在这里,我们提出了一个协议,用于在B细胞上进行牵引力显微镜实验。我们描述了软聚丙烯酰胺凝胶的制备及其功能化,以及显微镜下的数据采集和数据分析摘要。
牵引力显微镜 (TFM) 能够测量基板上的电池产生的力。该技术从在弹性基板上拉的细胞产生的实验观测的位移场推断出牵引力测量。在这里,我们调整了TFM,以研究B细胞在B细胞受体抗原接合激活时所施加的力场的空间和时间结构。凝胶刚度、珠密度和蛋白质功能化必须进行优化,以研究与细胞表面受体相互作用的相对较小的细胞(±6 μm),并特别响应配体。
B细胞是免疫系统的抗体产生细胞。为了激活自适应免疫反应,他们首先通过称为B细胞受体(BCR)1的特定受体获得原生形式(即非处理)。此过程发生在淋巴结 B 细胞区。即使某些抗原可以通过淋巴液到达B细胞,大多数抗原,特别是高分子量(>70 kDa,这是淋巴导管的极限大小)确实以原生形式呈现在抗原呈现细胞(APC)的表面,通常是亚囊鼻窦巨噬细胞或卵泡树突细胞,通过卵磷或Fc受体(非特异性)。与该细胞的接触导致免疫突触的形成,其中BCR对与APP相关的抗原施加力。抗原与 BCR 的绑定启动 BCR 信号,从而激活产生力的机制。这些力量对于扩增BCR信号可能很重要,但对B细胞提取和内化抗原也是必不可少的。
最近的研究表明,BCR确实是机械敏感2。例如,更硬的基板会发出增强的 BCR 信令 3。此外,在免疫突触产生的力拉单个BCR,以探寻其亲和力抗原,从而确保亲和力歧视4。因此,研究B细胞对抗原表现的机械反应,并解剖这种反应,从涉及的受体类型(IgG/IgM)5,粘附分子(内黄体体)或药理学和转基因细胞(即,BCR信号或细胞骨架动力学下游的蛋白质的沉默)6。
观察细胞对生理刚性基质基底的反应的简单方法是牵引力显微镜 (TFM)。TFM包括观察在弹性基板上拉的细胞产生的位移场。最初,凝胶的变形是通过相对比显微镜7的弹性体本身的皱纹观察到的,但插入荧光微珠作为基准标记可以更好的分辨率,并从此成为标准8。这种方法已被用于研究粘附细胞、组织,甚至嵌入凝胶中的器官所施加的牵引力。TFM 的几个变体已经开发出9种,包括,结合超分辨率显微镜(即STED 10 或SRF11),修改凝胶的折射率,允许TIRF显微镜12,用纳米打印图案13取代珠子,并使用纳米单子代替平面14。有关这些变化的完整审查,请参阅科林-约克等人第15条。
此处介绍的协议描述了测量 B 细胞在抗原涂层基材上施加力的过程。这些力应用于配体(抗原),以便聚类它们,然后从抗原呈现基质中提取它们。我们调整了标准TFM协议,以模拟生理抗原呈现基板的刚度、尺寸和B细胞的相关涂层。该协议允许同时研究多个细胞,并可与荧光显微镜技术和化学处理结合使用。然而,它的目的并不旨在探测单分子力测量,其中光学钳子16,分子张力探针17,18,生物膜力探针19,和原子力显微镜20是比较合适的技术。与其他单细胞力测量方法(例如,微管21或微孔板 22)相比,TFM 允许重建一个分辨率为 ±300 nm 的突触施加的力的完整图。这可用于识别表面施加的力中的时态模式,并且由于凝胶与共和成像兼容,因此将它们与特定蛋白质(例如,细胞骨架和信号蛋白)的招募关联。
虽然 3D TFM 是可能的,但它与我们使用的刚度和设置不兼容。3D 中的变形可以通过其他更复杂的设置实现,例如突起力显微镜(AFM 扫描镀细胞的可变形膜)23、24和弹性振振器干扰显微镜(ERISM,一种凝胶作为光的振振腔,并突出显示基板的变形,精度为几纳米)25。虽然这些技术是非常有希望的,他们还没有被用于B细胞。其他类型的TFM,如纳米极14,可以用来拥有更可重复的基材。然而,由于细胞相互交插,因此这种几何体不能适应软细胞,这使分析变得复杂。这种方法确实在T细胞中被用来观察细胞在柱子26周围建造结构的能力。
尽管 TFM 简单明了,但它使用聚丙烯酰胺凝胶允许同时观察许多细胞,并且可以在配备长凳和荧光显微镜的任何实验室中轻松、廉价地实施(尽管我们建议使用共聚/旋转盘)。
