Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Использование химической биопсии для оценки качества трансплантата

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60946
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 3, 2,4, 3, 1
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Протокол представляет использование подхода к химической биопсии с последующим комплексным метаболомическим и липидомным анализом для оценки качества трансплантатов почек, выделяемых для трансплантации.

Abstract

Трансплантация почек является жизненно важной для многих людей с почечной дисфункцией на конечной стадии во всем мире. Процедура связана с повышением выживаемости и повышением качества жизни пациента по сравнению с обычным диализом. К сожалению, трансплантология страдает от отсутствия надежных методов оценки качества органов. Стандартные диагностические методы ограничиваются макроскопическим осмотром внешнего вида или инвазивной биопсией тканей, которые не предоставляют исчерпывающей информации о трансплантате. Предлагаемый протокол направлен на внедрение микроэкстракции твердой фазы (SPME) в качестве идеального аналитического метода для комплексного метаболомики и липидомного анализа всех низкоя молекулярных соединений, присутствующих в почках, выделяемых для трансплантации. Небольшой размер зонда SPME позволяет провести химическую биопсию, которая позволяет экстракции метаболитов непосредственно из органа без какой-либо коллекции тканей. Минимальная инвазивность метода позволяет с течением времени провыполнения нескольких анализов: непосредственно после сбора органов, во время его сохранения, и сразу после реваскуляризации в организме получателя. Предполагается, что сочетание этого нового метода отбора проб с масс-спектрометром высокого разрешения позволит продать набор характерных соединений, которые могли бы служить биологическими маркерами качества трансплантата и индикаторами возможного развития дисфункции органов.

Introduction

По данным Сети закупок и трансплантации органов США, в 2019 году в США 94 756 пациентов ждали пересадки почки; в то время как в Европе в 2018 году это число составило 10 791. Каждые десять минут, кто-то добавляется в национальный список ожидания трансплантации в США, и, по оценкам, 20 человек умирают каждый день вожидании трансплантации 1,2. Трансплантация почек является жизненно важной для многих людей, страдающих почечной дисфункцией на конечной стадии во всем мире. Процедура связана с повышением выживаемости и повышением качества жизни по сравнению с обычным диализом.

Однако трансплантация сталкивается со многими серьезными проблемами, такими, как нехватка органов или отсутствие эффективных инструментов для оценки качества органов. Стандартные протоколы ограничиваются макроскопическим осмотром внешнего вида или инвазивной биопсией тканей, которые не предоставляют исчерпывающей информации о качестве трансплантата. В то время как визуальная оценка позволяет идентифицировать опухоли, видимые глазу, анатомические аномалии, или обширный ущерб трансплантатам, этот подход очень субъективен, изменяясь по своей эффективности в зависимости от опыта наблюдателей. Биопсия, с другой стороны, может предоставить ценную информацию о уже существующих почечных расстройств, и, таким образом, считается методом объективной и доказательной ценности в определении исходов трансплантата. Тем не менее, процедура биопсии не свободна от недостатков; существует риск потенциальных осложнений, таких как кровотечение и требуется дополнительно 4-5 часов подготовки образца, что значительно продлевает время холодной ишемической болезни. Поэтому, особенно в Европе, использование прямого анализа тканей ограничивается расширенными критериями доноров (ECD) и доноров после смерти кровообращения (DCD)3,4.

Метаболомика и липидомика были недавно признаны в качестве перспективных подходов к достижению лучшего понимания изменений в биохимических путей, происходящих во время сохранения органов. Метаболомическое и липидомное профилирование позволяет контролировать немедленную реакцию системы на внезапные изменения окружающей среды, связанные с удалением органов с последующими последствиями: ишемией, окислительным стрессом иливоспалительными реакциями 5,,6,,7,,8. Почка является органом, который в значительной степени связан с метаболическими процессами, таким образом, измерения метаболитов и концентраций липидов могут позволить идентифицировать потенциальные биомаркеры качества органов и дать возможность лучше прогнозировать исход трансплантата.

Учитывая вышеперечисленные осложнения и ограничения, связанные с современными методами оценки качества органов, для быстрой и сложной оценки качества органов необходимо менее инвазивное диагностическое решение. Микроэкстракция твердой фазы (SPME) соответствует этим требованиям как минимально инвазивный аналитический метод, позволяющий очертить широкий спектр метаболитов и липидов. Методика основана на вставке тонкого (200 мкм), биосовместимого, титаново-никелевого сплава зонда, покрытого селективной фазой экстракции в исследованный орган в течение короткого времени. Следует подчеркнуть, что SPME предотвращает экстракцию белка, а значит, позволяет ингибировать обмен веществ уже на стадии сбора проб, что является существенным преимуществом перед альтернативными методами. Кроме того, миниатюризация прибора позволяет проводить повторяющиеся и одновременные анализы несколькихструктур органа 9,,10,,11.

Protocol

Все животные получали гуманный уход в соответствии с «Принципами лабораторного ухода за животными», сформулированными Национальным обществом медицинских исследований и «Руководством по уходу за лабораторными животными», опубликованным Национальным институтом здравоохранения Онтарио, Канада. Комитет по уходу за животными Общего научно-исследовательского института Торонто одобрил все исследования. Исследование, в нем участвовали люди, было одобрено Биоэтическим комитетом в Коллегии Медикум в Быдгоще Николаус Коперник в Торуне.

ПРИМЕЧАНИЕ: Получить одобрение от соответствующих этических советов. Помните, чтобы всегда носить защитные перчатки. Не прикасайтесь к фазе извлечения зондов SPME. Для липидомического анализа рекомендуется использовать деактивированные стеклянные флаконы.

1. Подготовка зондов

  1. Приготовьте титаново-никелевые сплавы (длина 40 мм; диаметр 0,2 мм) с 7-мм микс-режимным сорбентом. Количество зондов зависит от точек времени, нацеленных на всю процедуру, и количества репликаций (3 рекомендуется в точку времени).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина и тип фазы извлечения могут быть скорректированы на основе способа исследования, полярности метаболитов и матрицы образца.
  2. Приготовьте чистящую смесь, состоящую из 2:1 хлороформа:метанола (v/v). Pipet 1.0 мл раствора для каждого 2,0 мл стеклянный флакон и место один зонд, ранее пронзили через крышку, в каждом флаконе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием, очистить все зонды для удаления загрязняющих частиц.
  3. Положите флаконы на агитатор и установите скорость агитации на 1200 об/мин. Через 45 минут остановите устройство и промойте покрытия водой класса LC-MS.
  4. Поскольку покрытия должны пройти предварительный шаг для их активации, подготовьте предусловие смеси, состоящей из 1:1 метанола:вода (v/v). Pipet 1.0 мл раствора для каждого 2,0 мл стеклянный флакон и место один зонд, ранее пронзили через крышку, в каждом флаконе.
  5. Положите флаконы на агитатор вихря и установите скорость возбуждения на уровне 1200 об/мин.
  6. Через 60 минут остановите агитатор и промойте покрытия водой класса LC-MS.
  7. Стерилизовать зонды в соответствии со стандартным протоколом стерилизации хирургического оборудования.

2. Добыча

  1. Откройте стерильный пакет прямо перед отбором проб, чтобы обеспечить стерильную среду.
  2. Вставьте два зонда непосредственно в кору почек в течение 10 минут в каждой точке времени. Вся длина покрытия должна быть покрыта матрицей ткани; никакого конкретного угла не требуется, но ca. 90 deg обычно используется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся медицинская процедура следует стандартным протоколам в данном учреждении. Никаких изменений, касающихся выборки SPME, не рассматривается. Процедура включает в себя шесть следующих точек времени отбора проб:
    а) перед ресекцией почек, in vivo от донора;
    б) - после 1 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч перфузии почек, ex vivo в органной камере;
    f) после перепроверения, in vivo от получателя.
  3. Убирайте зонды, вытаскивая его из ткани, а затем промыть покрытия с LC-MS класса воды, чтобы очистить все оставшиеся крови от поверхности покрытия. Промыть от хирургического участка, и сразу после удаления зондов.

3. Транспорт и хранение

  1. Поместите зонды в отдельные флаконы и закройте их.
  2. Поместите флаконы в ящик из пенополистирола, наполненный сухим льдом или жидким азотом для транспортировки.
  3. Храните образцы в морозильной камере (-80 градусов по Цельсию), или немедленно начать шаг desorption.

4. Desorption

  1. Подготовка desorption решения, состоящие из 80:20 ацетонитриле: вода (v/v) для метаболомического анализа, и 1:1 изопропанол:метанол (v/v) для липидомного анализа.
  2. Pipet 100 йл раствора для вставок, помещенных в 2,0 мл помеченных флаконов и место один зонд, ранее пронзили через крышку, в каждом флаконе.
  3. Положите флаконы на агитатор вихря и установите скорость возбуждения на 1200 об/мин в течение 120 минут.
  4. Удалите зонды из флаконов. Полученные выдержки теперь готовы к инструментальному анализу.

5. Анализ LC-MS

  1. Поместите флаконы, содержащие экстракты, в автоамплеер системы LC-MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования была использована жидкая хроматография (RP, HILIC) в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения и анализатором массы орбитрапа. Для параметров метаболомического анализа перейдите к шагу 5.2. Для параметров липидомного анализа перейдите к шагу 5.6.
  2. Используйте пентафторофенил (PFP) колонку (2,1 мм х 100 мм, 3 мкм) для обратного разделения фазы.
    1. Установите скорость потока до 300 мкл/мин, а температура автоамплера и столбца до 4 градусов по Цельсию и 25 градусов по Цельсию, соответственно.
    2. Подготовка мобильных фаз в соответствии со следующими пропорциями: мобильная фаза A: вода:formic кислота (99.9:0.1, v/v) и мобильная фаза B: ацетонитрил:formic кислота (99.9:0.1, v/v). Установите поток мобильной фазы по следующим параметрам: запуск мобильного фазового потока (0-3 мин): 100% А с последующим линейным градиентом до 10% А (3-25 мин), заканчивающийся изократическим потоком 10% А до 34 мин, а затем 6 мин времени повторного равновесия колонны.
  3. Для разделения HILIC используйте столбец HILIC (2,0 мм x 100 мм, 3 мкм, 200А). Установите скорость потока до 400 мкл/мин.
    1. Подготовка мобильных фаз в соответствии со следующими пропорциями: мобильная фаза A: ацетонитрил:ацетат ацетат аммония (9:1, v/v, эффективная концентрация соли 20 мМ), мобильная фаза B: ацетонитрил:аммоний ацетат буфер (1:1, v/v, эффективная концентрация соли 20 мМ).
    2. Установите поток мобильной фазы в соответствии со следующими параметрами: запуск мобильного фазового потока (0-3 мин) на 100% А, удерживайте 3,0 мин, а затем дорасти до 100% B в течение 5 минут. Держите с 100% B до 12 мин, а затем 8 мин столбца повторного равновесия времени.
  4. Установите диапазон сканирования до 85-1000 м/з. Установите параметры источника HESI в положительном режиме ионизации: напряжение брызг 1500 В, температура капилляра 300 градусов по Цельсию, газ оболочки 40 a.u., скорость потока газа aux 15 a.u., температура нагревателя зонда 300 градусов по Цельсию, S-Lens RF уровень 55%.
  5. Вы запустите образцы КК, состоящие из 10 мкл каждого анализируемого образца (регулярно, каждые 10-12 образцов) для мониторинга производительности инструмента.
  6. Для обратного разделения фазы используйте столбец C18 (2,1 мм x 75 мм, 3,5 мкм).
    1. Установите скорость потока до 200 мкл/мин, а температура автоамплеера и столбца до 4 градусов по Цельсию и 55 градусов по Цельсию, соответственно. Подготовка мобильных фаз в соответствии со следующими пропорциями: мобильная фаза A: H2O:MeOH (60:40, v/v), ацетат аммония 1 мм и 1 мм уксусная кислота; мобильная фаза B: IPA:MeOH (90:10, v/v), ацетат аммония 10 мМ и ацетическая кислота 1 мМ.
    2. Установите поток мобильной фазы по следующим параметрам: 0-1 мин (20% B), 1-1,5 мин (20-50% B), 1,5-7,5 мин (50-70% B), 7,5 мин 5-13 мин (70-95% Б), 13-17 мин (95% Б), 17-17,1 мин (95-20% Б), 17,1-23 мин (20%).
  7. Для разделения HILIC используйте столбец HILIC (100 x 2,1 мм, 3 мкм).
    1. Установите скорость потока до 400 мкл/мин, а температура автоамплеера и столбца до 4 градусов по Цельсию и 40 градусов по Цельсию, соответственно.
    2. Подготовка мобильных фаз в соответствии со следующими пропорциями: мобильная фаза A: ACN; мобильная фаза B: ацетат аммония 5 мМ в воде. Установите поток мобильной фазы по следующим параметрам: 0-2 мин (96% B), 2-15 мин (96-80% B), 15-15,1 мин (80-96% B), 15,1-21 мин (96% B).
  8. Установите параметры источника HESI в положительном режиме ионизации для распыления напряжения 3500 V, капиллярной температуры 275 градусов по Цельсию, оболочки газа 20 a.u., aux скорость потока газа 10 a.u., температура нагревателя зонда 300 градусов по Цельсию, S-Lens RF уровень 55%.
  9. Вы запустите образцы КК, состоящие из 10 мкл каждого анализируемого образца (каждые 10-12 образцов) для мониторинга производительности инструмента.
  10. Выполняем сбор данных в программном обеспечении, совместимом с инструментом.

