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Bioengineering

बी लिम्फोसाइट एक्टिवेशन का अध्ययन करने के लिए कर्षण बल माइक्रोस्कोपी

Published: July 23, 2020 doi: 10.3791/60947
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institut Curie, PSL Research University, INSERM U932, 2Laboratoire Interdisciplinaire de Physique, Université Joseph Fourier (Grenoble 1)

Summary

यहां हम बी कोशिकाओं पर कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों को करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम नरम पॉलीएक्रीलामाइड जैल की तैयारी और उनके कार्यात्मकीकरण के साथ-साथ माइक्रोस्कोप पर डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण का सारांश का वर्णन करते हैं।

Abstract

कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) एक सब्सट्रेट पर एक सेल द्वारा उत्पादित बलों की माप को सक्षम बनाता है। यह तकनीक एक लोचदार सब्सट्रेट पर खींचने वाली कोशिका द्वारा उत्पादित प्रयोगात्मक रूप से मनाए गए विस्थापन क्षेत्र से कर्षण बल माप का अनुमान लगाता है। यहां, हमने बी सेल रिसेप्टर के एंटीजन सगाई द्वारा सक्रिय होने पर बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बल क्षेत्र की स्थानिक और लौकिक संरचना की जांच करने के लिए टीएफएम को अनुकूलित किया। जेल कठोरता, मनका घनत्व, और प्रोटीन कार्यात्मकता अपेक्षाकृत छोटी कोशिकाओं (~ 6 माइक्रोन) के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए जो बातचीत करते हैं, और विशेष रूप से सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए लिगांड का जवाब देते हैं।

Introduction

बी कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रणाली की एंटीबॉडी उत्पादक कोशिकाएं हैं। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए, वे पहले बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) 1 नामक विशिष्ट रिसेप्टर के माध्यम से एक देशी रूप(यानी,गैर-संसाधित) में एंटीजन प्राप्त करते हैं। यह प्रक्रिया लिम्फ नोड बी सेल जोन में होती है। यहां तक कि अगर कुछ एंटीजन लिम्फेटिक तरल पदार्थों के माध्यम से बी सेल तक पहुंच सकते हैं, अधिकांश एंटीजन, विशेष रूप से उच्च आणविक वजन (>70 केडीए, जो लिम्फेटिक नाली के लिए सीमा आकार है) के साथ वास्तव में एक एंटीजन पेश सेल (एपीसी) की सतह पर अपने मूल रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, आमतौर पर लेक्टिन या एफसी रिसेप्टर्स (गैर-विशिष्ट) के माध्यम से एक सबकैप्सुलर साइनस मैक्रोफेज या कूप डेंड्रिटिक सेल। इस कोशिका के साथ संपर्क एक प्रतिरक्षा सिनेप्स के गठन की ओर जाता है जहां बीसीआर एपीसी से जुड़े एंटीजन पर बल डालती है। बीसीआर के लिए एंटीजन का बंधन बीसीआर सिग्नलिंग शुरू करता है, जो बल पैदा करने वाले तंत्र को सक्रिय कर सकता है। ये ताकतें बीसीआर सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती हैं, लेकिन बी कोशिकाओं को निकालने और फिर एंटीजन को आंतरिक बनाने के लिए भी आवश्यक हैं।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि बीसीआर वास्तव में मशीनोसेंसिव2है । उदाहरण के लिए, स्टिस्टर सब्सट्रेट्स ने बढ़ाया बीसीआर सिग्नलिंग3प्रकाश में लाना । इसके अलावा, प्रतिरक्षा सिनेप्स पर उत्पन्न बल एंटीजन के प्रति अपनी आत्मीयता की जांच करने के लिए एकल बीसीआरएस पर खींचती है और इस प्रकार आत्मीयता भेदभाव सुनिश्चित करती है4। इसलिए एंटीजन प्रस्तुति के लिए बी कोशिकाओं की यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच करना और इस प्रतिक्रिया को फंसाया गया रिसेप्टर्स (आईजीजी/आईजीएम)5,आसंजन अणुओं (इंटीग्रिन लिगांड) या औषधीय और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं (यानी, बीसीआर सिग्नलिंग या साइटोस्केलेटन डायनामिक्स के डाउनस्ट्रीम के एक प्रोटीन डाउनस्ट्रीम को मुंह से बाहर करना)6के प्रकार के संदर्भ में विच्छेदन करना दिलचस्प है।

शारीरिक कठोरता के सब्सट्रेट के लिए एक कोशिका की प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका है और, साथ ही, सब्सट्रेट पर लगाए गए अध्ययन बल कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) हैं। टीएफएम में एक लोचदार सब्सट्रेट पर खींचने वाले सेल द्वारा उत्पादित विस्थापन क्षेत्र को देखना होता है। मूल रूप से जेल की विकृति को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी 7 द्वारा इलास्टोमर की झुर्रियों के माध्यम सेदेखागया था, लेकिन फ्लोरेसेंस माइक्रोमोतियों को बेहतर संकल्प के लिए अनुमति दी गई है और तब से मानक8बन गया है। इस विधि का उपयोग अनुवर्ती कोशिकाओं, ऊतकों और यहां तक कि जैल में एम्बेडेड ऑर्गेनॉइड द्वारा लगाए गए कर्षण बल की जांच करने के लिए किया गया है। टीएफएम के कई रूपों को9 विकसित किया गया है, जिसमें सुपररेसोलुशन माइक्रोस्कोपी (यानी, एसटीईड10 या एसआरआरएफ11)के संयोजन, जेल के अपवर्तक सूचकांक में संशोधन के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी12की अनुमति दी गई है, जो नैनो-मुद्रित पैटर्न13द्वारा मोतियों की जगह, और फ्लैट सतह14के बजाय नैनोपाइलर का उपयोग कर रहा है। इन विविधताओं की पूरी समीक्षा के लिए, कॉलिन-यॉर्क एट अल15देखें ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एंटीजन-लेपित सब्सट्रेट पर बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को मापने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है । इन ताकतों को क्लस्टर करने के लिए लिगांड (एंटीजन) पर लागू किया जाता है और बाद में उन्हें एंटीजन-पेश सब्सट्रेट से निकाला जाता है। हमने बी कोशिकाओं के लिए शारीरिक एंटीजन-पेश करने वाले सब्सट्रेट्स, आकार और प्रासंगिक कोटिंग की कठोरता की नकल करने के लिए मानक टीएफएम प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। यह प्रोटोकॉल एक साथ कई कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों और रासायनिक उपचार के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इसका उद्देश्य एकल अणु बल मापन की जांच करना नहीं है, जिसके लिए ऑप्टिकल चिमटी16,आणविक तनाव जांच17,18,बायोमेम्ब्रेन बल जांच19,और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी20 अधिक उपयुक्त तकनीक हैं। अन्य एकल सेल बल माप विधियों की तुलना में (उदाहरण के लिए, माइक्रोपिपेट्स21 या माइक्रोप्लेट22)टीएफएम ~ 300 एनएम के संकल्प के साथ सिनेप्स पर लगाए गए बलों के पूर्ण नक्शे के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है। यह सतह पर लगाए गए बलों में स्पैटीओ-टेम्पोरल पैटर्न की पहचान करने के लिए उपयोगी है और, क्योंकि जेल कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ संगत है, उन्हें विशिष्ट प्रोटीन की भर्ती (उदाहरण के लिए, साइटोस्केलेटन और सिग्नलिंग प्रोटीन) के साथ सहसंबंधित करने के लिए।

