钟的柱重新平衡时间。
- 对于 HILIC 分离，请使用 HILIC 柱（2.0 毫米 x 100 毫米、3 μm、200A）。将流速设置为 400 μL/min。
- 根据以下比例准备移动相：移动阶段A：醋酸铵缓冲液（9：1，v/v，有效盐浓度20 mM），移动阶段B：乙酰三酯：醋酸铵缓冲液（1：1，v/v，有效盐浓度20 mM）。
- 根据以下参数设置移动相流：以 100% A 启动移动相流（0-3 分钟），保持 3.0 分钟，然后在 5 分钟内向 100% B 移动。保持 100% B 直到 12 分钟，然后是 8 分钟的柱重新平衡时间。
- 将扫描范围设置为 85-1000 m/z。将 HESI 离子源参数设置为正电离模式：喷压电压 1，500 V，毛细管温度 300 °C，护套气体 40 a.u.，辅助气体流速 15 a.u.，探头加热器温度 300 °C，S-Lens RF 级别 55%。
- 运行由每个分析样品的 10 μL（定期，每 10-12 个样本）组成的 QC 样品，以监控仪器性能。
- 对于反向相位分离，请使用 C18 柱（2.1 毫米 x 75 毫米，3.5 μm）。
- 将流速设置为 200 μL/min，自动采样器和柱温度分别设置为 4 °C 和 55 °C。根据以下比例准备移动相：移动阶段：H2O：MeOH（60：40，v/v），10 mM醋酸铵和1 mM醋酸;移动阶段B：IPA：MeOH（90：10，v/v），10 mM醋酸铵和1mM醋酸。
- 根据以下参数设置移动相流：0-1 分钟（20% B）、1-1.5 分钟（20-50% B）、1.5-7.5 分钟（50-70% B）、7.5 13分钟（70-95%B），13-17分钟（95%B），17-17.1分钟（95-20%B），17.1-23分钟（20%）。
- 对于 HILIC 分离，请使用 HILIC 列（100 x 2.1 mm，3 μm）。
- 将流速设置为 400 μL/min，自动采样器和柱形温度分别设置为 4 °C 和 40 °C。
- 按照以下比例准备移动阶段：移动阶段 A：ACN;移动阶段B：水中5mM醋酸铵。根据以下参数设置移动相流：0-2 分钟（96% B）、2-15 分钟（96-80% B）、15-15.1 分钟（80-96% B）、15.1-21 分钟（96% B）。
- 设置正电离模式下的 HESI 离子源参数，喷电压 3，500 V，毛细管温度 275 °C，护套气体 20 a.u.，辅助气体流速 10 a.u.，探头加热器温度 300 °C，S-Lens RF 级别 55%。
- 运行由每个分析样品（每 10-12 个样本）的 10 μL 组成的 QC 样品，以监控仪器性能。
- 在与仪器兼容的软件中执行数据采集。
6. 数据分析
- 使用专用于非目标代谢组学和唇部分析的软件，执行数据处理、预测识别和统计分析。
注：可以获取主要组件分析 （PCA） 和盒式图形图，以可视化数据结构。
Representative Results
样品收集根据上述SPME方法执行，使用涂有7毫米混合模式提取相的探头。采样直接从移植组织（移植前体内），在1小时、3小时、5小时和7小时灌注后在肾腔内进行活体，在接受者再血管化后在体内进行。使用液相色谱（RP、HILIC）和高分辨率质谱法进行非目标元代谢和唇部分析，质量分析仪以正电离模式进行。为了评估数据质量并获得有关结果的一般见解，数据进行了主要组件分析 （PCA）。如图1 所示，QC样本形成了一个紧密的集群，证实了分析的质量。研究组表现出相对良好的分离，允许可视化在移植前和之后，以及器官灌注期间代谢和唇部特征的差异（图2）。SPME 采样允许器官随着时间的推移进行代谢分析。选定代谢物的盒式标记图有助于在整个实验中说明代谢物水平的变化（图3）。图 4 中显示了在 RP 和 HILIC 列上分离的提取 要素的宽范围。
图1：主要成分分析，显示甲胺基反相（A）、HILIC（B）和唇部反相（C）、HILIC（D）分析的质量控制样品聚类。在非目标分析中，质量控制是必要的，以监测工具不稳定引起的任何可能的变化。严格的QC样品集群确保观察到的所有变化都是生物来源的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：主要成分分析显示特定采样点之间的代谢（A）和唇部（B）差异。使用SPME-LC-HRMS对肾脏进行非目标分析，可在其保存的后续步骤中观察器官的生化差异。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：选定化合物的盒式，显示代谢物（A、B）和脂质（C，D）在近移植期间的变化。在选择和鉴定鉴别化合物盒-威士忌图后，能够监测这些化合物在协议后续步骤中水平的变化，并比较受不同保存协议或从不同捐赠者（如心脏死亡后心跳的捐赠者或捐赠者）采集的器官中的代谢物水平。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 4：LC-MS 分析通过 （A） 反相和 （B） HILIC 分离获得的要素的离子图（m/z 与保留时间）。该图能够估计通过建议的协议获得的要素总数（从提取到检测），并基于极性评估分析图覆盖范围。 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