6. Анализ данных

  1. Выполняем обработку данных, путтивую идентификацию и статистический анализ с помощью программного обеспечения, предназначенного для нецелесохотного метаболомического и липидомического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации структуры данных можно получить основные компоненты анализа (PCA) и бокс-усы участков.

Representative Results

Сбор образцов проводился в соответствии с описанным выше методом SPME с использованием зондов, покрытых фазой извлечения смешанного режима диаметром 7 мм. Отбор проб проводился непосредственно из трансплантатной ткани (in vivo до трансплантации), ex vivo в камере почек после 1 ч, 3 ч, 5 ч и 7 ч перфузии, а также in vivo после реваскуляризации у реципиента. Нецелесоскопические метаболомические и липидомные анализы проводились с использованием жидкой хроматографии (RP, HILIC) в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения, при этом масс-анализатор устанавливался в режиме положительной ионизации. Для оценки качества данных и получения общей информации о результатах данные подвергались основному анализу компонентов (PCA). Как показано на рисунке 1, образцы КК сформировали плотный кластер, подтверждающий качество анализов. Изучаемые группы демонстрируют относительно хорошее разделение, позволяющее визуализировать различия в метаболических и липидомных профилях до и после трансплантации, а также во время перфузииорганов (рисунок 2). SpME выборки позволяет метаболического профилирования органа с течением времени. Бокс-усы участки выбранных метаболитов служат примером изменений в уровнях метаболита на протяжении всего эксперимента (Рисунок 3). Широкий спектр извлеченных объектов, разделенных на столбцах RP и HILIC, показан на рисунке 4.

Figure 1
Рисунок 1: Основной анализ компонентов, показывающий кластеризацию образцов контроля качества для метаболомических обратных фаз (A), HILIC (B) и липидомных анализов обратной фазы (C), HILIC (D). Контроль качества необходим в нецелесогласовом анализе для мониторинга любых возможных изменений, вызванных инструментальной нестабильностью. Плотный кластер образцов КК гарантирует, что все наблюдаемые изменения имеют биологическое происхождение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Основной анализ компонентов, показывающий различия между конкретными точками отбора проб метаболомический (A) и липидомный (B). Нецелевое профилирование почек с помощью SPME-LC-HRMS позволяет наблюдать биохимические различия в органах на последующих этапах их сохранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Бокс-усы участки отдельных соединений, показывающие изменения в метаболитах (A, B) и липидов (C, D) в период перитрансплантата. После отбора и выявления дискриминационных соединений коробочные усы участки позволяют отслеживать изменения уровней этих соединений на последующих этапах протокола и сравнивать уровни метаболитов в органах, подлежащих различным протоколам консервации или собранных у различных доноров, например, бьющимся сердцем донорам или донорам после сердечной смерти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Ионная карта (м/з по сравнению со временем удержания) объектов, полученных в результате анализа LC-MS с (A) обратной фазой и (B) разделением HILIC. Сюжет позволяет оценить общее количество объектов, полученных с помощью предлагаемого протокола (от добычи до обнаружения) и оценить аналитный охват на основе полярности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Оценка качества органов остается большой проблемой для врачей, которые должны принимать быстро обоснованные решения относительно того, является ли данный орган жизнеспособным для трансплантации или же он должен быть отброшен. Несколько факторов, таких как возраст донора, продолжительность ишемии, инфекции и воспалительные процессы, могут повлиять на долгосрочный исход трансплантата. Хотя различные методы были разработаны на сегодняшний день для диагностики функции алотрансплантата почек, гистопатологический осмотр остается золотымстандартом в этом вопросе 3,4,12. Хотя процедура биопсии может дать значительную информацию о уже существующих донорских заболеваний и сосудистых изменений, она не свободна от недостатков. Типичными проблемами в этой связи остаются ошибки выборки, связанные с вариативностью интеробсерверов и выборкой недостаточного гломерули для получения всеобъемлющей информации о функции органов. Кроме того, подготовка образцов приводит к некоторым вопросам, таким, как неполная оценка трансплантата в случае замерзших секций и продление срока процедуры секции парафина. Тем не менее, повышенный риск кровоизлияния, которое может показаться остро, как микроскопические или валовой гематурии, является основным опасным для жизни осложнение, связанное с процедурой биопсии. По этой причине количество допустимых биопсий строго ограничено в процедурах трансплантации, фактор, который препятствует захвату динамических изменений и анализов тайм-рядовс помощью этого метода 12,,13,,14. Преимущества гистологического анализа должны быть взвешены с рисками, связанными с методологией. Ценность гистологических находок неоспорима, но они не объясняют молекулярные механизмы аберраций.

Метаболомика и липидомика являются самыми молодыми областями научного рода «омиков». Полный набор низкокалорийных метаболитов и липидов, соединенных в метаболоме человека, определяется как метаболома человека. Геном остается относительно постоянным на протяжении всей своей жизни, с небольшими изменениями, вызванными мутациями, происходящими нечасто. Метаболом является продуктом экспрессии генов, который очень чувствителен к изменениям во всех биологических процессах, а также к факторам окружающей среды. Динамический характер метаболитов и липидов делает их идеальными показателями текущего состояния органов7,,8,,15,,16. Метод SPME, предложенный в вышеупомянутом протоколе, позволяет выявлять изменения, происходящие в органе во время его сохранения, начиная от удаления органов из организма донора и до реваскуляризации у реципиента. Малый диаметр зонда обеспечивает минимальную инвазивность и позволяет проводить несколько проб из одного и того же органа, не нанося никакого ущерба ткани. Проведение исследований с использованием почек, как наиболее часто пересаженного органа, позволяет лучше понять и дальнейшую характеристику метаболических путей, ответственных за снижение качества и функции трансплантатов. Возможность мониторинга изменений с течением времени, безусловно, является важным преимуществом техники по сравнению с обычными инвазивными методами, такими как биопсия. Представленный в настоящее время анализ выявил измененные концентрации различных групп липидов и метаболитов, особенно незаменимых аминокислот, пуринов, нуклеозидов пурина и глицерофосфолипидов. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетамианализа тканей 5,,6,,17,,18,,19,,20. На сегодняшний день большинство научных докладов с использованием метаболомики или липидомики для объяснения процессов, вызывающих осложнения после трансплантации или ишемии / реперфузии травмы (ИРИ) явления были ограничены анализом биофлюидов21,22,23.

Каждое клиническое применение требует оптимизации протокола отбора проб для обеспечения того, чтобы производительность аналитического метода соответствовала ожидаемым критериям. В этой связи преимуществом использования SPME является возможность корректировки условий для различных экспериментальных проектов. Разнообразие доступных фаз экстракции обеспечивает широкий спектр извлеченных метаболитов с диверсифицированной полярности. В то же время это может рассматриваться как ограничение метода в связи с тем, что каждый сорбент обеспечивает избирательность по отношению к конкретным особенностям и не извлекает все соединения, присутствующие в матрице образца. Следует отметить, что покрытия SPME извлекаются только через свободные молекулы, и просто не взаимодействуют с связанной долей аналита. Биосовместимость покрытий не вводит токсичность в ткань, сдерживая при этом экстракции крупных молекул, таких как белки; как следствие, энзиматические процессы тормозятся уже на этапе сбора проб, и наличие артефактов сводится к минимуму, что является большим преимуществом по сравнению с альтернативными методами отбора проб. Длина покрытия влияет на эффективность извлечения (т.е. длина покрытия обозначает площадь поверхности и объем фазы извлечения); таким образом, более длинные покрытия дают более высокую урожайность. С другой стороны, более короткие покрытия обеспечивают более высокое пространственное разрешение. Для получения надежных результатов крайне важно погрузить зонд на точно такую же глубину коры почек. Вставка слишком глубоко вызывает риск входа в почечную медуллу. Время добычи также пропорционально эффективности добычи. Поэтому выбор оптимального времени извлечения является одним из важнейших шагов в разработке метода SPME. Точность измерения времени обеспечивает наивысшую повторяемость. В биологических приложениях, таких как обсуждаемая, всегда существует компромисс между чувствительностью и повторяемостью аналитического протокола и ограничениями медицинской процедуры. В то время как равновесная экстракция обеспечивает высокую чувствительность, по соображениям безопасности, в таких приложениях часто используются пред равновесные условия, так как время извлечения не должно влиять на общую продолжительность операции. Эффективность desorption определяется временем процесса и составом растворителя desorption, который должен быть совместим с мобильной фазой, используемой для хроматографического разделения9,,10,11.