हालांकि 3 डी टीएफएम संभव है, यह कठोरता और सेटअप हम इस्तेमाल के साथ संगत नहीं है । 3 डी में विरूपण अन्य अधिक जटिल सेटअप जैसे प्रोट्रूसेशन फोर्स माइक्रोस्कोपी (एएफएम स्कैनिंग एक विकृत झिल्ली जहां कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है)23,24 और लोचदार अनुनादक हस्तक्षेप तनाव माइक्रोस्कोपी (ERISM, प्रकाश के लिए प्रतिध्वनित गुहा के रूप में कार्य करने वाला एक जेल और कुछ नैनोमीटर की सटीकता के साथ सबस्ट्रैट की विकृति को उजागर करने के लिए)25। हालांकि ये तकनीक बहुत आशाजनक है, लेकिन इन्हें अभी तक बी सेल्स में नियोजित नहीं किया गया है । अन्य प्रकार के टीएफएम, जैसे नैनोपिलर14पर, अधिक प्रजनन योग्य सब्सट्रेट्स के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह ज्यामिति नरम कोशिकाओं के अनुकूल नहीं है क्योंकि कोशिका स्तंभों को इंटरपेनेट्रांट करती है, जो विश्लेषण को जटिल बनाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग वास्तव में टी कोशिकाओं में किया गया है ताकि स्तंभों के चारों ओरसंरचनाएंबनाने के लिए कोशिका की क्षमता का पालन किया जा सके ।

अपनी सादगी के बावजूद, पॉलीएक्रिलैमाइड जैल का उपयोग करते हुए टीएफएम कई कोशिकाओं के एक साथ अवलोकन के लिए अनुमति देता है और बेंच और एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप से लैस किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से और सस्ते में लागू किया जा सकता है (हालांकि हम कॉन्फोकल/कताई डिस्क की सिफारिश करते हैं)।

एपीसी की शारीरिक कठोरता की नकल करने के लिए, हमने ~ 500 पीए27 की कठोरता के साथ पॉलीएक्रेलैमाइड जैल का उपयोग किया और एंटीजन को सक्रिय करने के साथ जेल को कार्यात्मक किया। इस प्रोटोकॉल में, हमने पॉलीएक्रेलैमाइड जेल की सतह को मुर्गी अंडे के lysozyme (एचईएल) के साथ कार्यात्मक किया। यह एंटीजन बाध्यकारी साइट की सगाई के माध्यम से बीसीआर की उत्तेजना से उत्पन्न बलों की माप के लिए अनुमति देता है। एमडी 4 चूहों से इस एंटीजन और एचईएल-विशिष्ट बी कोशिकाओं का उपयोग एंटीजन लिगेशन28के जवाब में अपेक्षाकृत एक समान बल उत्पादन सुनिश्चित करता है। हालांकि, अन्य अणुओं (जैसे बी 6 चूहों के लिए एंटी-आईजीएम) को जेल पर ग्राफ्ट किया जा सकता है, लेकिन इन मामलों में उत्पन्न बल अधिक विषम और कम तीव्र हो सकते हैं। क्योंकि बी कोशिकाओं छोटी कोशिकाओं (व्यास ~ 6 μm) हैं, मोतियों की संख्या को अधिकतम लेकिन अभी भी ट्रैक करने योग्य होने के लिए अनुकूलित किया गया है । बड़ी कोशिकाओं के लिए जो अपने सब्सट्रेट्स पर ~ केपीए बल लगाते हैं, कोई भी अपेक्षाकृत विरल मोतियों का उपयोग करके संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर सकता है या विरूपण क्षेत्र के पुनर्निर्माण के लिए सरल कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) का प्रदर्शन कर सकता है। हालांकि, बी लिम्फोसाइट्स जैसी छोटी कोशिकाओं के लिए जो ~ 50 पीए के रूप में छोटे तनाव को लागू करते हैं, विरूपण क्षेत्र का पुनर्निर्माण करते समय वांछित सटीकता प्राप्त करने के लिए एकल कण ट्रैकिंग (कण ट्रैकिंग वेलोसिमेट्री, पीटीवी) का उपयोग आवश्यक है। व्यक्तिगत रूप से मोतियों को मज़बूती से ट्रैक करने के लिए, उद्देश्य लेंस का आवर्धन कम से कम 60x और 1.3 के आसपास इसके संख्यात्मक अपर्चर की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, जैल अपेक्षाकृत पतली (<50 μm) होना चाहिए, अन्यथा मोती दिखाई नहीं देते हैं क्योंकि वे उद्देश्य की कार्य दूरी से ऊपर हैं।

मुख्य प्रोटोकॉल में तीन अनुभाग होते हैं: जेल तैयारी, जेल कार्यात्मकता और इमेजिंग; दो और वर्ग वैकल्पिक हैं और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के एंटीजन निष्कर्षण क्वांटिफिकेशन और इमेजिंग के लिए समर्पित हैं।