对医生来说，对器官质量的评估仍然是一个很大的挑战，他们必须就一个器官是否可行或是否必须被丢弃作出快速知情的决定。多种因素，如供体年龄、缺血持续时间、感染和炎症过程，可影响长期移植结果。虽然已经开发出多种方法来诊断肾同位功能，组织病理学检查仍然是金本位标准，在物质3，4，12。,4,12虽然活检程序可以产生关于预先存在的供体疾病和血管变化的大量信息，但它并非没有缺陷。与观察员间变异性有关的取样错误和缺乏关于器官功能的全面信息的 glomeruli 采样仍然是这方面的典型关切。此外，标本制备也带来了一些问题，如冷冻截面的嫁接评估不完整，石蜡剖面的手术时间延长。然而，出血风险的增加，可能严重显示为显微或严重血尿，是与活检程序相关的主要危及生命的并发症。因此，允许的活检数量在移植手术中受到严格限制，这一因素妨碍了通过这种方法12、13、14,13,捕捉动态变化和时间序列分析。组织学分析的好处必须与与该方法相关的风险进行权衡。组织学发现的价值是无可争辩的，但它们不能解释畸变的分子机制。
代谢组学和唇部学是"-组学"科学家族中最年轻的领域。在代谢网络内连接的一套完整的低分子（<1，200 Da）人类代谢物和脂质被定义为人类代谢物。基因组在其整个生命周期中保持相对恒定，由于突变很少发生而导致的轻微修饰。代谢物是基因表达的产物，它对于所有生物过程和环境因素的变化都高度敏感。代谢物和脂质的动态性质使它们成为当前器官状况7、8、15、16,8,15,的完美指标。上述协议中提出的SPME方法能够检测器官保存过程中发生的变化，从器官从捐赠者体内切除到接受者的再血管化。探头的小直径（±200 μm）提供微创性，并允许从同一器官进行多次采样，而不会对组织造成任何损害。使用肾脏作为最常见的移植器官进行研究，可以更好地了解和进一步描述导致移植物质量和功能下降的代谢途径。与活检等常规侵入性方法相比，随着时间的推移监测修改的可能性无疑是该技术的一个重要优势。目前提出的分析发现，各种脂质和代谢物组，特别是必需氨基酸、紫菜、紫菜核苷酸和糖磷脂的浓度变化。这些结果与以前的组织,分析报告,,5、6、17、18、19、205,618,19是一致的。17迄今为止，大多数利用代谢组学或唇部学解释移植后诱发并发症或缺血/再灌注损伤（IRI）现象的科学报告仅限于对生物流体21、22、23,22,的分析。
每个临床应用都需要优化采样协议，以确保分析方法的性能符合预期标准。在这方面，利用SPME的好处是有可能调整各种实验设计的条件。各种可访问的萃取阶段提供了具有多种极性的广泛提取代谢物。同时，由于每个吸附剂都提供对特定特征的选择性，并且不提取样品基质中存在的所有化合物，因此，这可能被视为方法的限制。应该注意的是，SPME涂层只通过自由分子提取，根本不与分析剂的绑定部分相互作用。涂料的生物相容性在抑制蛋白质等大分子的提取的同时，不会给组织带来毒性;因此，酶过程在样品采集阶段已经受到抑制，人工制品的存在最小化，这是比替代采样方法的一大优势。涂层的长度会影响萃取效率（即涂层的长度指定表面积和萃取相积）;因此，较长的涂层可产生更高的回收率。另一方面，较短的涂层可实现更高的空间分辨率。为了获得可靠的结果，将探针淹没到肾皮层完全相同的深度至关重要。插入太深会导致进入肾内大的风险。提取时间与萃取效率成正比。因此，选择最佳提取时间是SPME方法开发中最关键的步骤之一。时间测量的精度提供了最高的可重复性。在生物应用中，如所讨论的应用，分析协议的敏感性和可重复性与医疗程序的限制之间总是存在一种妥协。虽然平衡提取提供最高的灵敏度，但出于安全原因，平衡前条件通常用于此类应用，因为提取时间不应影响手术的总持续时间。脱吸效率由过程时间和脱吸溶剂的组成决定，,该溶剂应与用于色谱分离9、10、11,10的移动相相兼容。
用于手术内评估的诊断仪器的主要要求之一是分析时间。目前正在尝试开发一种快速工具，用于体内SPME提取，通过微流体开放接口（MOI）24 或涂层刀片喷雾（CBS）25直接耦合到质谱仪。这种办法将允许以实际或接近实时方式披露分析结果。使用这种方法对代谢和唇部特征进行干预前分析，可以加强移植手术期间的决策过程，从而在器官衰竭时能够获得最佳的个性化方法和快速反应。
作为摘要，假设拟议的方案将实现肾移植物的完全代谢和唇部特征，从而提供对器官质量的全面评估，并描述负责缺血-再灌注损伤的过程。该项目的新颖性包括利用固相微extraction（SPME），提供低侵入性采样的生活系统，结合可用于代谢组学和唇部学分析（例如，Orbitrap高分辨率质谱仪）的最创新技术之一。SPME 将代谢物的样品采集、提取和淬火一步地结合在一起，因此成为快速分析的完美工具。预计该协议将有助于回答有关肾脏移植前条件导致器官功能延迟或移植后功能障碍的问题，以及移植保存协议如何影响器官的生物化学。这种知识不仅对预防可能与移植有关的并发症产生重大影响，而且可能有助于改进目前的移植保存方案，最大限度地减少可行的移植组织的损失和生命损失。拟议的解决方案将为这一领域的进一步研究打开大门，包括验证特定的潜在生物标志物和改善移植学的治疗结果。
Disclosures
