Her presenterer vi en protokoll som brukes til å utføre trekkraft kraft mikroskopi eksperimenter på B-celler. Vi beskriver fremstillingen av myke polyakrylamidgeler og deres funksjonalisering, samt datainnsamling ved mikroskopet og et sammendrag av dataanalyse.
Trekkraftmikroskopi (TFM) muliggjør måling av krefter produsert av en celle på et substrat. Denne teknikken infers trekkraft målinger fra en eksperimentelt observert forskyvning felt produsert av en celle trekke på en elastisk substrat. Her tilpasset vi TFM for å undersøke den romlige og timelige strukturen i kraftfeltet som utøves av B-celler når det aktiveres av antigenengasjement av B-cellereseptoren. Gelstivhet, perletetthet og proteinfunksjonalisering må optimaliseres for studiet av relativt små celler (~ 6 μm) som samhandler med, og reagerer spesielt på ligandes for celleoverflatereseptorer.
B-celler er antistoffproduserende celler i immunsystemet. For å aktivere den adaptive immunresponsen får de først antigenet i opprinnelig form (det vil si ikke-bearbeidet) gjennom en bestemt reseptor kalt B-cellereseptor (BCR)1. Denne prosessen skjer i lymfeknuten B cellesone. Selv om noen antigener kan nå B-cellen gjennom lymfatiske væsker, de fleste antigener, spesielt med høy molekylvekt (> 70 kDa, som er grensestørrelsen for lymfatiske rør) er faktisk presentert i sin opprinnelige form på overflaten av en antigen presentere celle (APC), vanligvis en subcapsular sinus makrofag eller follikulær dendrittisk celle, gjennom lectin eller Fc reseptorer (ikke-spesifikke). Kontakten med denne cellen fører til dannelsen av en immunsynapse hvor BCR utøver kraft på APC-tilknyttede antigener. Bindingen av et antigen til BCR initierer BCR-signalering, som kan aktivere kraftgenererende mekanismer. Disse kreftene kan være viktige for å forsterke BCR-signalering, men er også avgjørende for B-celler å trekke ut og deretter internalisere antigenet.
Nyere studier har vist at BCR er faktisk mekanosensitiv2. Stivere substrater fremkaller for eksempel forbedret BCR-signalering3. Videre, kraft generert på immunsynapse trekker på enkelt BCRs å sondere sin affinitet til antigen og dermed sikre affinitet diskriminering4. Det er derfor interessant å undersøke den mekaniske responsen fra B-celler til antigenpresentasjon og å dissekere denne responsen når det gjelder type reseptorer innblandet (IgG/IgM)5, vedheftmolekyler (integrinske ligande) eller i farmakologisk og genmodifiserte celler (det vil si deaktivering av et protein nedstrøms av BCR-signalering eller cytoskeletondynamikk)6.
En enkel metode for å observere responsen fra en celle til et substrat av fysiologisk stivhet og samtidig studiekrefter som utøves på substratet er Traction Force Microscopy (TFM). TFM består av å observere forskyvningsfeltet produsert av cellen som trekker på et elastisk substrat. Opprinnelig ble deformasjonen av gelen observert gjennom rynker i elastomeret selv ved fasekontrastmikroskopi7, men innsetting av fluorescensmikroperler som fiducial markører tillatt for bedre oppløsning og har siden blitt standard8. Denne metoden har blitt brukt til å undersøke trekkraft kraften utøves av tilhengerceller, vev, og selv organoider innebygd i geler. Flere varianter av TFM erutviklet 9 inkludert, kombinasjon med superresolution mikroskopi (det vil si STED10 eller SRRF11),endring av brytningsindeksen av gelen for å tillate TIRF mikroskopi12, erstatte perler ved nano-tryktemønstre 13, og bruke nanopillar i stedet for flat overflate14. For en fullstendig gjennomgang av disse variasjonene, se Colin-York et al.15.
Protokollen som presenteres her beskriver en prosedyre for å måle krefter utøves av B-celler på et antigenbelagt substrat. Disse kreftene påføres på ligandene (antigen) for å gruppere dem og deretter trekke dem ut fra antigen-presentere substrat. Vi har tilpasset standard TFM-protokollen for å etterligne stivheten til fysiologiske antigen-presentere substrater, størrelsen og relevant belegg for B-cellene. Denne protokollen tillater studie av flere celler samtidig og kan brukes sammen med fluorescensmikroskopiteknikker og kjemiske behandlinger. Det tar imidlertid ikke sikte på å sondere enkeltmolekylkraftmålinger, som optiske pinsett16, molekylære spenningssonder17,18, biomembrane kraftsonder19, og atomkraftmikroskopi20 er mer egnede teknikker. Sammenlignet med andre enkeltcellede kraftmålingsmetoder (f.eks. mikropipetter21 eller mikroplater22) gjør TFM det mulig å rekonstruksjon av et komplett kart over kreftene som utøves ved synapsen med en oppløsning på ~ 300 nm. Dette er nyttig for å identifisere spatio-temporale mønstre i kreftene som utøves på overflaten, og som gelen er kompatibel med konfokal avbildning, for å korrelere dem med rekruttering av spesifikke proteiner (for eksempel cytoskeleton og signalproteiner).
Selv om 3D TFM er mulig, er den ikke kompatibel med stivheten og oppsettet vi brukte. Deformasjoner i 3D kan oppnås ved andre mer komplekse oppsett som fremspringkraftmikroskopi (AFM som skanner en deformerbar membran der cellene er belagt)23,24 og elastisk resonatorinterferens stressmikroskopi (ERISM, en gel som fungerer som resonerende hulrom for lys og utheving av deformasjoner av substratet med nøyaktighet av noen få nanometer)25. Selv om disse teknikkene er svært lovende, har de ennå ikke vært ansatt i B-celler. Andre typer TFM, for eksempel på nanopillars14,kan brukes til å ha mer reproduserbare underlag. Denne geometrien er imidlertid ikke tilpasset myke celler, da cellen interpenetrates pilarene, noe som kompliserer analysen. Denne tilnærmingen har faktisk blitt brukt i T-celler for å observere cellens evne til å bygge strukturer rundt søylene26.
Til tross for sin enkelhet, TFM ved hjelp av polyakrylamid geler gjør det mulig for samtidig observasjon av mange celler og kan enkelt og billig implementeres i ethvert laboratorium utstyrt med en benk og en epifluorescence mikroskop (selv om vi anbefaler konfokal / spinning disk).
For å etterligne den fysiologiske stivheten til en APC, brukte vi polyakrylamidgeler med en stivhet på ~ 500 Pa27 og funksjonaliserte gelen med aktivering av antigener. I denne protokollen funksjonaliserte vi overflaten av polyakrylamidgelen med hønseegglysozym (HEL). Dette gjør det mulig for måling av krefter generert ved stimulering av BCR gjennom engasjement av antigenbindingsstedet. Bruken av dette antigenet og HEL-spesifikke B-cellene fra MD4-mus sikrer relativt jevn kraftgenerering som svar på antigenligation28. Andre molekyler (som anti-IgM for B6-mus) kan imidlertid transplanteres på gelen, men kreftene som genereres i disse tilfellene kan være mer heterogene og mindre intense. Fordi B-celler er små celler (diameter ~ 6 μm), har antall perler blitt optimalisert for å være maksimalt, men fortsatt sporbart. For store celler som utøver ~ kPa krefter på sine substrater, kan man oppnå tilfredsstillende resultater ved hjelp av relativt sparsomme perler eller utføre enkle partikkelbilde velocimetry (PIV) for å rekonstruere deformasjonsfeltet. Men for små celler som B-lymfocytter som utøver stress så lite som ~ 50 Pa, er bruk av enkeltpartikkelsporing nødvendig (partikkelsporing velocimetry, PTV) for å oppnå ønsket nøyaktighet når rekonstruering av deformasjonsfeltet. For å kunne spore perler individuelt, må forstørrelsen av objektivobjektivet være minst 60x og den numeriske blenderåpningen rundt 1,3. Dermed må gelene være relativt tynne (<50 μm), ellers er perlene ikke synlige da de er over målstandens arbeidsavstand.