Protocol

1. जेल की तैयारी

  1. जेल समर्थन का सीलनीकरण
    1. 2 मिनट के लिए एक यूवी लैंप के साथ कवरस्लिप या ग्लास-बॉटम पेट्री डिश (जिसे जेल समर्थन के रूप में उपयोग किया जाएगा) को सक्रिय करें (अवशिष्ट ओजोन के संपर्क से बचने के लिए यूवी लैंप के संपर्क से पहले 30 एस रुको)।
    2. 5 मिनट के लिए 200 माइक्रोन एमिनोप्रोपिल्रिमेथॉक्सीलेन (एपीटीएमएस) का उपयोग करके कवरस्लिप/ग्लास-बॉटम डिश को सीलनीकृत करें। यह जेल के सहसंयोजक बाध्यकारी के लिए समर्थन तैयार करेगा।
    3. कवरस्लिप/ग्लास-बॉटम डिश को अल्ट्रा-प्योर वॉटर से अच्छी तरह धो लें ।
    4. वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करके कवरस्लिप/ग्लास-बॉटम डिश को सुखाएं।
  2. जेल को समतल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 18 मिमी कवरलिप की तैयारी
    1. कवरस्लिप तैयार करने के लिए सबसे पहले उन्हें सिरेमिक कवरस्लिप होल्डर में डाल दें। फिर कवरस्लिप धारक को एक छोटे बीकर (50 एमएल) में डाल दें और कवरस्लिप पर सिलिकॉनाइजिंग रिएजेंट (4 डिग्री सेल्सियस, पुन: प्रयोज्य पर संग्रहीत) डालें, उन्हें पूरी तरह से कवर करना सुनिश्चित करें।
    2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और इनक्यूबेट के साथ बीकर को कवर करें। इंतजार करते समय, अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ एक बड़ी बीकर (500 एमएल) भरें। सिलिकॉनिंग रिएजेंट में 3 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, कवरस्लिप धारक को कवरस्लिप के साथ पानी की बीकर में स्थानांतरित करें।
    3. अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ कवरस्लिप को अच्छी तरह से कुल्ला करें, उन्हें अच्छी तरह से सुखाएं और पेपर वाइप्स पर रखें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, अगले खंड में तुरंत आगे बढ़ें।
  3. जेल बहुलीकरण
    1. 0.5 kPa के जैल के लिए, 2% बिस्क्रेलामाइड (क्रॉसलिंकर) के 30 माइक्रोन के साथ 40% एक्रिलामाइड के 75 माइक्रोन और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 895 माइक्रोन मिलाएं। इस प्रीमिक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक स्टोर किया जा सकता है।
    2. 0.5 किलो जेल प्रीमिक्स के 167 माइक्रोन करने के लिए, एक स्नान सोनिकेटर (50-100 डब्ल्यू और आवृत्ति 40 किलोहर्ट्ज की शक्ति के साथ मानक बेंच अल्ट्रासोनिक क्लीनर) में 5 मिनट के लिए मोतियों, भंवर और सोनीकेट के 1% (1.67 माइक्रोएल) जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से संरक्षित मिश्रण रखें।
      नोट: जब तक सर्जक (TEMED) नहीं जोड़ा जाता है तब तक प्रीमिक्स पॉलीमराइज नहीं होता है।
    3. बहुलीकरण को उत्प्रेरित करने के लिए, 10% w/v अमोनियम पर्सुल्फेट (एपीएस) का 1% (1.67 माइक्रोएल) जोड़ें।
    4. बहुलीकरण शुरू करने के लिए, 0.1% (0.2 माइक्रोल) एन, एन, एन,एन,,एन'-टेट्रामेथाइलेनिडाइमाइन (टेमेड) जोड़ें। एक पिपेट के साथ मिलाएं। एक बार एपीएस और TEMED जोड़ा गया है, जेल तेजी से बहुलक तो जेल कास्टिंग के लिए जल्दी से आगे बढ़ना ।
  4. जेल कास्टिंग
    1. प्रत्येक कवरस्लिप/ग्लास-बॉटम डिश पर जेल मिश्रण के पिपेट 9 माइक्रोन (केंद्र में ड्रॉप, चित्रा 1A)
    2. सिलनाइज्ड/हाइड्रोफोबिक कवरस्लिप रखें और जेल(चित्रा 1B)को समतल करें । संदंश का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए कवरस्लिप दबाएं कि जेल कवरस्लिप(चित्रा 1C)के पूरे क्षेत्र में फैलता है जब तक कि यह लीक होने लगता है।
    3. कवरस्लिप/ग्लास-बॉटम डिश को एक बड़े पेट्री डिश में उलटा करें और जेल की सतह(चित्रा 1D)की ओर जाने वाले मोतियों को मजबूर करने के लिए इसे बेंच पर टैप करें ।
    4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और एक आर्द्र कक्ष में कमरे के तापमान पर बहुलक के लिए 1 घंटे के लिए छोड़ दें (यानी, वाष्पीकरण को रोकने के लिए पकवान के ऊपर एक गीला ऊतक डाल) ।
    5. 1 एच के बाद, कवरलिप रिलीज की सुविधा के लिए नमूने में पीबीएस जोड़ें। ध्यान से, सुई का उपयोग करके कवरस्लिप को हटा दें (विभिन्न सिलेन्स के साथ कोटिंग को जेल, चित्रा 1Eसे कवरस्लिप के आसान छीलने की अनुमति चाहिए)।
    6. पीबीएस में जेल छोड़ दें।
      नोट: जैल को अब 5-7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन 48 घंटे के भीतर उनका उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

2. जेल कार्यात्मकता

  1. 10 एमएम एचईपीई बफर में 0.5 मिलीग्राम/एमएल पर सल्फोस्सिओसिनिमिडिल 6-(4'-एजिडो-2'-निट्रोफेनिलमिनो) हेक्सानोएट (सल्फो सैंपा) समाधान तैयार करें। इसे एक सप्ताह तक एल्यूमीनियम फॉयल से ढके 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. पीबीएस को जैल से एएसपाइप करें।
  3. कमरे के तापमान(चित्रा 1F)पर जेल में सल्फो सैंपाएच के 150 माइक्रोन जोड़ें।
  4. सुल्फो सैंपा की साइटों को फोटोएक्टिवेट करने और इसे जेल की सतह से चिपकने के लिए 2 मिनट के लिए यूवी उपचार के लिए जेल का पर्दाफाश करें।
  5. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं(चित्रा 1G)।
  6. चरण 2.2-2.5 दोहराएं।
  7. प्रत्येक जेल में एचईएल (100 माइक्रोन/एमएल) के 250 माइक्रोन जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी(चित्रा 1H)से ढके रखते हुए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में रात भर इनक्यूबेट करें।
  8. एचईएल एंटीजन निकालें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    नोट: एचईएल एक एंटीजन के रूप में और एक आसंजन अणु के रूप में दोनों कार्य करता है। इसे अन्य अणुओं द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है जो रिसेप्टर (उदाहरण के लिए, एक एंटी-माउस आईजीएम, गोजातीय सीरम एल्बुमिन, ओवलबुमिन) से बांधते हैं या इंटीग्रीन लिगामेंट्स (उदाहरण के लिए, ICAM1 LFA1 के लिए बाध्यकारी) के साथ मिश्रित होते हैं। यदि आवश्यक हो, तो एंटीजन निष्कर्षण एचईएल के फ्लोरोसेंट संस्करण के साथ देखा जा सकता है (प्रोटीन लेबलिंग किट के साथ अणु को धुंधला करके प्राप्त किया जाता है, चरण 4 देखें)। ध्यान दें कि थोक में दी गई एकाग्रता ग्लास पर जेल पर समान सतह एकाग्रता नहीं दे सकती है: यदि प्रत्यक्ष तुलना की आवश्यकता होती है तो इसे माध्यमिक धुंधला के साथ निर्धारित करने की आवश्यकता होती है।