作者要感谢 MilliporeSigma（德国达姆施塔特的默克KGaA）为获得Q-精确聚焦轨道参数质谱仪而提供SPME设备和热莫费舍尔科学。
Acknowledgments
这项研究得到了国家科学中心授予Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013的支持。作者要感谢德国达姆施塔特默克KGaA公司提供SPME设备的美利波雷西格玛。默克的生命科学业务在美国和加拿大以米利波雷西格玛为经营范围。此外，作者要感谢赛默费舍尔科学访问Q-精确聚焦轨道rap质谱仪。作者要感谢阿列克桑德拉·沃德斯卡-贾希斯卡博士和比德戈什茨移植学和普通外科部人员对该项目的提供。BB要感谢JanuszPawliszyn教授在多伦多总医院期间在多伦多总医院收集样品的机会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Merck | 5330010050 | Mobile phase additive |
| Acetonitrile | Alchem | 696-34967-4X2.5L | HPLC solvent |
| Ammonium acetate | Merck | 5330040050 | Mobile phase additive |
| BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER | Benchmark Scientific | BV1010 | Vortex mixer |
| Caps | Perlan Technologies | 5183-2076 | Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK |
| Chloroform | Merck | 1024441000 | |
| Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm | Merck | 567570-U | HPLC guard column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC column |
| Formic acid | Alchem | 497-94318-50ML | Mobile phase additive |
| Glass vials | Perlan Technologies | 5182-0714 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC column |
| HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-AJ0-8328 | HPLC guard column |
| Isopropanol | Alchem | 231-AL03262500 | HPLC solvent |
| Methanol | Alchem | 696-34966-4X2.5L | HPLC solvent |
| Nano-pure water | Merck | 1037281002 | HPLC solvent |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | Q Exactive Focus | Mass Spectrometer |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Merck | 1504360001 | HPLC guard column |
| SPME LC fiber probes, mixed mode | Supelco | prototype fibers | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | UltiMate 3000 | HPLC system |
| Vial inserts (deactivated) | Perlan Technologies | 5181-8872 | |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm | Waters | 186007811 | HPLC guard column |
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Tags
医学， 问题 160， 移植， 肾脏， 化学活检， 甲细胞， 脂肪， 固相微exex （SPME）， 液相色谱与质谱法 （LC-MS）Erratum
Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 08/28/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.
The third affiliation was updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland
