यहां हम बी कोशिकाओं पर कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों को करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम नरम पॉलीएक्रीलामाइड जैल की तैयारी और उनके कार्यात्मकीकरण के साथ-साथ माइक्रोस्कोप पर डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण का सारांश का वर्णन करते हैं।
कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) एक सब्सट्रेट पर एक सेल द्वारा उत्पादित बलों की माप को सक्षम बनाता है। यह तकनीक एक लोचदार सब्सट्रेट पर खींचने वाली कोशिका द्वारा उत्पादित प्रयोगात्मक रूप से मनाए गए विस्थापन क्षेत्र से कर्षण बल माप का अनुमान लगाता है। यहां, हमने बी सेल रिसेप्टर के एंटीजन सगाई द्वारा सक्रिय होने पर बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बल क्षेत्र की स्थानिक और लौकिक संरचना की जांच करने के लिए टीएफएम को अनुकूलित किया। जेल कठोरता, मनका घनत्व, और प्रोटीन कार्यात्मकता अपेक्षाकृत छोटी कोशिकाओं (~ 6 माइक्रोन) के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए जो बातचीत करते हैं, और विशेष रूप से सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए लिगांड का जवाब देते हैं।
बी कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रणाली की एंटीबॉडी उत्पादक कोशिकाएं हैं। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए, वे पहले बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) 1 नामक विशिष्ट रिसेप्टर के माध्यम से एक देशी रूप(यानी,गैर-संसाधित) में एंटीजन प्राप्त करते हैं। यह प्रक्रिया लिम्फ नोड बी सेल जोन में होती है। यहां तक कि अगर कुछ एंटीजन लिम्फेटिक तरल पदार्थों के माध्यम से बी सेल तक पहुंच सकते हैं, अधिकांश एंटीजन, विशेष रूप से उच्च आणविक वजन (>70 केडीए, जो लिम्फेटिक नाली के लिए सीमा आकार है) के साथ वास्तव में एक एंटीजन पेश सेल (एपीसी) की सतह पर अपने मूल रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, आमतौर पर लेक्टिन या एफसी रिसेप्टर्स (गैर-विशिष्ट) के माध्यम से एक सबकैप्सुलर साइनस मैक्रोफेज या कूप डेंड्रिटिक सेल। इस कोशिका के साथ संपर्क एक प्रतिरक्षा सिनेप्स के गठन की ओर जाता है जहां बीसीआर एपीसी से जुड़े एंटीजन पर बल डालती है। बीसीआर के लिए एंटीजन का बंधन बीसीआर सिग्नलिंग शुरू करता है, जो बल पैदा करने वाले तंत्र को सक्रिय कर सकता है। ये ताकतें बीसीआर सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती हैं, लेकिन बी कोशिकाओं को निकालने और फिर एंटीजन को आंतरिक बनाने के लिए भी आवश्यक हैं।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि बीसीआर वास्तव में मशीनोसेंसिव2है । उदाहरण के लिए, स्टिस्टर सब्सट्रेट्स ने बढ़ाया बीसीआर सिग्नलिंग3प्रकाश में लाना । इसके अलावा, प्रतिरक्षा सिनेप्स पर उत्पन्न बल एंटीजन के प्रति अपनी आत्मीयता की जांच करने के लिए एकल बीसीआरएस पर खींचती है और इस प्रकार आत्मीयता भेदभाव सुनिश्चित करती है4। इसलिए एंटीजन प्रस्तुति के लिए बी कोशिकाओं की यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच करना और इस प्रतिक्रिया को फंसाया गया रिसेप्टर्स (आईजीजी/आईजीएम)5,आसंजन अणुओं (इंटीग्रिन लिगांड) या औषधीय और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं (यानी, बीसीआर सिग्नलिंग या साइटोस्केलेटन डायनामिक्स के डाउनस्ट्रीम के एक प्रोटीन डाउनस्ट्रीम को मुंह से बाहर करना)6के प्रकार के संदर्भ में विच्छेदन करना दिलचस्प है।