3. सेल लोडिंग और इमेजिंग

  1. इमेजिंग से पहले, जैल से पीबीएस को हटा दें और बी सेल मीडिया (आरपीएमआई 1640, 10% विघटित भ्रूण बछड़े सीरम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2% सोडियम पायरुवेट, 50uM मर्केप्टोथेनॉलॉलॉलन और 1X गैर आवश्यक अमीनो एसिड) के 500μL जोड़ें और उन्हें आरटी में इक्विलिबरेट करने दें।
  2. सेल की तैयारी
    1. एक नकारात्मक चयन प्रोटोकॉल के अनुसार तिल्ली से प्राथमिक बी कोशिकाओं को शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें)। विशिष्ट अंतिम बी सेल यील्ड 1 x 107 कोशिकाओं के आसपास है। इसे बी सेल मीडियम में 3 x10 6 कोशिकाओं/एमएल पर केंद्रित करें (आरपीएमआई-1640 10% भ्रूण बछड़े सीरम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.1% मर्केप्टोथेनॉल और 2% सोडियम पाइरुवेट के साथ पूरक)।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे तक की आवश्यकता के अनुसार स्टोर कोशिकाएं।
    3. छवि अधिग्रहण से पहले कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. इमेजिंग
    1. थर्मल और (संभवतः) सीओ2 नियंत्रण के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: भले ही एक कॉन्फोकल या कताई-डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, एक उद्देश्य/पिनहोल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो एक पिक्सेल आकार और लेफ्टिनेंट;200 एनएम को विश्लेषण चरण (जैसे, 60x, एनए 1.3) में मोतियों को आराम से ट्रैक करने की अनुमति देता है। Epifluorescence माइक्रोस्कोपी भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह शोर अनुपात के लिए कम संकेत प्रदान करता है और व्यक्तिगत मनका ट्रैकिंग कठिन बना सकते हैं ।
    2. मोतियों की दो मुख्य परतें नीचे और जेल के शीर्ष पर दिखाई देंगी। जेल प्लेन पर फोकस करें।
      नोट: एक अच्छा जेल एक तारों से जड़ा आकाश के रूप में दिखाई देगा, मोतियों के साथ लगभग समान रूप से एक ही विमान पर वितरित ।
    3. 5 एस की फ्रेम दर के साथ 30 मिनट के लिए अधिग्रहण कार्यक्रम (यह प्रयोग की जरूरतों के अनुकूल है, उदाहरण के लिए, अन्य रंगों का अधिग्रहण, जेड स्टैक, आदि प्राप्त करें)
    4. जेल से मीडिया को आकांक्षी, जेल पर मीडिया के बारे में २०० μL छोड़ । माइक्रोस्कोप पर जेल की स्थिति और मोतियों की सतह परत और जेल पर एक अच्छा भी क्षेत्र लगता है।
    5. कोशिकाओं के 80 माइक्रोन जोड़ें (ध्यान बनाए रखने के लिए जेल को छूने से बचें)।
    6. सुनिश्चित करें कि ध्यान अभी भी सही है और कोशिकाओं को क्षेत्र में उतरते देखा जा सकता है (संचारित प्रकाश के तहत) । कोशिकाओं के जेल तक पहुंचने से पहले अधिग्रहण लॉन्च करें।
    7. जेल, कंपन, या फोकस बहाव के साथ आकस्मिक संपर्क के मामले में, ध्यान समायोजित करें।
      नोट: आराम से जेल की छवि एकत्र करना महत्वपूर्ण है और यह जेल पर कोशिकाओं के आगमन से पहले ली गई किसी भी छवि हो सकती है।

4. फ्लोरोसेंट एचईएल निष्कर्षण प्रयोग

  1. फ्लोरोसेंट एचईएल को फ्लोरोसेंट डाई (एलेक्सा 555 जैसे मोतियों से अलग रंग) को बांधकर तैयार करें, सामग्री की तालिकादेखें।
  2. चरण 2.7 में, पारंपरिक एचईएल को फ्लोरोसेंट एचईएल के साथ प्रतिस्थापित करें।
  3. फोटो-ब्लीचिंग से बचने के लिए कम रोशनी सेटिंग्स या कम फ्रेम दर (जैसे, 2 फ्रेम प्रति मिनट) के साथ छवियों को प्राप्त करें।
  4. एचईएल निष्कर्षण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक फ्रेम I (टी) के लिए सेल क्षेत्र पर एकीकृत तीव्रता की गणना करें और सूत्र के अनुसार फ्रेम 0 की तीव्रता I (0)द्वारा सामान्यीकृत किया गया:
    Equation 1
    नोट: फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित एंटीजन दिखाई नहीं देता है (शायद जेल की सतह पर फ्लोरोफोर की शमन के कारण), लेकिन जेल पर इसकी उपस्थिति को एंटी-एचईएल और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सत्यापित किया जा सकता है। यह सत्यापित किया जा सकता है कि फ्लोरोफोर वास्तव में फ्लोरोसेंट है जब इसे जेल से अलग करके एंटी-एचईएल के साथ लेपित एक कवरस्लिप के साथ अलग किया जाता है और इसे एक माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (कवरस्लिप पर)6के साथ खुलासा करता है। निकाले गए एंटीजन का सिग्नल बहुत मंद होता है और कई बार मोतियों के लीक होने से नकाबपोश हो जाते हैं। यदि कोई केवल एंटीजन निष्कर्षण में रुचि रखता है, तो मोतियों के बिना जेल तैयार करने की सिफारिश की जाती है (चरण 1.3.2 और 1.4.3 को छोड़ दें)।

5. फ्लोरेसेंस इमेजिंग

  1. जंगली प्रकार (उदाहरण के लिए, लाइफएक्ट-जीएफपी या मायोसिन II जीएफपी चूहों से) के लिए किए गए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की तिल्ली से बी सेल को शुद्ध करके फ्लोरोसेंट बी कोशिकाएं प्राप्त करें।
  2. इमेजिंग फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के लिए, पानी विसर्जन लंबी दूरी 40x-100x उद्देश्य के साथ एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप (यदि संभव हो) का उपयोग करें ।
  3. ब्लीचिंग से बचने के लिए एक्सपोजर अवधि और फ्रेम रेट कम रखें।
    नोट: जेड में बिंदु प्रसार समारोह जेल की उपस्थिति से अत्यधिक अपमानित है, इसलिए हम एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करने का सुझाव देते हैं । पानी की सूई के उद्देश्यों के साथ ईमानदार माइक्रोस्कोपी रहते हैं उत्सर्जन पथ में (गोलाकार) कोशिका (और सेल नाभिक) की उपस्थिति से प्रेरित मजबूत गोलाकार विचलन से ग्रस्त है।

6. विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण सामान्य रूप से सामान्य रूप से किया जाता है पहले बहाव के लिए पूरे ढेर को ठीक करके, प्रत्येक फ्रेम में मोतियों को ढूंढना, संदर्भ फ्रेम (कोशिकाओं की अनुपस्थिति में लिया गया) के संबंध में उनके आंदोलनों पर नज़र रखना, विस्थापन क्षेत्र को इंटरपोलिंग करना और फोरियर ट्रांसफॉर्म29का उपयोग करके तनाव प्राप्त करने के लिए समस्या को उलटना। इस उद्देश्य के लिए, हम एक ऑनलाइन भंडार30से डाउनलोड करने योग्य ImageJ मैक्रो और MATLAB कार्यक्रमों के संयोजन का उपयोग करने का सुझाव देते हैं ।

  1. छवियों के ढेर के रूप में ImageJ में फिल्म खोलें
  2. मैक्रो "Crop_and_save.ijm" चलाएं
    1. "आयत" उपकरण के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों का चयन करें और उन्हें 'टी' कुंजी का उपयोग करके आरओआई सूची में जोड़ें।
    2. सेल को क्रॉप करते समय, कम से कम 5-10 पिक्सल इम्मोबाइल मोतियों के क्षेत्र को शामिल करना सुनिश्चित करें। उन कोशिकाओं को बाहर करें जो सीमाओं के बहुत करीब हैं या विश्लेषण से अन्य कोशिकाओं के लिए। जब 'ओके' पर क्लिक करें।
    3. मैक्रो सेल का मुखौटा प्रस्तावित करता है: यदि यह "ओके" पर संतोषजनक क्लिक है। यदि संतोषजनक नहीं है, तो "ठीक नहीं" पर क्लिक करें और फिर मैन्युअल रूप से किसी भी चयन उपकरण (जैसे "फ्रीहैंड" या "ओवल") के साथ एक बंद क्षेत्र का चयन करें और "जारी रखें" पर क्लिक करें।
  3. MATLAB खोलें और "TFM_v1.m" चलाएं।
    1. आवश्यक मापदंडों को इनपुट करें: विशेष रूप से छवि गुणों (पिक्सेल आकार, अधिग्रहण के समय अंतराल) और जेल गुणों (युवा मॉड्यूलस ई, पॉइसन अनुपात) की जांच करें।
    2. संदर्भ छवि डिफ़ॉल्ट रूप से पहली बार होना तय है। यदि आवश्यक हो तो इसे दूसरे फ्रेम में सेट करें या बाहरी फ़ाइल लोड करने के लिए इसे "0" पर सेट करें।
    3. मूल फ़ाइल के रूप में एक ही निर्देशिका में सॉफ्टवेयर के आउटपुट का पता लगाएं (विवरण के लिए User_notice.pdf फ़ाइल देखें)। इसमें मोतियों का एक प्रारंभिक ट्रैक ("FILENAME.fig"), समय के साथ संकुचन ऊर्जा का एक भूखंड ("FILENAME_energy.अंजीर"), सेल (ऊर्जा, क्षेत्र, क्षणों, आदि) पर एकीकृत कई मात्राओं की एक मेज शामिल है "FILENAME_finaltable.चटाई", विस्थापन और बल क्षेत्र युक्त एक संरचना, मनका, विस्थापन क्षेत्र, तनाव और ऊर्जा की फिल्में (जिसे किसी भी लवी पाठक के साथ खोला जा सकता है)।
      नोट: इनपुट मापदंडों में, "विंडो आकार" खिड़की है जिस पर विस्थापन को इंटरपोलेट किया जाता है, इसलिए तनाव और विस्थापन क्षेत्र का अंतिम समाधान होता है। यह कुछ (डिफ़ॉल्ट रूप से चार) पिक्सल के लिए सेट है। इसे कम करना उचित नहीं है क्योंकि यह कृत्रिम रूप से उन क्षेत्रों को इंटरपोलिंग करके संकल्प में वृद्धि करेगा जहां कोई मोती नहीं हैं ।

Representative Results

कोशिकाओं के आकार को देखते हुए, एल्गोरिदम जो सहसंबद्ध तकनीकों (जैसे कण छवि वेलोसिमेट्री) के माध्यम से मोतियों के विस्थापन मानचित्र को निकालते हैं, सामान्य रूप से बहुत सटीक नहीं हैं। हालांकि आवश्यक संकल्प की डिग्री के आधार पर, कोई भी आसानी से मुफ्त फिजी/इमेजजे प्लगइन31, 32का उपयोग करके गुणात्मक परिणाम प्राप्त कर सकता है। हालांकि यह दृष्टिकोण उत्तेजक बनाम गैर-उत्तेजक स्थितियों की तुलना करने के लिए पर्याप्त है, एक गहन विश्लेषण के लिए हम एक ऑनलाइन भंडार30से डाउनलोड किए जा सकने वाले हमारे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो मोतियों को व्यक्तिगत रूप से ट्रैक करता है और व्यक्तिगत मोतियों के विस्थापन33के इंटरपोलेशन के रूप में एक निश्चित समय बिंदु पर विस्थापन क्षेत्र मानचित्र प्रदान करता है। इस बिंदु पर कई मात्राएं संभव हैं। उदाहरण के लिए (विस्थापन संभालने से केवल जेल की सतह के लिए तनाव स्पर्शरेखा के कारण होता है) सॉफ्टवेयर भी प्रत्येक बिंदु पर तनाव प्रदान करता है जिसके कारण वह विशिष्ट विस्थापन मानचित्र है। यह एक प्रकार का "उलटा समस्या" है: एक निश्चित बिंदु पर विस्थापन अन्य बिंदुओं पर लागू सभी बलों के योग पर निर्भर करता है। "इनरॉइट एल्गोरिदम" सब्सट्रेट के भौतिक मापदंडों को ध्यान में रखता है: इसकी कठोरता (युवा मॉड्यूलस) और पॉइसन अनुपात। प्रत्यक्ष एल्गोरिदम आमतौर पर बहुत सटीक होते हैं लेकिन कम्प्यूटेशनल रूप से महंगे होते हैं। फोरियर ट्रांसफॉर्म पर आधारित एल्गोरिदम, हमारी तरह, अनिवार्य रूप से फोरियर स्पेस में एक डिकोोल्यूशन करते हैं और अधिक कुशल होते हैं लेकिन कुछ त्रुटियों से ग्रस्त होते हैं (मुख्य रूप से इंटरपोलेशन चरण के कारण)। इन एल्गोरिदम को आम तौर पर एक पैरामीटर की ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है जो छोटे स्थानीय (और संभावित विरूपणात्मक) विस्थापन को तनाव क्षेत्र की गणना में बहुत प्रासंगिक बनने से रोकता है (तिखोनोव नियमितीकरण पैरामीटर8,29; संवाद खिड़की में "नियमितीकरण" चर; यहां हम आम तौर पर 5 x 10-19)के बराबर सेट करते हैं। अधिक उन्नत व्याख्या और विश्लेषण के लिए, जैसे कि स्पैटियो-टेम्पोरल सहसंबंध, स्थानीय आंदोलन, फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ सहसंबंध, हम क्षेत्र में विशेषज्ञों के साथ सहयोग करने की सलाह देते हैं। कम्प्यूटेशनल तरीकों पर समीक्षा के लिए श्वार्ज एट अल9देखें ।