Hovedprotokollen består av tre seksjoner: gel forberedelse, gel funksjonalisering og avbildning; to seksjoner er valgfrie og er dedikert til antigenekstraksjonsekvantifisering og avbildning av fluorescerende celler.
TFM-metoden som er beskrevet her, muliggjør systematisk studie av de aktive mekaniske egenskapene til B-celler. I sammenheng med B-celler er dette relatert til evnen til å trekke ut og internalisere antigenet. Sammenlignet med andre TFM-metoder, er protokollen som presenteres her enkel og ganske reproduserbar: stivheten, målt ved innrykk av en glassmikrosfære og bruk av Hertz-modell, er mellom 400 og 600 Pa. Lignende protokoller har blitt brukt ikke bare forB-celler 35, men også for T-celler36. Sammenlignet med nanopillars (også brukt for T lymfocytter37) det gir en flat homogen overflate, derfor resultatene er lettere å tolke som samspillet mellom gelen er hovedsakelig begrenset til å være tangential til overflaten.
Protokollen vi beskrev gir tilgang til spatiotemporal dynamikken i kreftene utøves av B-celler på antigen-presentere substrater. På romlig nivå gir dette informasjon om lokalisering av krefter, og i kombinasjon med fluorescensmikroskopi gjør det mulig for eksperimentereren å korrelere lokale krefter med tilstedeværelsen av spesifikke molekyler (det vil si komponenter i cytoskeleton eller BCR-signalkaskade). På timelig nivå er det mulig å integrere mengder (for eksempel total energi eller total stress) for å gi en verdi per tidspunkt og redusere støyen. Dette gjør det mulig for observasjon av utviklingen av trekkraft kraft i tid (vekst og platå) og tilstedeværelsen av pulsatile mønstre.
Kritiske eksperimentelle aspekter for analysen er beskrevet som følgende. (i) Celletetthet: For å utføre en korrekt analyse, bør cellene skilles tilstrekkelig. Vi anser en celle for å være analyseres hvis den har et tomt område av sin egen størrelse rundt den. (ii) Overføringsbilde: Det anbefales å samle minst et overføringsbilde av cellene under forsøket som skal brukes som maske i analysen. (iii) Antall perler i bildet: Vi foreslår å analysere bare bilder der antall perler i synapsen er mellom 30 og 200 (det vil si 1–8 perler/μm²). Lavere tettheter tillater ikke tilstrekkelig kartforskyvning rekonstruksjon. Høye perletettheter gjør enkel partikkelsporing upålitelig. (iv) Antall perler bør være konstant under forsøket; Svingninger kan imidlertid oppstå på grunn av liten variasjon i bildeforholdene (spesielt i perler som er for nær hverandre). Fokusdrift, hvis det oppstår, må korrigeres og problematiske rammer skal kastes. (v) Gelkvalitet: geler med for mange sprekker, variasjon i perler distribusjon eller geler som er for tykke bør kastes. (vi) Avhengig av celletypen, etter gjentatte eksponeringer, kan celler på sene tidspunkter (> 300 rammer) lide fototoksiske effekter. Det anbefales å kjøre programmet på en maske blottet for celler som en “baseline” som skal sammenlignes med dataene. Dette gir en størrelsesorden av støynivået utelukkende på grunn av de eksperimentelle forholdene.
Geler som brukes til å måle trekkraft i klassisk vedheft tillater undersøkelse av prosesser som oppstår ved fokal vedheft (actin flyter og rekruttering av signalmolekyler) – punktene der krefter brukes38,39. Imidlertid brukes ikke krefter ved synapse gjennom fokale adhesjoner. Spatiotemporal mønster av kraftgenerering ved B-celle immunsynapse har ikke blitt kvantitativt undersøkt ved hjelp av denne metoden før nylig. Ved hjelp av TFM observerte vi for første gang, kraftmønster ved B-cellemunmunsynapse, som presentert i vår sistestudie 6, og åpnet oppmuntrende perspektiver i studiet av lymfocytter.