为了模仿APC的生理刚性,我们使用刚度为+500 Pa27 的聚丙烯酰胺凝胶,并激活抗原使凝胶功能化。在该协议中,我们使用母鸡蛋糖酶(HEL)对聚丙烯酰胺凝胶的表面进行功能化。这允许通过接触抗原结合位点测量刺激 BCR 产生的力。使用这种抗原和从MD4小鼠的 HEL 特异性B细胞确保相对均匀的力生成响应抗原结扎28。然而,其他分子(如B6小鼠的抗IgM)可以嫁接到凝胶上,但在这些情况下产生的力可能更异质化,强度更低。由于 B 细胞是小细胞(直径 ±6 μm),因此珠的数量已优化为最大,但仍可跟踪。对于在基材上施加 +kPa 力的大型细胞,可以使用相对稀疏的珠子或执行简单的粒子图像测速 (PIV) 来重建变形场,获得令人满意的结果。然而,对于小细胞,如B淋巴细胞,施加的压力小至+50Pa,需要使用单粒子跟踪(粒子跟踪测速仪,PTV)来实现所需的精度,当重建变形场。为了可靠地单独跟踪珠子,目标镜头的放大倍率需要至少60倍,其数值孔径约为1.3倍。因此,凝胶必须相对薄(<50 μm),否则珠子不可见,因为它们高于目标的工作距离。
主要方案由三部分组成:凝胶制备、凝胶功能化和成像;另外两个部分是可选的,专用于荧光细胞的抗原提取定量和成像。
此处描述的 TFM 方法允许系统地研究 B 细胞的有源机械能力。在B细胞的上下文中,这与提取和内化抗原的能力有关。与其他TFM方法相比,此处提出的协议简单且相当可重复:通过玻璃微球的缩进和使用赫兹模型测量的刚性在400至600帕之间。 类似的协议不仅成功地用于B细胞35, 而且也成功地用于T细胞36。与纳米云拉(也用于T淋巴细胞37)相比,它提供了一个平坦的均匀表面,因此结果更容易解释,因为凝胶的相互作用主要约束到与表面切线。
我们描述的协议允许访问B细胞在抗原呈现基质上施加的力的时空动力学。在空间层面上,这提供了力的定位信息,并结合荧光显微镜,使实验者能够将局部力与特定分子的存在(即细胞骨架或BCR信号级联的成分)的存在关联。在时间层面,可以集成数量(如总能量或总应力),以提供每个时间点一个值并降低噪声。这允许观察牵引力在时间(生长和高原)的演变和脉动模式的存在。
分析的关键实验方面如下所述。(i) 细胞密度:为了进行正确的分析,细胞应充分分离。如果细胞周围有一个自身大小的空区域,我们认为它是可分析的。(二) 传输图像:建议在实验期间至少收集细胞的传输图像,以用作分析中的掩码。(iii) 图像中的珠数:我们建议仅分析突触中的珠数在 30 到 200(即 1~8 个珠子/μm2)的图像。较低的密度不允许进行适当的地图位移重建。高珠密度使单个颗粒跟踪不可靠。(四) 在实验期间,珠子的数量应保持不变;但是,由于成像条件下的变异性很小(特别是在彼此过于接近的珠子中),可能会发生波动。必须纠正焦点漂移,并丢弃有问题的帧。(v) 凝胶质量:裂纹过重、珠子分布变化或过厚的凝胶应丢弃。(vi) 根据细胞类型,在反复暴露后,后期时间点(>300帧)的细胞可能会遭受光毒性影响。建议在没有单元格的掩码上运行程序,作为与数据进行比较的”基线”。这仅根据实验条件提供噪声级别的大小。
用于测量经典粘附中牵引力的凝胶允许对在焦点粘附时发生的过程(行为源流动和信号分子的招募)进行调查,即施加力的点38,39。但是,突触的力不会通过焦点粘附应用。B细胞免疫突触中力生成时空模式直到最近才使用这种方法进行定量研究。使用TFM,我们首次观察到,力模式在B细胞免疫突触,在我们最近的研究6,打开令人鼓舞的观点,在研究淋巴细胞。
值得注意的是,此方法使用在凝胶上细胞到达之前拍摄的图像作为力计算的参考图像。通常的TFM协议建议在实验结束时使用尝试素分离细胞后拍摄参考图像;这允许实验者寻找一个富含细胞的区域。虽然这在这里也是可能的,但 trypsin 在从抗原涂层凝胶分离 B 细胞时效率相当低,需要等待很长时间才能分离,并且凝胶修饰和运动的风险更高(使整个数据集无法开发)。
此处介绍的方法是灵活的,可用于研究免疫突触中其他信号的作用,因为它允许将其他蛋白质移植到凝胶表面(例如,集成糖体和免疫球蛋白已经过测试),甚至荧光抗原(见第 4 节)。此外,实验者仍然能够获得细胞进行药物治疗和局部扰动。最后,该方法还与成像固定细胞兼容。对于这些观察,建议在盖玻片上制作凝胶,弄脏细胞,将盖玻片粘在幻灯片上,然后添加安装介质和另一个盖玻片。然后,将用顶部的凝胶进行观察,以避免图像通过凝胶退化。