जैसा कि ऊपर बताया गया है, सही मनका छवियां "तारों से जड़ा आकाश", उज्ज्वल धब्बों का एक समान और यादृच्छिक वितरण(चित्रा 2 ए)की तरह दिखती हैं। जब मोतियों की संख्या बहुत कम(चित्रा 2 बी)या छवि फोकस(चित्रा 2C)से बाहर होती है तो डेटा और विश्लेषण विश्वसनीय नहीं होते हैं। एक बार बी कोशिकाओं जेल की सतह पर बसे हैं, कोशिकाओं के नीचे मोती जेल पर सेल द्वारा लगाए गए कर्षण बल के कारण स्थानांतरित करने के लिए शुरू करते हैं । फ्रेम जिनके लिए मोती ट्रैक नहीं कर रहे हैं, उन्हें छोड़ दिया जाना चाहिए।

एक जांच के रूप में, "संदर्भ फ्रेम" की तुलना करने वाले मोतियों के आंदोलन को आंखों द्वारा देखना संभव है, आमतौर पर सब्सट्रेट के साथ सेल के पहले संपर्क से पहले। अनुमानित परिणाम एकल कण ट्रैकिंग (जैसे, ट्रैकमेट, फिजी 34)से प्राप्त किए जा सकते हैं जैसा कि चित्र 3 एमें किया गया है। विश्लेषण एक नियंत्रण के रूप में संदर्भ छवि ("FILENAME.fig") में मोतियों का विभाजन प्रदान करता है।

हमारे द्वारा प्रस्तावित सॉफ्टवेयर के साथ, कोई भी विस्थापन(चित्रा 3B)और तनाव क्षेत्र (प्रत्येक पिक्सेल पर स्थानीय तनाव का वेक्टर और विस्थापन क्षेत्र, चित्रा 3Cसे उलटा द्वारा प्राप्त प्रत्येक बार बिंदु) प्राप्त कर सकता है। सेल के क्षेत्र में एकीकृत विस्थापन और बल क्षेत्रों का स्केलर उत्पाद सेल द्वारा सब्सट्रेट(चित्र 4 ए)पर लगाए गए कुल कार्य प्रदान करता है। इस गणना प्रोटोकॉल के चरण 6.2 में पेश की गई सेल के मुखौटा की आवश्यकता होती है।

दो जैविक स्थितियों की तुलना करने के लिए (एचईएल बनाम गैर-सक्रिय सब्सट्रेट बीएसए, या जंगली प्रकार बनाम नॉक-आउट) की तुलना करने के लिए औसत वक्र(चित्रा 4B)या इससे भी अधिक सिंथेटिक रूप से, पिछली बार के अंक (20 मिनट) पर औसत मूल्य की गणना करना उपयोगी है जहां ऊर्जा एक पठार(चित्रा 4C)तक पहुंचती है। जब बलों की स्थानिक जानकारी प्रासंगिक होती है तो प्रत्येक स्थिति(चित्रा 4डी)के एकल समय बिंदुओं की तुलना करना संभव है। गहरे विश्लेषण के लिए कुमारी एट अल6 का उल्लेख करें ।

फ्लोरेसेंस एंटीजन निष्कर्षण समय चूक का एक उदाहरण चित्र 5 एमें दिखाया गया है: सिनेप्से में फ्लोरेसेंस संकेतों की प्रगतिशील उपस्थिति जेल से एंटीजन टुकड़ी का संकेत देती है। 15 कोशिकाओं पर अपने आत्मविश्वास अंतराल (मतलब की मानक त्रुटि) के साथ औसत निष्कर्षण वक्र चित्रा 5Bमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: जेल की तैयारी और इसके कार्यात्मकता का योजनाबद्ध प्रदर्शन। प्रोटोकॉल में कदम बताए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न गुणों के मनका छवियों के तीन उदाहरण। (A)शोर अनुपात और सही घनत्व के लिए सही संकेत के साथ मनका छवि का उदाहरण । (ख)मोतियों की बहुत अपर्याप्त संख्या के साथ छवियों के उदाहरण और(सी)फोकस विमान से बाहर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: बल क्षेत्र निकालने के लिए छवियों का प्रसंस्करण। (ए)मोतियों की छवि का उदाहरण (सफेद में सेल की रूपरेखा, संचरण छवि से निकाली गई), समय पर मनका ट्रैकिंग = 5 मिनट (लाल ओवरले) और विस्थापन (तीर) समय टी = 0 मिनट (स्केल बार 5 माइक्रोन) के सापेक्ष। (ख)इंटरपोलेटेड विस्थापन क्षेत्र (वेक्टर तरकश और परिमाण मानचित्र के रूप में दर्शाया गया है, तीर विस्थापन [एनएम] के आनुपातिक हैं; दाईं ओर रंग पट्टी देखें); नीचे: परिमाण की एक चिकनी छवि (एक बाइक्यूबिक फ़ंक्शन के साथ इंटरपोलेशन द्वारा प्राप्त)। (ग)पैनल बी में विस्थापन क्षेत्र से तनाव क्षेत्र (वेक्टर तरकश और परिमाण मानचित्र के रूप में प्रतिनिधित्व; तीर कतरनी तनाव [Pa] के आनुपातिक हैं; दाईं ओर रंग पट्टी देखें); नीचे: परिमाण की एक चिकनी छवि (एक बाइक्यूबिक फ़ंक्शन के साथ इंटरपोलेशन द्वारा प्राप्त)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: जानकारी का उदाहरण है कि बल और विस्थापन क्षेत्रों से निकाला जा सकता है । (A)एक ही कोशिका के लिए समय में ऊर्जा के विकास का उदाहरण: एक पठार चरण (ग्रे में प्रकाश डाला) के बारे में 10 मिनट के बाद पता चलता है ।(ख)एचईएल (सक्रिय) कोटेड जेल पर चढ़ाया गया 65 कोशिकाओं के लिए सापेक्ष पठार स्तरों की औसत ऊर्जा घटता और(सी)की तुलना और बीएसए (गैर-सक्रिय) कोटेड जेल (मीडियन ± इंटरक्वार्टिकल पर्वतमाला) पर 35 कोशिकाओं को दिखाया गया है, मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व के लिए किया गया था। (घ)एचईएल के लिए तनाव के समय-चूक रंग नक्शे और बीएसए स्थिति को नियंत्रित करें; परिमाण और तरकश दोनों भूखंड दिखाए जाते हैं। इन छवियों को कुमारी एट अल6से अनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: फ्लोरोसेंट एंटीजन के साथ प्रयोगों का उदाहरण। (ए)फ्लोरोसेंट एचईएल के निष्कर्षण का समय चूक (नीचे: अधिकतम, स्केल बार = 3μm का प्रतिशत)। (ख)समय के साथ एंटीजन सभा (मतलब ± SEM, n = 15) । इन छवियों को कुमारी एट अल6से अनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित टीएफएम विधि बी कोशिकाओं की सक्रिय यांत्रिक क्षमताओं के व्यवस्थित अध्ययन के लिए अनुमति देती है। बी कोशिकाओं के संदर्भ में, यह एंटीजन को निकालने और आंतरिक बनाने की क्षमता से संबंधित है। अन्य टीएफएम विधियों की तुलना में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सरल और बल्कि प्रजनन योग्य है: कठोरता, एक ग्लास माइक्रोस्फीयर के इंडेंटेशन द्वारा मापा जाता है और हर्ट्ज मॉडल का उपयोग करके, 400 और 600 पीए के बीच है। इसी तरह के प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग न केवल बी कोशिकाओं35 के लिए किया गया है बल्कि टी कोशिकाओं36के लिए भी किया गया है। नैनोपिलर (टी लिम्फोसाइट्स37के लिए भी उपयोग किया जाता है) की तुलना में यह एक सपाट सजातीय सतह प्रदान करता है, इसलिए परिणामों की व्याख्या करना आसान होता है क्योंकि जेल की बातचीत मुख्य रूप से सतह पर स्पर्शरेखा होने के लिए विवश होती है।

हमने जो प्रोटोकॉल वर्णित किया है, वह एंटीजन-पेश सब्सट्रेट्स पर बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों की स्पेटियोटेम्परल गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करता है। स्थानिक स्तर पर यह बलों के स्थानीयकरण की जानकारी प्रदान करता है, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयोजन में, प्रयोगकर्ता को विशिष्ट अणुओं (यानी, साइटोस्केलेटन या बीसीआर सिग्नलिंग कैस्केड के घटकों) की उपस्थिति के साथ स्थानीय बलों को सहसंबंधित करने में सक्षम बनाता है। लौकिक स्तर पर, मात्राओं को एकीकृत करना संभव है (जैसे कुल ऊर्जा या कुल तनाव) प्रति समय बिंदु एक मूल्य प्रदान करने और शोर को कम करने के लिए। यह समय (विकास और पठार) में कर्षण बल के विकास और स्पंदन पैटर्न की उपस्थिति के अवलोकन के लिए अनुमति देता है।

विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक पहलुओं को निम्नलिखित के रूप में वर्णित किया गया है। (i) सेल घनत्व: सही विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से अलग किया जाना चाहिए। हम एक सेल को विश्लेषण योग्य मानते हैं यदि इसके चारों ओर अपने आकार का एक खाली क्षेत्र है। (ii) ट्रांसमिशन इमेज- प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की कम से कम ट्रांसमिशन इमेज को इकट्ठा करने की सलाह दी जाती है ताकि विश्लेषण में मास्क के रूप में इस्तेमाल किया जा सके। (iii) छवि में मोतियों की संख्या: हम केवल छवियों का विश्लेषण करने का सुझाव देते हैं जहां सिनेप्स में मोतियों की संख्या 30 और 200 (यानी, 1-8 मोती/μm²) के बीच है। कम घनत्व पर्याप्त नक्शा विस्थापन पुनर्निर्माण के लिए अनुमति नहीं देते हैं। उच्च मनका घनत्व एकल कण ट्रैकिंग अविश्वसनीय बनाते हैं। (iv) प्रयोग के दौरान मोतियों की संख्या स्थिर होनी चाहिए; हालांकि, इमेजिंग स्थितियों में छोटे परिवर्तनशीलता के कारण उतार-चढ़ाव हो सकते हैं (विशेष रूप से मोतियों में जो एक दूसरे के बहुत करीब हैं)। फोकस बहाव, यदि होने वाली है, तो ठीक किया जाना चाहिए और समस्याग्रस्त फ्रेम को छोड़ दिया जाना चाहिए। (v) जेल की गुणवत्ता: बहुत अधिक दरारों के साथ जैल, मोतियों के वितरण में परिवर्तनशीलता या जैल जो बहुत मोटी हैं, उन्हें त्याग दिया जाना चाहिए। (vi) सेल प्रकार के आधार पर, बार-बार एक्सपोजर के बाद, देर से समय बिंदुओं (>300 फ्रेम) पर कोशिकाओं को फोटोटॉक्सिक प्रभाव भुगतना पड़ सकता है। डेटा के साथ तुलना की जाने वाली "बेसलाइन" के रूप में कोशिकाओं से रहित मास्क पर कार्यक्रम चलाने की सलाह दी जाती है। यह केवल प्रायोगिक स्थितियों के कारण शोर स्तर का परिमाण प्रदान करता है।

शास्त्रीय आसंजन में कर्षण बल को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले जैल फोकल आसंजन (ऐक्टिन प्रवाह और सिग्नलिंग अणुओं की भर्ती) में होने वाली प्रक्रियाओं की जांच के लिए अनुमति देते हैं- वे बिंदु जहां बलों को38, 39लागू कियाजाताहै। हालांकि, सिनेप्स पर बलों को फोकल आसंजन के माध्यम से लागू नहीं किया जाता है। बी सेल प्रतिरक्षा सिनेप्स में बल उत्पादन के स्थानिक पैटर्न की हाल तक इस विधि का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से जांच नहीं की गई है। टीएफएम का उपयोग करके, हमने पहली बार देखा, बी सेल इम्यून सिनैप्स पर बल पैटर्निंग, जैसा कि हमारे हालिया अध्ययन6में प्रस्तुत किया गया है, लिम्फोसाइट्स के अध्ययन में उत्साहजनक दृष्टिकोण खोल रहा है।

विशेष रूप से, यह विधि बल गणना के लिए संदर्भ छवि के रूप में जेल पर कोशिकाओं के आगमन से पहले ली गई छवि को नियोजित करती है। सामान्य टीएफएम प्रोटोकॉल ट्राइप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करने के बाद प्रयोग के अंत में संदर्भ छवि लेने का सुझाव देते हैं; यह प्रयोगकर्ता को कोशिकाओं में समृद्ध क्षेत्र की तलाश करने की अनुमति देता है। हालांकि यह यहां भी संभव है, ट्रिप्सिन एंटीजन-लेपित जेल से बी कोशिकाओं को टुकड़ी करने में अक्षम है, किसी को टुकड़ी के लिए लंबा इंतजार करने की आवश्यकता होती है और जेल संशोधन और आंदोलनों का जोखिम (जो पूरे डेटा सेट को अनशोषित बनाते हैं) अधिक है।

यहां प्रस्तुत विधि लचीला है और प्रतिरक्षा सिनेप्स पर अन्य संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है क्योंकि यह जेल की सतह पर अन्य प्रोटीन ग्राफ्टिंग के लिए अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, इंटीग्रिन लिगांड और इम्यूनोग्लोबुलिन का परीक्षण किया गया है) और यहां तक कि फ्लोरोसेंट एंटीजन (धारा 4 देखें)। इसके अलावा, कोशिकाएं दवा उपचार और स्थानीय क्षोभ के लिए प्रयोगकर्ता के लिए सुलभ रहती हैं। अंत में, विधि इमेजिंग निश्चित कोशिकाओं के साथ भी संगत है। इन टिप्पणियों के लिए, कवरस्लिप पर जेल बनाने, कोशिकाओं को दागने, स्लाइड पर कवरस्लिप को गोंद करने और तभी बढ़ते मीडिया और एक अन्य कवरस्लिप को जोड़ने की सिफारिश की जाती है। जेल के माध्यम से छवि के क्षरण से बचने के लिए शीर्ष पर जेल के साथ अवलोकन किया जाएगा।

संभावित नुकसान बहुलकीकरण और कोटिंग में जेल में परिवर्तनशीलता हैं। बहुलीकरण की समस्याएं मुख्य रूप से सर्जक/उत्प्रेरक की गुणवत्ता के कारण होती हैं। इसके अलावा, जेल बढ़ सकता है, खासकर यदि असेंबली के ठीक बाद उपयोग नहीं किया जाता है। यह समस्या जेल के यांत्रिक गुणों को नाटकीय रूप से प्रभावित नहीं करती है, लेकिन यह उद्देश्य के लिए मनका परत को पहुंच योग्य बना सकती है, प्रभावी रूप से जेल को बेकार बना सकती है। हम इस समस्या के प्रकट होने पर प्रत्येक स्थिति के लिए अतिरिक्त जैल तैयार करने की सलाह देते हैं। कोटिंग में एक निश्चित परिवर्तनशीलता भी हो सकती है, और हौसले से पतला सल्फो सैंपाएच होना महत्वपूर्ण है।

अंत में, हमने बीसीआर लिगांड द्वारा सक्रिय होने पर प्रतिरक्षा संश्लेषण में बी कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को मापने के लिए एक सरल, सस्ती और प्रजनन योग्य विधि का वर्णन किया है। इसे उचित रिसेप्टर लिगामेंट के उपयोग के साथ अन्य लिगांड और अन्य प्रकार के लिम्फोसाइट्स (मेमोरी बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, आदि) की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एम बोल्गर-मुनरो का शुक्रिया अदा करते हैं और छवि अधिग्रहण और क्यूरी एनिमल फैसिलिटी में समर्थन के लिए फ्रांस-बायोइमेजिंग नेशनल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर के सदस्य निकॉन इमेजिंग Center@CNRS-इंस्टिट्यूटक्यूरी और पीआईसीटी-आईबिसा, इंस्टिट्यूट क्यूरी, पेरिस को स्वीकार करते हैं । पीपी सीएनआरएस द्वारा समर्थित था। एके और जेपी को पेरिस डेसकार्टेस पीएचडी फैलोशिप और इकोले डॉडेल फायर-प्रोग्राम बेटनकोर्ट द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना को पीपी (एएनआर-10-जेसीजेसी-1504-इम्मुफी) और एएमएलडी (एएनआर-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ईआरसी-स्ट्रैपेसेमी-जीए 243103) को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) Sigma-Aldrich 281778 Store aliquoted, protected from humidity
40% Acrylamide Solution Biorad 1610140
Alexa555 microscale protein labeling kit Molecular Probes A30007
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
B cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi Biotec 130-090-862
B-mercaptoethanol Gibco 31350-010
2% Bis Solution Biorad 161-0142
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100-812-C
Coverslip 18mm VWR 631-1580
Fetal calf serum PAA A15-151 Decomplemented (40min @56°C)
Fluorodishes FD35 World Precision Instruments, Inc FD35100
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red Molecular Probes F8807
Hen Egg Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Stocked in aliquote 100mg/ml
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermofisher/Gibco 11140035
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) Euromedex 50406-B
PBS (Phosfate Buffer Saline) Gibco 10010-015
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-010
RMPI 1640 – Glutamax I Thermofisher 61870-010
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2
Sodium pyruvate Gibco 11360-039
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 161 बायोइंजीनियरिंग सॉफ्ट जैल ट्रैक्शन फोर्स एंटीजन बायोफिजिक्स इम्यूनोलॉजी बी सेल
बी लिम्फोसाइट एक्टिवेशन का अध्ययन करने के लिए कर्षण बल माइक्रोस्कोपी
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Kumari, A., Pineau, J.,… More

Kumari, A., Pineau, J., Lennon-Duménil, A. M., Balland, M., Pierobon, P. Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation. J. Vis. Exp. (161), e60947, doi:10.3791/60947 (2020).

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