शारीरिक कठोरता के सब्सट्रेट के लिए एक कोशिका की प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका है और, साथ ही, सब्सट्रेट पर लगाए गए अध्ययन बल कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) हैं। टीएफएम में एक लोचदार सब्सट्रेट पर खींचने वाले सेल द्वारा उत्पादित विस्थापन क्षेत्र को देखना होता है। मूल रूप से जेल की विकृति को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी 7 द्वारा इलास्टोमर की झुर्रियों के माध्यम सेदेखागया था, लेकिन फ्लोरेसेंस माइक्रोमोतियों को बेहतर संकल्प के लिए अनुमति दी गई है और तब से मानक8बन गया है। इस विधि का उपयोग अनुवर्ती कोशिकाओं, ऊतकों और यहां तक कि जैल में एम्बेडेड ऑर्गेनॉइड द्वारा लगाए गए कर्षण बल की जांच करने के लिए किया गया है। टीएफएम के कई रूपों को9 विकसित किया गया है, जिसमें सुपररेसोलुशन माइक्रोस्कोपी (यानी, एसटीईड10 या एसआरआरएफ11)के संयोजन, जेल के अपवर्तक सूचकांक में संशोधन के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी12की अनुमति दी गई है, जो नैनो-मुद्रित पैटर्न13द्वारा मोतियों की जगह, और फ्लैट सतह14के बजाय नैनोपाइलर का उपयोग कर रहा है। इन विविधताओं की पूरी समीक्षा के लिए, कॉलिन-यॉर्क एट अल15देखें ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एंटीजन-लेपित सब्सट्रेट पर बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को मापने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है । इन ताकतों को क्लस्टर करने के लिए लिगांड (एंटीजन) पर लागू किया जाता है और बाद में उन्हें एंटीजन-पेश सब्सट्रेट से निकाला जाता है। हमने बी कोशिकाओं के लिए शारीरिक एंटीजन-पेश करने वाले सब्सट्रेट्स, आकार और प्रासंगिक कोटिंग की कठोरता की नकल करने के लिए मानक टीएफएम प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। यह प्रोटोकॉल एक साथ कई कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों और रासायनिक उपचार के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इसका उद्देश्य एकल अणु बल मापन की जांच करना नहीं है, जिसके लिए ऑप्टिकल चिमटी16,आणविक तनाव जांच17,18,बायोमेम्ब्रेन बल जांच19,और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी20 अधिक उपयुक्त तकनीक हैं। अन्य एकल सेल बल माप विधियों की तुलना में (उदाहरण के लिए, माइक्रोपिपेट्स21 या माइक्रोप्लेट22)टीएफएम ~ 300 एनएम के संकल्प के साथ सिनेप्स पर लगाए गए बलों के पूर्ण नक्शे के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है। यह सतह पर लगाए गए बलों में स्पैटीओ-टेम्पोरल पैटर्न की पहचान करने के लिए उपयोगी है और, क्योंकि जेल कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ संगत है, उन्हें विशिष्ट प्रोटीन की भर्ती (उदाहरण के लिए, साइटोस्केलेटन और सिग्नलिंग प्रोटीन) के साथ सहसंबंधित करने के लिए।
हालांकि 3 डी टीएफएम संभव है, यह कठोरता और सेटअप हम इस्तेमाल के साथ संगत नहीं है । 3 डी में विरूपण अन्य अधिक जटिल सेटअप जैसे प्रोट्रूसेशन फोर्स माइक्रोस्कोपी (एएफएम स्कैनिंग एक विकृत झिल्ली जहां कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है)23,24 और लोचदार अनुनादक हस्तक्षेप तनाव माइक्रोस्कोपी (ERISM, प्रकाश के लिए प्रतिध्वनित गुहा के रूप में कार्य करने वाला एक जेल और कुछ नैनोमीटर की सटीकता के साथ सबस्ट्रैट की विकृति को उजागर करने के लिए)25। हालांकि ये तकनीक बहुत आशाजनक है, लेकिन इन्हें अभी तक बी सेल्स में नियोजित नहीं किया गया है । अन्य प्रकार के टीएफएम, जैसे नैनोपिलर14पर, अधिक प्रजनन योग्य सब्सट्रेट्स के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह ज्यामिति नरम कोशिकाओं के अनुकूल नहीं है क्योंकि कोशिका स्तंभों को इंटरपेनेट्रांट करती है, जो विश्लेषण को जटिल बनाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग वास्तव में टी कोशिकाओं में किया गया है ताकि स्तंभों के चारों ओरसंरचनाएंबनाने के लिए कोशिका की क्षमता का पालन किया जा सके ।
अपनी सादगी के बावजूद, पॉलीएक्रिलैमाइड जैल का उपयोग करते हुए टीएफएम कई कोशिकाओं के एक साथ अवलोकन के लिए अनुमति देता है और बेंच और एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप से लैस किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से और सस्ते में लागू किया जा सकता है (हालांकि हम कॉन्फोकल/कताई डिस्क की सिफारिश करते हैं)।
एपीसी की शारीरिक कठोरता की नकल करने के लिए, हमने ~ 500 पीए27 की कठोरता के साथ पॉलीएक्रेलैमाइड जैल का उपयोग किया और एंटीजन को सक्रिय करने के साथ जेल को कार्यात्मक किया। इस प्रोटोकॉल में, हमने पॉलीएक्रेलैमाइड जेल की सतह को मुर्गी अंडे के lysozyme (एचईएल) के साथ कार्यात्मक किया। यह एंटीजन बाध्यकारी साइट की सगाई के माध्यम से बीसीआर की उत्तेजना से उत्पन्न बलों की माप के लिए अनुमति देता है। एमडी 4 चूहों से इस एंटीजन और एचईएल-विशिष्ट बी कोशिकाओं का उपयोग एंटीजन लिगेशन28के जवाब में अपेक्षाकृत एक समान बल उत्पादन सुनिश्चित करता है। हालांकि, अन्य अणुओं (जैसे बी 6 चूहों के लिए एंटी-आईजीएम) को जेल पर ग्राफ्ट किया जा सकता है, लेकिन इन मामलों में उत्पन्न बल अधिक विषम और कम तीव्र हो सकते हैं। क्योंकि बी कोशिकाओं छोटी कोशिकाओं (व्यास ~ 6 μm) हैं, मोतियों की संख्या को अधिकतम लेकिन अभी भी ट्रैक करने योग्य होने के लिए अनुकूलित किया गया है । बड़ी कोशिकाओं के लिए जो अपने सब्सट्रेट्स पर ~ केपीए बल लगाते हैं, कोई भी अपेक्षाकृत विरल मोतियों का उपयोग करके संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर सकता है या विरूपण क्षेत्र के पुनर्निर्माण के लिए सरल कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) का प्रदर्शन कर सकता है। हालांकि, बी लिम्फोसाइट्स जैसी छोटी कोशिकाओं के लिए जो ~ 50 पीए के रूप में छोटे तनाव को लागू करते हैं, विरूपण क्षेत्र का पुनर्निर्माण करते समय वांछित सटीकता प्राप्त करने के लिए एकल कण ट्रैकिंग (कण ट्रैकिंग वेलोसिमेट्री, पीटीवी) का उपयोग आवश्यक है। व्यक्तिगत रूप से मोतियों को मज़बूती से ट्रैक करने के लिए, उद्देश्य लेंस का आवर्धन कम से कम 60x और 1.3 के आसपास इसके संख्यात्मक अपर्चर की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, जैल अपेक्षाकृत पतली (<50 μm) होना चाहिए, अन्यथा मोती दिखाई नहीं देते हैं क्योंकि वे उद्देश्य की कार्य दूरी से ऊपर हैं।
मुख्य प्रोटोकॉल में तीन अनुभाग होते हैं: जेल तैयारी, जेल कार्यात्मकता और इमेजिंग; दो और वर्ग वैकल्पिक हैं और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के एंटीजन निष्कर्षण क्वांटिफिकेशन और इमेजिंग के लिए समर्पित हैं।
यहां वर्णित टीएफएम विधि बी कोशिकाओं की सक्रिय यांत्रिक क्षमताओं के व्यवस्थित अध्ययन के लिए अनुमति देती है। बी कोशिकाओं के संदर्भ में, यह एंटीजन को निकालने और आंतरिक बनाने की क्षमता से संबंधित है। अन्य टीएफएम विधियों की तुलना में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सरल और बल्कि प्रजनन योग्य है: कठोरता, एक ग्लास माइक्रोस्फीयर के इंडेंटेशन द्वारा मापा जाता है और हर्ट्ज मॉडल का उपयोग करके, 400 और 600 पीए के बीच है। इसी तरह के प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग न केवल बी कोशिकाओं35 के लिए किया गया है बल्कि टी कोशिकाओं36के लिए भी किया गया है। नैनोपिलर (टी लिम्फोसाइट्स37के लिए भी उपयोग किया जाता है) की तुलना में यह एक सपाट सजातीय सतह प्रदान करता है, इसलिए परिणामों की व्याख्या करना आसान होता है क्योंकि जेल की बातचीत मुख्य रूप से सतह पर स्पर्शरेखा होने के लिए विवश होती है।
हमने जो प्रोटोकॉल वर्णित किया है, वह एंटीजन-पेश सब्सट्रेट्स पर बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों की स्पेटियोटेम्परल गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करता है। स्थानिक स्तर पर यह बलों के स्थानीयकरण की जानकारी प्रदान करता है, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयोजन में, प्रयोगकर्ता को विशिष्ट अणुओं (यानी, साइटोस्केलेटन या बीसीआर सिग्नलिंग कैस्केड के घटकों) की उपस्थिति के साथ स्थानीय बलों को सहसंबंधित करने में सक्षम बनाता है। लौकिक स्तर पर, मात्राओं को एकीकृत करना संभव है (जैसे कुल ऊर्जा या कुल तनाव) प्रति समय बिंदु एक मूल्य प्रदान करने और शोर को कम करने के लिए। यह समय (विकास और पठार) में कर्षण बल के विकास और स्पंदन पैटर्न की उपस्थिति के अवलोकन के लिए अनुमति देता है।
विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक पहलुओं को निम्नलिखित के रूप में वर्णित किया गया है। (i) सेल घनत्व: सही विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से अलग किया जाना चाहिए। हम एक सेल को विश्लेषण योग्य मानते हैं यदि इसके चारों ओर अपने आकार का एक खाली क्षेत्र है। (ii) ट्रांसमिशन इमेज- प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की कम से कम ट्रांसमिशन इमेज को इकट्ठा करने की सलाह दी जाती है ताकि विश्लेषण में मास्क के रूप में इस्तेमाल किया जा सके। (iii) छवि में मोतियों की संख्या: हम केवल छवियों का विश्लेषण करने का सुझाव देते हैं जहां सिनेप्स में मोतियों की संख्या 30 और 200 (यानी, 1-8 मोती/μm²) के बीच है। कम घनत्व पर्याप्त नक्शा विस्थापन पुनर्निर्माण के लिए अनुमति नहीं देते हैं। उच्च मनका घनत्व एकल कण ट्रैकिंग अविश्वसनीय बनाते हैं। (iv) प्रयोग के दौरान मोतियों की संख्या स्थिर होनी चाहिए; हालांकि, इमेजिंग स्थितियों में छोटे परिवर्तनशीलता के कारण उतार-चढ़ाव हो सकते हैं (विशेष रूप से मोतियों में जो एक दूसरे के बहुत करीब हैं)। फोकस बहाव, यदि होने वाली है, तो ठीक किया जाना चाहिए और समस्याग्रस्त फ्रेम को छोड़ दिया जाना चाहिए। (v) जेल की गुणवत्ता: बहुत अधिक दरारों के साथ जैल, मोतियों के वितरण में परिवर्तनशीलता या जैल जो बहुत मोटी हैं, उन्हें त्याग दिया जाना चाहिए। (vi) सेल प्रकार के आधार पर, बार-बार एक्सपोजर के बाद, देर से समय बिंदुओं (>300 फ्रेम) पर कोशिकाओं को फोटोटॉक्सिक प्रभाव भुगतना पड़ सकता है। डेटा के साथ तुलना की जाने वाली “बेसलाइन” के रूप में कोशिकाओं से रहित मास्क पर कार्यक्रम चलाने की सलाह दी जाती है। यह केवल प्रायोगिक स्थितियों के कारण शोर स्तर का परिमाण प्रदान करता है।
शास्त्रीय आसंजन में कर्षण बल को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले जैल फोकल आसंजन (ऐक्टिन प्रवाह और सिग्नलिंग अणुओं की भर्ती) में होने वाली प्रक्रियाओं की जांच के लिए अनुमति देते हैं- वे बिंदु जहां बलों को38, 39लागू कियाजाताहै। हालांकि, सिनेप्स पर बलों को फोकल आसंजन के माध्यम से लागू नहीं किया जाता है। बी सेल प्रतिरक्षा सिनेप्स में बल उत्पादन के स्थानिक पैटर्न की हाल तक इस विधि का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से जांच नहीं की गई है। टीएफएम का उपयोग करके, हमने पहली बार देखा, बी सेल इम्यून सिनैप्स पर बल पैटर्निंग, जैसा कि हमारे हालिया अध्ययन6में प्रस्तुत किया गया है, लिम्फोसाइट्स के अध्ययन में उत्साहजनक दृष्टिकोण खोल रहा है।
विशेष रूप से, यह विधि बल गणना के लिए संदर्भ छवि के रूप में जेल पर कोशिकाओं के आगमन से पहले ली गई छवि को नियोजित करती है। सामान्य टीएफएम प्रोटोकॉल ट्राइप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करने के बाद प्रयोग के अंत में संदर्भ छवि लेने का सुझाव देते हैं; यह प्रयोगकर्ता को कोशिकाओं में समृद्ध क्षेत्र की तलाश करने की अनुमति देता है। हालांकि यह यहां भी संभव है, ट्रिप्सिन एंटीजन-लेपित जेल से बी कोशिकाओं को टुकड़ी करने में अक्षम है, किसी को टुकड़ी के लिए लंबा इंतजार करने की आवश्यकता होती है और जेल संशोधन और आंदोलनों का जोखिम (जो पूरे डेटा सेट को अनशोषित बनाते हैं) अधिक है।
यहां प्रस्तुत विधि लचीला है और प्रतिरक्षा सिनेप्स पर अन्य संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है क्योंकि यह जेल की सतह पर अन्य प्रोटीन ग्राफ्टिंग के लिए अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, इंटीग्रिन लिगांड और इम्यूनोग्लोबुलिन का परीक्षण किया गया है) और यहां तक कि फ्लोरोसेंट एंटीजन (धारा 4 देखें)। इसके अलावा, कोशिकाएं दवा उपचार और स्थानीय क्षोभ के लिए प्रयोगकर्ता के लिए सुलभ रहती हैं। अंत में, विधि इमेजिंग निश्चित कोशिकाओं के साथ भी संगत है। इन टिप्पणियों के लिए, कवरस्लिप पर जेल बनाने, कोशिकाओं को दागने, स्लाइड पर कवरस्लिप को गोंद करने और तभी बढ़ते मीडिया और एक अन्य कवरस्लिप को जोड़ने की सिफारिश की जाती है। जेल के माध्यम से छवि के क्षरण से बचने के लिए शीर्ष पर जेल के साथ अवलोकन किया जाएगा।
संभावित नुकसान बहुलकीकरण और कोटिंग में जेल में परिवर्तनशीलता हैं। बहुलीकरण की समस्याएं मुख्य रूप से सर्जक/उत्प्रेरक की गुणवत्ता के कारण होती हैं। इसके अलावा, जेल बढ़ सकता है, खासकर यदि असेंबली के ठीक बाद उपयोग नहीं किया जाता है। यह समस्या जेल के यांत्रिक गुणों को नाटकीय रूप से प्रभावित नहीं करती है, लेकिन यह उद्देश्य के लिए मनका परत को पहुंच योग्य बना सकती है, प्रभावी रूप से जेल को बेकार बना सकती है। हम इस समस्या के प्रकट होने पर प्रत्येक स्थिति के लिए अतिरिक्त जैल तैयार करने की सलाह देते हैं। कोटिंग में एक निश्चित परिवर्तनशीलता भी हो सकती है, और हौसले से पतला सल्फो सैंपाएच होना महत्वपूर्ण है।
अंत में, हमने बीसीआर लिगांड द्वारा सक्रिय होने पर प्रतिरक्षा संश्लेषण में बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को मापने के लिए एक सरल, सस्ती और प्रजनन योग्य विधि का वर्णन किया है। इसे उचित रिसेप्टर लिगामेंट के उपयोग के साथ अन्य लिगांड और अन्य प्रकार के लिम्फोसाइट्स (मेमोरी बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, आदि) की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एम बोल्गर-मुनरो का शुक्रिया अदा करते हैं और छवि अधिग्रहण और क्यूरी एनिमल फैसिलिटी में समर्थन के लिए फ्रांस-बायोइमेजिंग नेशनल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर के सदस्य निकॉन इमेजिंग Center@CNRS-इंस्टिट्यूटक्यूरी और पीआईसीटी-आईबिसा, इंस्टिट्यूट क्यूरी, पेरिस को स्वीकार करते हैं । पीपी सीएनआरएस द्वारा समर्थित था। एके और जेपी को पेरिस डेसकार्टेस पीएचडी फैलोशिप और इकोले डॉडेल फायर-प्रोग्राम बेटनकोर्ट द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना को पीपी (एएनआर-10-जेसीजेसी-1504-इम्मुफी) और एएमएलडी (एएनआर-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ईआरसी-स्ट्रैपेसेमी-जीए 243103) को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store aliquoted, protected from humidity |
40% Acrylamide Solution | Biorad | 1610140 | |
Alexa555 microscale protein labeling kit | Molecular Probes | A30007 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
B cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
B-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
2% Bis Solution | Biorad | 161-0142 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100-812-C | |
Coverslip 18mm | VWR | 631-1580 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-151 | Decomplemented (40min @56°C) |
Fluorodishes FD35 | World Precision Instruments, Inc | FD35100 | |
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red | Molecular Probes | F8807 | |
Hen Egg Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Stocked in aliquote 100mg/ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermofisher/Gibco | 11140035 | |
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) | Euromedex | 50406-B | |
PBS (Phosfate Buffer Saline) | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-010 | |
RMPI 1640 – Glutamax I | Thermofisher | 61870-010 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 |