可能的陷阱是凝胶在聚合和涂层中的变异性。聚合问题主要是由于启动者/催化剂的质量。此外,凝胶可以膨胀,特别是在组装后未使用。这个问题似乎没有显著影响凝胶的机械性能,但它可以使珠层无法达到的目标,有效地使凝胶无用的。当出现此问题时,我们建议为每种情况准备额外的凝胶。涂层也可能存在某种变异性,新稀释的 Sulfo SANPAH 至关重要。
最后,我们描述了一种简单、廉价和可重复的方法,用于测量B细胞在由BR配体激活时在免疫突触中施加的力。它可以适应研究对其他配体和其他类型的淋巴细胞(记忆B细胞,T细胞等)使用适当的受体配体的反应。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢M.Bolger-Munro的批判性阅读,并感谢尼康成像Center@CNRS研究所和PICT-IBISA,居里研究所,巴黎,法国-生物成像国家研究基础设施的成员,在图像采集和居里动物设施方面的支持。PP 得到 CNRS 的支持。AK 和 JP 得到了巴黎笛卡尔博士奖学金和学术博士火项目贝当古的支持。该项目由赠款资助PP(ANR-10-JCJC-1504-Immuphy)和 AMLD(ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001,ERC-Strapacemi-GA 243103)。
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store aliquoted, protected from humidity |
40% Acrylamide Solution | Biorad | 1610140 | |
Alexa555 microscale protein labeling kit | Molecular Probes | A30007 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
B cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
B-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
2% Bis Solution | Biorad | 161-0142 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100-812-C | |
Coverslip 18mm | VWR | 631-1580 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-151 | Decomplemented (40min @56°C) |
Fluorodishes FD35 | World Precision Instruments, Inc | FD35100 | |
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red | Molecular Probes | F8807 | |
Hen Egg Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Stocked in aliquote 100mg/ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermofisher/Gibco | 11140035 | |
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) | Euromedex | 50406-B | |
PBS (Phosfate Buffer Saline) | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-010 | |
RMPI 1640 – Glutamax I | Thermofisher | 61870-010 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 |