Spesielt bruker denne metoden et bilde tatt før ankomsten av cellene på gelen som et referansebilde for kraftberegningen. Vanlige TFM-protokoller foreslår å ta referansebildet på slutten av eksperimentet, etter å ha løsnet cellene med trypsin; Dette gjør at eksperimentereren kan lete etter et område rikt på celler. Selv om dette er mulig her også, trypsin er ganske ineffektiv på å løsne B-celler fra antigenbelagt gel, må man vente lenge på løsrivelse og risikoen for gel modifikasjon og bevegelser (som gjør hele datasettet uutnyttelig) er høyere.
Metoden som presenteres her er fleksibel og kan brukes til å studere effekten av andre signaler på immunsynapse som det gjør det mulig å pode andre proteiner på geloverflaten (f.eks integrinske ligandends og immunglobuliner har blitt testet) og til og med fluorescerende antigen (se avsnitt 4). Videre forblir celler tilgjengelige for eksperimentereren for narkotikabehandling og lokale perturbasjoner. Til slutt er metoden også kompatibel med bilde av faste celler. For disse observasjonene anbefales det å lage gelen på en dekkslipp, flekke cellene, lime dekkslippen på et lysbilde og først da legge til monteringsmedier og en annen dekkslip. Observasjon vil da bli gjort med gelen på toppen for å unngå nedbrytning av bildet gjennom gelen.
Mulige fallgruver er variasjonen i gel i polymerisering og belegg. Polymeriseringsproblemer skyldes hovedsakelig kvaliteten på initiativtaker/katalysator. Også gelen kan blåse opp, spesielt hvis den ikke brukes rett etter montering. Dette problemet ser ikke ut til å dramatisk påvirke gelens mekaniske egenskaper, men det kan gjøre perlelaget utilgjengelig for målet, noe som effektivt gjør gelen ubrukelig. Vi anbefaler å tilberede ekstra geler for hver tilstand når dette problemet oppstår. Det kan også være en viss variasjon i belegget, og det er avgjørende å ha nyfortynnet Sulfo SANPAH.
Til slutt har vi beskrevet en enkel, billig og reproduserbar metode for å måle kreftene som utøves av B-celler ved immunologisk synapse når de aktiveres av BCR ligand. Det kan tilpasses for å studere reaksjonen på andre ligands og andre typer lymfocytter (minne B-celler, T-celler, etc.) ved bruk av riktig reseptor ligand.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker M. Bolger-Munro for kritisk lesing og anerkjenner Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie og PICT-IBiSA, Institut Curie, Paris, medlem av Den nasjonale forskningsinfrastrukturen i Frankrike-BioImaging, for støtte til bildeoppkjøp og Curie Animal Facility. PP ble støttet av CNRS. AK og JP ble støttet av Paris Descartes PhD-stipend og Ecole Doctorale FIRE- Program Bettencourt. Dette prosjektet ble finansiert av tilskudd til PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) og AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store aliquoted, protected from humidity |
40% Acrylamide Solution | Biorad | 1610140 | |
Alexa555 microscale protein labeling kit | Molecular Probes | A30007 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
B cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
B-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
2% Bis Solution | Biorad | 161-0142 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100-812-C | |
Coverslip 18mm | VWR | 631-1580 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-151 | Decomplemented (40min @56°C) |
Fluorodishes FD35 | World Precision Instruments, Inc | FD35100 | |
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red | Molecular Probes | F8807 | |
Hen Egg Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Stocked in aliquote 100mg/ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermofisher/Gibco | 11140035 | |
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) | Euromedex | 50406-B | |
PBS (Phosfate Buffer Saline) | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-010 | |
RMPI 1640 – Glutamax I | Thermofisher | 61870-010 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 |