Одним из основных требований к диагностическим приборам, используемым для внутрихирургических оценок, является время анализа. Текущие попытки предпринимаются для разработки быстрого инструмента для извлечения in vivo SPME в сочетании непосредственно с масс-спектрометром через микрофлюидный открытый интерфейс (MOI)24 или спрей с покрытием лезвия (CBS)25. Такие подходы позволили бы раскрывать аналитические результаты в реальном или близком к реальном времени времени. Использование таких методов для предварительного вмешательства анализ метаболических и липидомных профилей могло бы улучшить процесс принятия решений во время трансплантации процедур, что позволило бы наилучшим персонализированным подходом и быстрой реакцией в случае отказа органов.

Таким образом, предполагается, что предлагаемый протокол позволит получить полный метаболический и липидомный профили трансплантатов почек, что, в свою очередь, даст всеобъемлющую оценку качества органов и характеристику процессов, ответственных за ишемию-реперфузию. Новизна проекта включает в себя использование твердой фазы микроэкстракции (SPME), предлагая низкоинвазивную выборку живых систем, в сочетании с одной из самых инновационных технологий, доступных для метаболомики и липидомического анализа (например, масс-спектрометр высокого разрешения Orbitrap). SPME сочетает в себе сбор образцов, экстракции и затухание метаболитов в один шаг, что делает его идеальным инструментом для быстрого анализа. Ожидается, что этот протокол поможет ответить на вопросы, связанные с тем, какие предплантуационной состояния почки отвечают за задержку функции органа или его дисфункции после трансплантации, а также как протокол сохранения трансплантата влияет на биохимию органа. Такие знания не только оказывают существенное влияние на профилактику возможных осложнений, связанных с трансплантацией, но и могут способствовать улучшению действующих протоколов сохранения трансплантата, минимизируя потерю жизнеспособной трансплантационной ткани, а также гибель людей. Предлагаемое решение откроет двери для дальнейших исследований в этой области, включая проверку конкретных потенциальных биомаркеров и улучшение терапевтических результатов в трансплантологии.

Disclosures

Авторы хотели бы отметить MilliporeSigma (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) за предоставление устройств SPME и Thermo Fisher Scientific для доступа к масс-спектрометру "К-точный фокус орбита".

Acknowledgments

Исследование было поддержано грантом Opus UMO-2017/27/B/N'5/01013 от Национального научного центра. Авторы хотели бы отметить MilliporeSigma, бизнес Merck KGaA, Дармштадт, Германия для предоставления устройств SPME. Бизнес Merck в области науки о жизни работает как MilliporeSigma в США и Канаде. Кроме того, авторы хотят поблагодарить Thermo Fisher Scientific за доступ к масс-спектрометру "К-точный фокус". Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Александру Водерскую-Яшинскую и сотрудников отделения трансплантологии и общей хирургии в Быдгоще за любезное содействие в реализации проекта. BB хочу поблагодарить профессора Януш Pawliszyn за возможность сбора образцов в Торонто больницы во время ее пребывания в Университете Ватерлоо.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019).
  2. Branger, P., Undine, S. Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Tags

Медицина выпуск 160 трансплантация почка химическая биопсия метаболомическая липидомная твердая фазовая микроэкстракция (SPME) жидкая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (LC-MS)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 08/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

Использование химической биопсии для оценки качества трансплантата
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stryjak, I., Warmuzińska, N.,… More

Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter