Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Ekstracellulær multienhedsoptagelse fra teleosts olfaktoriske nerve

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/60962
Automatic Translation
1, 1,2
1Centro de Ciências do Mar, 2Universidade do Algarve

Summary

Ekstracellulær multienhedsregistrering fra olfaktoriske nerve er en følsom, robust og reproducerbar metode til vurdering af olfaktoriske følsomhed i marine fisk. Det registrerer primære sensoriske input og er uafhængig af ekstern saltholdighed.

Abstract

Nylige undersøgelser har vist, at havet forsuring påvirker olfaktoriske-drevet adfærd hos fisk. Dette kan til dels skyldes en reduktion i olfaktoriske følsomhed i højt PCO2/lavt pH-vand. For at vurdere virkningerne af forsuring af havet eller olfaktoriske følsomhed i havfisk generelt foreslår vi, at ekstracellulær multienhedsregistrering fra olfaktoriske nerve er den foretrukne metode. Selvom den er invasiv, er den følsom, robust, reproducerbar og uafhængig af ekstern saltholdighed (i modsætning til f.eks. elektro-olfactogrammet [EOG]). Desuden registrerer den en primær sensorisk indgang til CNS, før enhver central behandling. Vi viser, at denne metode kan vise en reduktion i olfaktoriske følsomhed, der er både midlertidig og odorant-afhængige, ved hjælp af en række aminosyrer til at konstruere koncentration-respons kurver og beregne tærsklerne for detektion.

Introduction

Fisk er stærkt afhængige af olfaction for mange aspekter af deres liv, herunder at finde mad, undgå rovdyr, vurdering af potentielle hjælpere og migration, blandt andre1,2,3. Derfor vurdere olfaktoriske følsomhed i fisk (Hvad lugter de? Hvor følsomme er de for disse forbindelser?) er afgørende for fuldt ud at forstå disse processer. Desuden kan menneskeskabte virkninger på miljøet, såsom forsuring af havene og forurening, have dybtgående virkninger på olfaktoriske system, selv på fremlejeniveau, fordi det nødvendigvis er i tæt kontakt med det omgivende vand4. In vivo elektrofysiologi er den eksperimentelle tilgang valg til at vurdere olfaktoriske følsomhed i fisk. Der findes tre hovedteknikker: elektro-olfactogrammet (EOG), elektroencephalogrammet (EEG), der er registreret fra olfaktoriske pære, og optagelse af flere enheder fra olfaktoriske nerve5.

EOG er den mest udbredte af disse tre6. Det er en jævnstrøm (DC) felt potentiale registreres over olfaktoriske epitel og menes at være den opsummerede generator potentialer af disse olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) reagerer på en given odorant. Men som det er registreret i vandet, snarere end inde i fisken, amplitude af respons er ikke kun afhængig af signalet genereret af fisken, men også af ledningsevne af det omgivende vand; jo højere ledningsevne (eller jo lavere modstand), jo lavere vil være amplituden. Dette kan betyde , at EOG er en mindre følsom metode i havvand end ferskvand7.

EEG registreret fra olfaktoriske pære er også meget udbredt i undersøgelsen af olfaction i fisk. Olfaktoriske pære er dog den første ordre behandling center for olfaktoriske sensoriske input8; det er meget organiseret i glomeruli, og derfor den registrerede reaktion afhænger i høj grad af placeringen af optagelsen elektroder. For eksempel, input fra ORNs afsløre aminosyrer behandles af glomeruli i den laterale region af olfaktoriske pærer, mens der fra konspecific-afledte kemikalier er rettet til den mediale region9,10,11,12. Feromonnal input kan rettes til stærkt lokaliseret glomeruli inden for olfaktoriske pære. Afhængigt af de pågældende arters anatomi er den ideelle registreringsposition for et givet lugtmiddel muligvis ikke let tilgængelig.

Multi-enhed optagelse fra olfaktoriske nerve omgår de vigtigste problemer med EOG og EEG skitseret ovenfor. Da det registrerer handlinger potentialer passerer ned axoner af ORNs fra epitel til pæren, det er en primær sensorisk signal. Og som det er registreret inde i fisken, amplitude af respons er uafhængig af ydre saltholdighed. Ikke desto mindre har det naturligvis nogle ulemper. For det første, afhængigt af arternes anatomi, er der behov for en mere omfattende operation for at afsløre olfaktoriske nerve end for EOG. For det andet, fordi signalet er mindre end EOG, kræver det lidt mere sofistikeret og derfor dyrt udstyr. En generel beskrivelse af andre eksperimentelle tilgange er givet ved John Caprio5. Formålet med denne artikel er at skitsere, hvordan du registrerer ekstracellulære multi-enhed svar fra olfaktoriske nerve af guldbarre (Sparus aurata) in vivo til aminosyre lugtstoffer som et eksempel på denne teknik, og hvordan man kan identificere, og overvinde, nogle af de mere almindelige problemer i et sådant eksperiment.

Protocol

Vedligeholdelse og forsøg af dyr blev udført i certificerede forsøgsfaciliteter og fulgte den portugisiske nationale lovgivning (DL 113/2013) under en »gruppe-1«-licens fra Veterinærdirektoratet, Ministeriet for Landbrug, Udvikling af Landdistrikter og Fiskeri i Portugal. Da denne protokol omfatter håndtering af dyr, skal den godkendes af det lokale og/eller nationale organ, der regulerer velfærden for dyr, der anvendes til videnskabelige forsøg, og desuden skal forskerne have den nødvendige uddannelse og de nødvendige licenser til at udføre sådanne procedurer.

1. Forberedelse af stimulus

BEMÆRK: De fleste fisk har meget følsomt olfaktoriske system, således stor omhu skal tages, når udarbejdelsen af olfaktoriske stimuli, der skal anvendes i forsøget. Det glas, der anvendes til at udgør stimuli, skal vaskes i 5% blegemiddel (natriumhypochlorit), skylles grundigt med vand fra hanen og tørres. Umiddelbart før brug skylles glasset grundigt med havvand (det samme vand, der anvendes til at gøre stimulusfortyndinger). Pas på, at intet af dette vand kommer i kontakt med bar hud.

  1. Gør 100 ml 10-2 M L-glutamin, L-leucin og L-serin; opbevares 1 ml aliquots af hver ved -20 °C indtil brug.
  2. På eksperimentets dag forberedes ud fra disse aliquots 10-3 M til 10-7 M opløsninger (i trin af x10 fortynding) ved hjælp af både kontrol og høj CO2 havvand.
    BEMÆRK: L-serin (10-3 M) vil blive brugt som en positiv kontrol, eller standard. Vand, der anvendes til at gøre op fortyndinger af stimuli, og behandles på nøjagtig samme måde som stimuli, men uden tilsætning af nogen odorant, vil blive brugt som den negative kontrol eller blank.

2. Forberedelse af kontrol og højt CO2-vand

  1. Forbered kontrolvand ved at indsamle 1 L af trækulsfiltreret havvand.
    1. Ved hjælp af en pH-sonde skal pH-1-1'en kontrolleres. det skal være omkring 8,2. Hvis ikke, boble med atmosfærisk luft, indtil denne pH er nået.
    2. Ved hjælp af en alkalinitet titrator måle alkalinitet af vandet.
    3. Mål vandtemperaturen og saltholdigheden.
  2. Forbered højtCO 2-vand ved at filtrere 1 L havvand, og boble derefter CO2, indtil den ønskede pH-værd er nået.
    1. Ved hjælp af en pH-sonde skal pH-1-1'en kontrolleres. det skal være omkring 7,7.
    2. Ved hjælp af en alkalinitet titrator, måle alkalinitet af vandet.
    3. Mål vandtemperaturen og saltholdigheden.
  3. Be bestemmes CO2-trykket i både kontrol- og højt CO2-vand ved hjælp af en software, der er designet til at beregne CO2-parametre i vand (f.eks. CO2Calc-software13).
    1. I indgangsvinduet tilsættes værdierne af vand pH, temperatur, saltholdighed og total alkalinitet (Figur 1).
    2. Vælg konstanter, enheder og skalaer (se de anbefalede værdier i figur 2).
    3. Tryk på knapprocessen for at bestemme CO2-trykket.
      BEMÆRK: Figur 3 viser et eksempel på et resultatark.

3. Fremstilling af fisk

BEMÆRK: Der anvendes en havbrasen på 200-400 g i denne protokol.

  1. Bedøve fisk byimmeri i beboet naturligt havvand, der indeholder MS222 (ethyl-3-aminobenzoat methansulfonat salt). Når reaktionen på en hale knivspids er stoppet, injicere i flanken muskel den neuromuskulære blokker gallamin triethiodid (10 mg·kg-1 i fysiologisk saltvand).
    BEMÆRK: Koncentrationen af det anvendte bedøvelsesmiddel varierer fra art til art; til en havbrasen på 200−400 g, anvendes 200 mg· L-1 buffer med 400 mg· L-1 NaHCO3.
  2. Anlæg den bedøvede fisk på en polstret støtte. Den nøjagtige form og størrelse afhænger af modelarterne; til havbrebrasen (200−400 g), skal du bruge en polstret V-formet støtte, lavet i huset.
  3. Anlæg et siliciumrør (diameter = 10 mm) i munden, tilslut røret til en dykpumpe i et reservoir af bedøvelsesholdigt, luftet havvand, og pump vand over gællerne ved ~ 100ml·min -1·kg-1.
    BEMÆRK: Størrelsen af det anvendte siliciumrør afhænger af fiskens størrelse.
  4. Sæt jordforbindelsesstiften ind i flankemusklen og tilslut den til forstærkerens hovedtrin).
  5. Fisken dækkes med fugtig klud (eller køkkenrulle), hvor kun hovedet er eksponeret, og det sikres, at belægningen ikke hindrer udslaget fra gællerne.
    BEMÆRK: Øjnene kan dækkes med stykker af fugtigt papir/klud eller sort plast.
  6. Anlæt stimulus-fremføringssystemets rør, dvs.
    BEMÆRK: Mikro-hæmatokritrør kan anvendes (længde = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); disse kan trækkes til et finere punkt på en elektrode puller til brug med mindre fisk. Det er vigtigt at sikre, at olfaktoriske epitel holdes vådt under operationen (beskrevet nedenfor).
  7. Eksponere olfaktoriske nerver ved at fjerne hud og knogler i kraniet mellem øjnene (olfaktoriske nerver normalt køre sammen mellem øjnene) ved hjælp af en tand (ideelt) eller hobby (f.eks Dremel) boremaskine eller guldsmed poler (med dental bore-bits) under en dissekering mikroskop (inde i en Faraday bur).
    1. I seabream, fjerne den del af kraniet umiddelbart over øjnene, med en rundsav, fra bare forreste til øjnene til bare posterior til dem. Derefter, ved hjælp af en borebit, fjerne knoglen mellem øjnene; olfaktoriske nerver ligger mellem øjnene.
  8. Når tilstrækkelig knogle er blevet ryddet, fjerne fedt og bindevæv overliggende nerverne ved hjælp af fine scefæcener; passe på ikke at beskadige nerverne eller punktere blodkar.
    BEMÆRK: Erfaringen vil bidrage til at forfine dissektion; jo mindre dissektion, jo mere stabil præparatet vil være. Der skal dog ryddes tilstrækkeligt væv. for de uerfarne, når olfaktoriske pærer er bare synlige, klar lidt mere anteriorly at udsætte den del af nerverne, som de slutter sig til pærer for at tillade den korrekte placering af elektroderne.
  9. Elektroderne rengøres før brug ved at forbinde dem til negativ pol i en 3V DC-kilde (f.eks. to AA-batterier i serie) og anbringe spidsen i fysiologisk saltvand (eller havvand fortyndet 1:3 i ferskvand) i 20-30 s. en lind strøm af små bobler skal ses kommer fra spidsen.
  10. Når olfaktoriske nerver er eksponeret, indsættes optageelektroderne (holdes på mikromanipulatorer) i en position, der giver et maksimalt svar på standarden (f.eks. 10-3 M L-serin) og en minimal reaktion på det tomme felt. Brug parylen-belagt wolfram elektroder (Tabel over materialer) forbundet til hoved-fase af en vekselstrøm (AC) forforstærker.
    BEMÆRK: I guldbrasen ses de stærkeste reaktioner på aminosyrer normalt med elektroderne placeret i den laterale side af nerven, tæt på hvor den slutter sig til olfaktoriske pære. Dette kan være tilfældet for andre arter, da pærens glomerular organisation stort set er den samme blandt arter. Men erfaring er altid den bedste lærer.

4. Elektrofysiologisk registrering

BEMÆRK: Som med de fleste elektrofysiologi, multi-enhed optagelse skal finde sted i en Faraday bur. Men, ekstracellulære optagelse normalt ikke kræver en anti-vibration tabel; de fleste bevægelse vil komme fra fisk. Ikke desto mindre kræves der et stærkt, stabilt bord med en metaloverflade for at sikre mikromanipulatorstaternes magnetiske baser.

  1. Opsæt et stimulus-fremføringssystem, der gør det muligt hurtigt at skifte fra rent baggrundsvand til stimulerende vand, f.eks. Tilslut den fælles udløb til røret transporterer vand til olfaktoriske roset, og læg den ene linje i en havvandsbeholder og den anden i testopløsningen.
    BEMÆRK: Når ventilen er tændt (ved at passere JÆVN-strøm), skifter vandstrømmen fra baggrundsvand til det, der indeholder lugtmidlet. Stimulansen bør gives længe nok til at se et klart højdepunkt i den integrerede reaktion efterfulgt af en periode med indkvartering; den tid, der anvendes i den nuværende protokol, er 4 s, men længere tid kan være nødvendig afhængigt af arten.
  2. Tilslut ventildriveren til udløseren af en analog-digital konverter (f.eks. Når ventilen skiftes fra baggrund til stimulus-holdige linje, vil dette starte optagelsen af data. Konfigurer softwaren til at starte optagelsen ved udløserhændelsen og fortsætte i en forudbestemt periode (f.eks. 10 s).
    BEMÆRK: Ti sekunder skal være nok, men dette kan forkortes eller forlænges, afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål.
  3. Kontroller præparatets stabilitet ved at teste (registrere og måle amplituden af det integrerede respons) gentagne gange med standarden, 10-3 M L-serin i dette tilfælde, og lade der gå 1 min mellem successive stimuli.
    BEMÆRK: Afhængigt af arter og lugt, bør svarene have en amplitude inden for 10% af hinanden (som en tommelfingerregel), og bør have en hurtig debut, stige til maksimal aktivitet, og vende tilbage til baseline efter stimulus er fraværende (Figur 4).
  4. Optag olfaktoriske nerve reaktioner på aminosyrer i kontrol havvand (fra den laveste til den højeste koncentration) og tillade 1 min at gå mellem successive stimuli.
    BEMÆRK: Det er muligt, at der for nogle arter og/eller nogle lugtstoffer er behov for mere tid. Men for aminosyrer og seabream, 1 min er tilstrækkelig.
  5. Optag reaktionen på 10-3 M serin og en kontrol vand blank opløsning.
  6. Skift baggrundsvandet fra kontrolhavvand tilhavvand med høj CO 2 ved at placere baggrundslinjen i flasken med højt CO2 havvand.
    BEMÆRK: Det er tilrådeligt at indsætte en anden hæmatokrit rør (eller tilsvarende) i slutningen af stimulus og baggrund linjer for at undgå at røre vandet og sikre enden af røret forbliver i vandet.
  7. Før olfaktoriske nerve respons på aminosyrer i havvand med høj CO2-havvand testes, skal olfaktorisk epitel med højt CO2-vand testes ved at følge det høje CO2-vand over olfaktoriske epitel i et par minutter.
    BEMÆRK: Erfaringen har vist, at 5 min. er tilstrækkelig for seabream.
  8. Bortset fra olfaktoriske nervereaktioner på aminosyrer i havvand med høj CO2 (fra den laveste til den højeste koncentration).
  9. Optag reaktionen på en høj CO2 vand blank opløsning.
  10. Optag reaktionen på 10-3 M serin og en kontrol vand blank opløsning.
    BEMÆRK: Det rå signal (nerveaktivitet) skal filtreres (lav gennemløb omkring 2.000−5.000 Hz, high pass 50−300 Hz) og sendes til en analog-digital konverter (Tabel over materialer). For at lette kvantificeringen af nerveaktiviteten kan det rå signal også integreres ved hjælp af en utæt integrator (materialetabel) og sendes til den analog-digitale konverter og derfra både rå og integrerede signaler til en computer, der kører den relevante software (f.eks.

5. Dataanalyse

  1. Træk amplituden af den integrerede reaktion på det tomme (i mV) fra amplituden af de integrerede reaktioner på alle stimuli.
  2. Normalisere reaktionerne på stimuli ved at dividere amplituden af det tidligere svar på standarden (10-3 M serin); dette reducerer variationen mellem og inden for fisk.
  3. Påvisningstrin beregnes ved lineær regression af koncentrationsresponskurverne (på et halvlogaritmisk plot) i henhold til formelloggen(N + 1,5) = enlog C + B, hvor C er molære koncentrationen, N er den normaliserede responsamplitude, og a og b erkonstanter 7,14.
    BEMÆRK: Detektionstærsklen er derefter værdien for x, hvor y = 0,1761 (dvs. log 1,5; N = 0); den koncentration, over hvilken der vil blive set en reaktion (dvs. at fiskene kan lugte den). Nogle lugtstoffer fremkalder sigmoidal koncentration-respons kurver, når afbildet semi-logaritmisk (f.eks calcium15,16;i dette tilfælde kan de normaliserede data monteres på en tre-parameter Hill plot, som vil give den maksimale respons amplitude og EF50 (dvs. [odorant], der giver halvt maksimal respons; også et mål for følsomhed).
  4. Sammenlign tærsklerne for detektion og/eller den maksimale respons-amplitude ogEC 50 af stimuli, der er testet i kontrolvand, og dem, der er testet i højt CO2-vand.

Representative Results

En typisk reaktion på den positive kontrol (10-3 M L-serin; Figur 4A) og negativ kontrol (tom; Figur 4B ) med tal 4B) , der er registreret fra en guldbrasenner, er vist i figur 4. I nærværelse af stimulus (sort vandret bar; i olfaktoriske hulrum, i kontakt med olfaktoriske epitel), bemærk den hurtige stigning i aktiviteten (afspejles i den opadgående afbøjning af det integrerede signal) til et højdepunkt inden for omkring et sekund af stimulus debut, efterfulgt af en periode med indkvartering (mens stimulus er stadig til stede), og en tilbagevenden til baseline aktivitet, når stimulus er afsluttet. Den absolutte amplitude af reaktionen er meget afhængig af elektrode position; Hvis der registreres et lavt amplituderespons, kan du prøve at ændre elektrodepositionerne. En langsommere stigning til peak aktivitet kan skyldes, at røret bærer stimulus-holdige vand til olfaktoriske epitel bliver placeret for langt væk fra epitel; prøv at flytte næserøret tættere på (men ikke røre) epitel. Bemærk, at den tomme derimod fremkalder ringe eller intet svar. Et signifikant positivt respons (dvs. øget aktivitet) på blindprøven kan indikere kontaminering af det vand, der anvendes til at foretage stimuli fortyndingerne. friske fortyndinger med rent vand (og glasvarer) skal løse dette problem. Hvis ikke, kan det være nødvendigt med en mere grundig rengøring af vandsystemet (herunder aktiverede kulfiltre). Et negativt respons (dvs. fald i aktivitet) kan indikere en lille ændring i strømningshastigheden, når ventilen skiftes på grund af f.eks.

En typisk koncentrations-respons kurve (plottet semi-logaritmisk), i dette tilfælde til L-leucin (10-7 M til 10-3 M), er vist i figur 5A. Bemærk, at stigende koncentrationer af lugtmidlet fremkalder stadig større stigninger i aktiviteten, og derfor i amplituden af de integrerede reaktioner. Et plot af de normaliserede data og deres tilsvarende lineære regression er vist i figur 5B. Den anslåede registreringstærskel kan beregnes ud fra værdien af x, når y = 0,1761 (dvs. log1,5; hvor N = 0). I dette tilfælde er denne værdi -7,48. den beregnede tærskel for L-leucin i denne fisk er 10-7,48 M. Eksponent α kan ligeledes estimeres ud fra lineær regression af de normaliserede data i et loglogplot. logN = αlog[lugtmiddel] + konstant. Faktoren γ giver derefter den stigning i lugtkoncentrationen, der kræves for at øge respons amplituden med en logenhed; det vil sige et skøn over koncentrations-responskurvensstejlhed 17. I dette eksempel α = 0,277 og γ = 3,61; For at øge responsen amplitude ti gange (dvs. en logenhed; log10 = 1) skal stimuluskoncentrationen derfor øges med 103,61gange (4.074 gange).

En typisk sigmoidal koncentrations-respons kurve (Figur 6A) når afbildet semi-logaritmisk, i dette tilfælde til L-glutamin, er vist i figur 6B. En lignende koncentrationsafhængig stigning i respons amplitude ses; ved de højere koncentrationer bliver denne stigning dog mindre, så responsjlituden når et maksimum (Nmax). Dette gør det muligt at montere dataene på en tre parameter Hill ligning:
Equation 1

På denne måde kan EF50 (den lugtkoncentration, hvor der fremkaldes en maksimal respons på 50%) og Hill co-efficient (et mål for hældningen af den lineære del af den sigmoidale kurve) beregnes.

Figure 1
Figur 1: Software screenshot viser input vinduet fra programmet CO2Calc. Fremhævede (røde bokse) er de felter, der kræves til beregning af karbonatparameteren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Software screenshot viser input vinduet for de relevante konstanter, enheder og skalaer. De viste værdier anbefales for forhold, hvorunder de beskrevne forsøg blev udført. de kan ændre sig. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Software screenshot viser resultaterne vinduet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Typiske flerenhedsresponser registreres ekstracellulært fra guldbrasen i vivo som svar på 10-3 M L-serin (A) og blank (B). Øvre spor viser de integrerede reaktioner og lavere spor viser den rå (nerve) signal. Stimuli blev anvendt på olfaktoriske epitel (vandrette stænger). Bemærk den hurtige stigning i aktiviteten i løbet af 1 s af eksponering, et højdepunkt i aktivitet, efterfulgt af en periode med indkvartering (mens odorant stadig blev leveret til epitel) og en tilbagevenden til baseline niveauer, når odorant levering er ophørt. Ringe eller ingen stigning i aktivitet ses efter stimulation med vand behandlet på samme måde som lugtgener, med undtagelse af tilsætning af lugtmiddel (blank). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Typisk koncentrations-respons kurve for L-leucin registreres ekstracellulært fra olfaktoriske nerve in vivo. (A) Da koncentrationen af L-leucin, der anvendes på olfaktoriske epitel (vandrette stænger), øges fra 10-7 M til 10-3 M, ses en samtidig stigning i aktiviteten i nerven. Øvre spor viser de integrerede reaktioner og lavere spor viser den rå (nerve) signal. (B)Lineær regression (R2 = 0,97) af normaliserede data afbildet semi-logaritmisk at beregne tærsklen for detektion som værdien for log[L-leucin] når log (N + 1,5) = 0,1761 (dvs. hvor N = 0). I dette eksempel er denne værdi -7,48. den anslåede påvisningstærskel for L-leucin i denne fisk er derfor 10-7,48 M. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Typisk koncentrations-respons kurve for L-glutamin registreres ekstracellulært fra olfaktoriske nerve in vivo. (A) Da koncentrationen af L-glutamin, der anvendes på olfaktoriske epitel (vandrette stænger), øges fra 10-7 M til 10-3 M, ses en samtidig stigning i aktiviteten i nerven. Øvre spor viser de integrerede reaktioner og lavere spor viser den rå (nerve) signal. bB) Semi-logaritmisk plot af normaliserede data monteret på en tre-parameter Hill ligning (R2 = 0,99). I dette eksempel skal den beregnede EC50 = 3,11 μM og Bakken co-efficient = 0,565). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den nuværende undersøgelse beskriver brugen af multi-enhed (ekstracellulær) optagelse fra olfaktoriske nerve af guldbrasen (S. aurata), en marine sparid af stor betydning i akvakultur. Denne eksperimentelle fremgangsmåde kan dog anvendes bredt på andre fisk. kirurgi og nøjagtige placering af elektroder vil klart afhænge af anatomi olfaktoriske system, og valg og koncentration af bedøvelsesmiddel kan afhænge af de arter, der undersøges. For eksempel er guldfiskens olfaktoriske nerve (Carassius auratus) kort; i dette tilfælde ville det være lettere at registrere EEG fra olfaktoriske pære. Valget af lugt kan også til en vis grad afhænge af arten. Den nuværende undersøgelse brugte aminosyrer. Så vidt forfatterne ved, alle fiskearter undersøgt til dato har olfaktoriske følsomhed over for aminosyrer1,18. Denne følsomhed har været impliceret er forskellige processer såsom fødevarer placering, kemisk kommunikation og anerkendelse af natal farvande19,20,21,22,23. De forskellige arters følsomhed er imidlertid stort set ret ens og afhænger ikke af livsstil eller levesteder. De er også veldefinerede molekyler og er billigt og let tilgængelige. Disse årsager gør dem ideelle teststimuli til undersøgelser af olfaction hos fisk, især dem, der undersøger virkningerne af menneskeskabte forstyrrelser (f.eks. forsuring eller forurening), hvor resultaterne let kan sammenlignes på tværs afart 24.

Afhængigt af de pågældende arter kan forberedelserne til optagelse af flere enheder forblive stabile i flere timer. amplituden af respons på den interne standard (10-3 M L-serin i den aktuelle undersøgelse) bør ikke variere med mere end 10% mellem successive test. Enhver væsentlig afvigelse fra denne tommelfingerregel kan skyldes: i) flytning af fisken, og derfor forskydning af elektroder og / eller næse-rør; ii) forurening af vandet, f.eks. eller iii) forringelse af præparatets sundhed). I tilfælde i) skal fisken kontrolleres for at være flyttet. hvis ja, flytte det, og tilsæt mere bedøvelsesmiddel til vandet og / eller give en anden dosis af gallamin triethiodid. Tillad 5 min og test standarden igen. Hvis responsen er endnu mindre, skal elektroderne og/eller næserøret flyttes igen, indtil der registreres en tilstrækkelig stor respons. I tilfælde (ii), blot genindspilning en frisk fortynding serie af odorant, ved hjælp af rent glas og vand. I tilfælde (iii) skal det kontrolleres, at vandstrømmen over fiskens gæller er tilstrækkelig, at vandet strømmer over gællerne (dvs. at komme ud via operculaen i stedet for munden), og at vandet er godt luftet. Forskellige fiskearter har vidt forskellige temperaturpræferencer; sikre, at laboratoriets temperatur (og temperaturen af det vand, der kommer i kontakt med fisken) er så tæt på den temperatur, som fiskene holdes på som muligt. Sørg også for, at fiskene ikke er stressede, og undgå at flytte dem (selv fra en tank til en anden) i mindst en uge før optagelse. Elektrisk støj er naturligvis den bane af en elektrofysiolog liv; Men den nuværende artikel er ikke det rette medie til at diskutere, hvordan man kan overvinde / reducere dette. Ikke desto mindre er 'The Axon Guide' (tilgængelig frit som pdf til download fra producentens hjemmeside) en kilde til praktiske råd om støjminimering. Når en stor, stabil respons er fremkaldt af standard stimulus, og en koncentration serie giver en koncentration-afhængig stigning i amplitude, med minimal respons på den tomme, registrering svar på test stimuli kan begynde. Nogle forfattere giver den samme stimulus tre gange, og beregne det aritmetiske middel for efterfølgende dataanalyse. Men disse er tekniske replikater, og denne tilgang vil øge den tid, en optagelse session tager med tre gange. De nuværende forfattere foretrækker at teste en given odorant én gang, men altid en del af en koncentration-respons kurve. Dette gør det ikke kun muligt at beregne påvisningstærsklen ellerEF 50 (som beskrevet), men sikrer også, at koncentrationer tæt på dem, som fiskene ville opleve i det naturlige miljø, testes (dette er ikke altid kendt). Desuden er eventuelle afvigende reaktioner, på grund af forurening for eksempel, lettere at få øje på; disse kan derefter gentages ved hjælp af en frisklavet prøve, hvis det er nødvendigt.

Multi-enhed optagelse fra olfaktoriske nerve kan være invasive, men det er mere følsom end EOG, når de registreres i havvand7, da det er uafhængigt af ydre saltholdighed. Det kan derfor anvendes til at vurdere olfaktoriske følsomhed over for lugtstoffer, såsom calcium og natrium, ændringer i koncentrationerne, som også ville påvirke ledningsevne og dermed spændingerregistreret 15. Som et skøn over antallet af ORN'er reagerer på en given lugt (dvs. handling potentialer rejser langs ORN axoner fra olfaktoriske epitel til pæren), det repræsenterer en rå, uforarbejdet signal (indledende behandling af olfaktoriske input begynder i pærer). Det er derfor en bedre parameter at vurdere de direkte virkninger af forurenende stoffer, såsom tungmetaller, og miljøændringer, såsom pH, på olfaktoriske system end EOG eller EEG24,25. Optagelse fra olfaktoriske pære i havvand med høj PCO2 (og derfor lav pH) kan blive påvirket af centrale virkninger af pH på neural behandling; den 'GABAEn receptor teori' af havet forsuring26, hvorved reduktion i vand pH forårsager en omfordeling af Cl- og HCO3- ion i CSF og en deraf følgende skift af GABAergic aktivering fra hæmmende (hyperpolarisering) til excitatoriske (depolarisering). I sådanne undersøgelser er det desuden vigtigt at vurdere virkningerne af forsuring eller forurenende stoffer ved hjælp af koncentrationer af lugtende stoffer svarende til dem, fiskene sandsynligvis vil støde på i dets naturlige miljø. For aminosyrer, dette er i nano til mikromolar rækkevidde27,28,29; tæt på tærsklen for påvisning af disse forbindelser i fisk1,18. Vurdering af tærsklen for påvisning for en given odorant kan give en idé om betydningen og / eller biologiske rolle olfaktoriske følsomhed. F.eks. har havlygte (Petromyzon marinus) høj olfaktorisk følsomhed over for specifikke galdesyrer, der frigives af larver ned til en tærskel på 10-13 M30; denne følsomhed gør det muligt for voksne at lokalisere og identificere egnede gydepladser og fungerer derfor som en vandrende feromon over lange afstande. Tilsvarende moden kvindelig hav lamprey har høj olfaktoriske følsomhed over for sæd (tærskel 10-14 M), en polyamin frigivet i milten af hanner, som derefter tiltrækker dem til reder af spermiating hanner31. Andre fisk har også olfaktorisk følsomhed over for polyamin32,33,34,35, men ikke med tilstrækkeligt lave påvisningstærskler til at understøtte en lignende feromonal rolle; i stedet foreslås undgåelse af rådnende fisk. Ikke desto mindre er det med så høje olfaktoriske følsomheder muligt at forestille sig, at en mindre reduktion i følsomheden (dvs. en forhøjelse af tærsklen), selv når responsjolilituden ikke reduceres drastisk, kan forårsage alvorlige problemer for fisk24.

Når afbildet semi-logaritmisk, koncentration-respons kurver til lugtstoffer kan være eksponentiel, lineær eller sigmoidal18. For aminosyrer er sådanne semilogaritmiske koncentrationsresponskurver enten lineære (dvs. logaritmiske), sigmoidale eller effektfunktioner7. At der ikke ses nogen mætning af responsen (dvs. ingen plateau i koncentrations-respons kurven, selv ved supra-miljømæssige koncentrationer) skyldes sandsynligvis flere receptorer, der binder til individuelle aminosyrer, afhængigt af deres koncentration, snarere end hver aminosyre, der binder sig til en bestemt receptor; som koncentrationen af en given aminosyre stiger, flere receptorer er i stand til at binde det og derfor reagere. Ikke desto mindre kan fisk skelne mellem blandinger afaminosyrer 36,37,38,39; dette skyldes sandsynligvis kombinatoriske aktivitetsmønstre i olfaktoriske pærer12,40 axonerne af alle ORNs udtrykke samme receptor protein ender på samme glomeruli i olfaktoriskepærer 41,42, og en aminosyre kan aktivere mere end én glomerulus.

Men, meget specifikke lugtstoffer, såsom feromoner, kan fremkalde sigmoidal eller kvasi-sigmoidal koncentration-respons kurver43,44. Konklusionen, selv om det ikke empirisk testet, er, at disse olfaktoriske reaktioner skyldes meget specifikke receptorer, der binder feromon molekyle og lidt andet. Derfor, over en given koncentration, alle receptorer er besat, og yderligere stigninger vil fremkalde yderligere reaktioner i andre ORNs. Derfor kan disse data monteres på en tre-parameter Hill plot, og den maksimale respons, EC50 og Hill co-effektiv kan beregnes15,,45,46. Dette kan give værdifulde oplysninger, såsom tilsyneladende affinitet og tilsyneladende receptornummer, som lineære eller eksponentielle koncentrationsresponskurver ikke kan give.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Arbejdet i forfatternes laboratorium støttes af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, projekter PTDC/BIA-BMA/30262/2017 og UID/Multi/04326/2019 og kontraktprogram DL57/2016/CP1361/CT0041 til ZV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC pre-amplifier Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL104 Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) 1440A Analogue-digital converter.
EMG Integrator Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL703 Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage Made in-house To reduce electrical noise.
Filter Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL125/6 Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide Sigma-Aldrich (Portugal) G8134 Neuromuscular blocker
L-glutamine Sigma-Aldrich (Portugal) G3126 Amino acid used as odorant
L-leucine Sigma-Aldrich (Portugal) L80000 Amino acid used as odorant
L-serine Sigma-Aldrich (Portugal) S4500 Amino acid used as odorant
Metalic base-plate Any Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes Any To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators Narishige International Ltd (London, UK) M-152 Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Sigma-Aldrich (Portugal) E10505 Anesthetic
pH probe Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI12302 Probe to measure pH of water.
Refractometer Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI96822 Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Portugal) 746398 For saline solution
Solenoid valves The Lee Co. (Essex, CT, USA) LFAA1201618H For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope Zeiss, Leica, Olympus Any suitable model. For dissection and placement of electrodes.
Titrator Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI84531 Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ World Precision Instruments (Hitchin, UK) TM31A10 Extracellular electrodes.
Valve Driver Made in-house 12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible) Any To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasumyan, A. O. The olfactory system in fish: structure, function, and role in behaviour. Journal of Ichthyology. 44 (Suppl 2), S180-S223 (2004).
  2. Michel, W. C. Chemoreception. The Physiology of Fishes. Evans, D. H., Claiborne, J. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 471-497 (2006).
  3. Wisenden, B. D. Chemical cues that indicate risk of predation. Fish Pheromones and Related Cues. Sorensen, P. W., Wisenden, B. D. , John Wiley & Sons Inc. Ames, IA. 131-148 (2015).
  4. Tierney, K. B., et al. Olfactory toxicity in fishes. Aquatic Toxicology. 96 (1), 2-26 (2010).
  5. Caprio, J. In vivo olfactory and taste recordings in fish. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Current Techniques and Protocols. Spielman, A. I., Brand, J. G. , CRC Press. Boca Raton, FL. 251-261 (1995).
  6. Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electoolfactogram: a review of its history and uses. Microscopy Research and Technique. 58, 152-160 (2002).
  7. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Ozório, R. O. A., Valente, L. M. P., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to amino acids in the blackspot seabream (Pagellus bogaraveo): a comparison between olfactory receptor recording techniques in seawater. Journal of Comparative Physiology A. 197 (8), 839-849 (2011).
  8. Hamdani, E. H., Døving, K. B. The functional organization of the fish olfactory system. Progress in Neurobiology. 82 (2), 80-86 (2007).
  9. Hara, T. J., Zhang, C. Topographic bulbar projections and dual neural pathways of the primary olfactory neurons in salmonid fishes. Neuroscience. 82 (1), 301-313 (1998).
  10. Thommesen, G. The spatial distribution of odour induced potentials in the olfactory bulb of the char and trout (Salmonidae). Acta Physiologica Scandinavica. 102, 205-217 (1978).
  11. Nikonov, A. A., Caprio, J. Electrophysiological evidence for a chemotopy of biologically relevant odors in the olfactory bulb of the channel catfish. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 1869-1876 (2001).
  12. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Chemotopic, combinatorial, and noncombinatorial odorant representations in the olfactory bulb revealed using a voltage-sensitive axon tracer. Journal of Neuroscience. 18 (23), 9977-9988 (1998).
  13. Pierrot, D. E., Lewis, E., Wallace, D. W. R. MS Excel programme developed for CO2 system calculations. ORNL/CDIAC-105a, Carbon Dioxide Information Analysis Center. , Oak Ridge National Laboratory, US Department of Energy, Oak Ridge, TN. (2006).
  14. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to catecholamines and their metabolites in the goldfish. Chemical Senses. 28 (3), 207-218 (2003).
  15. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the marine teleost Sparus aurata. Journal of Experimental Biology. 203 (24), 3821-3829 (2000).
  16. Hubbard, P. C., Ingleton, P. M., Bendell, L. A., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the freshwater teleost Carassius auratus: an olfactory role for the Ca2+-sensing receptor? Journal of Experimental Biology. 205, 2755-2764 (2002).
  17. Byrd, R. P. Jr, Caprio, J. Comparison of olfactory receptor (EOG) and bulbar (EEG) responses to amino acids in the catfish, Ictalurus punctatus. Brain Research. 249 (1), 73-80 (1982).
  18. Hara, T. J. The diversity of chemical stimulation in fish olfaction and gustation. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4 (1), 1-35 (1994).
  19. Kawabata, K. Induction of sexual behavior in male fish (Rhodeus ocellatus ocellatus) by amino acids. Amino Acids. 5 (3), 323-327 (1993).
  20. Shoji, T., Yamamoto, Y., Nishikawa, D., Kurihara, K., Ueda, H. Amino acids in stream water are essential for salmon homing migration. Fish Physiology and Biochemistry. 28 (1-4), 249-251 (2003).
  21. Yamamoto, Y., Hino, H., Ueda, H. Olfactory imprinting of amino acids in lacustrine sockeye salmon. PLoS ONE. 5 (1), e8633 (2010).
  22. Kutsyna, O., Velez, Z., Canário, A. V. M., Keller-Costa, T., Hubbard, P. C. Variation in urinary amino acids in the Mozambique tilapia: a signal of dominance or individuality?. Chemical Signals in Vertebrates 13. Schulte, B., Goodwin, T., Ferkin, M. , Springer. Cham, Switzerland. 189-204 (2016).
  23. Velez, Z., Hubbard, P. C., Hardege, J. D., Barata, E. N., Canário, A. V. M. The contribution of amino acids to the odour of a prey species in the Senegalese sole (Solea senegalensis). Aquaculture. 265, 336-342 (2007).
  24. Porteus, C. S., et al. Near-future CO2 levels impair the olfactory system of a marine fish. Nature Climate Change. 8 (8), 737-743 (2018).
  25. Velez, Z., Roggatz, C. C., Benoit, D. M., Hardege, J. D., Hubbard, P. C. Short- and medium-term exposure to ocean acidification reduces olfactory sensitivity in gilthead seabream. Frontiers in Physiology. 10, 731 (2019).
  26. Nilsson, G. E., et al. Near-future carbon dioxide levels alter fish behaviour by interfering with neurotransmitter function. Nature Climate Change. 2 (3), 201-204 (2012).
  27. Fuhrman, J. A., Ferguson, R. L. Nanomolar concentrations and rapid turnover of dissolved free amino acids in seawater: agreement between chemical and microbiological measurements. Marine Ecology - Progress Series. 33 (3), 237-242 (1986).
  28. Pomeroy, L. R., Macko, S. A., Ostrom, P. H., Dunphy, J. The microbial food web in Arctic seawater: concentration of dissolved free amino acids and bacterial abaundance and activity in the Arctic Ocean and in Resolute Passage. Marine Ecology - Progress Series. 61 (1-2), 31-40 (1990).
  29. Poulet, S. A., Williams, R., Conway, D. V. P., Videau, C. Co-occurrence of copepods and dissolved free amino acids in shelf sea waters. Marine Biology. 108 (3), 373-385 (1991).
  30. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  31. Scott, A. M., et al. Spermine in semen of male sea lamprey acts as a sex pheromone. PLoS Biology. 17 (7), e3000332 (2019).
  32. Da Silva, J. P., et al. Synthetic versus natural receptors: supramolecular control of chemical sensing in fish. ACS Chemical Biology. 9 (7), 1432-1436 (2014).
  33. Hussain, A., et al. High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor cadaverine. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 19579-19584 (2013).
  34. Michel, W. C., Sanderson, M. J., Olson, J. K., Lipschitz, D. L. Evidence of a novel transduction pathway mediating detection of polyamines by the zebrafish olfactory system. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1697-1706 (2003).
  35. Rolen, S. H., Sorensen, P. W., Mattson, D., Caprio, J. Polyamines as olfactory stimuli in the goldfish Carassius auratus. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1683-1696 (2003).
  36. Kang, J., Caprio, J. Electro-olfactogram and multiunit olfactory receptor responses to complex mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of General Physiology. 98 (4), 699-721 (1991).
  37. Kang, J., Caprio, J. Electrophysiological responses of single olfactory bulb neurons to binary mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of Neurophysiology. 74 (4), 1435-1443 (1995).
  38. Valentincic, T., Kralj, J., Stenovec, M., Koce, A., Caprio, J. The behavioral detection of binary mixtures of amino acids and their individual components by catfish. Journal of Experimental Biology. 203, 3307-3317 (2000).
  39. Valentincic, T., Wegert, S., Caprio, J. Learned olfactory discrimination versus innate taste responses to amino acids in channel catfish (Ictalurus punctatus). Physiology and Behavior. 55 (5), 865-873 (1994).
  40. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  41. Vassar, R., et al. Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell. 79 (6), 981-991 (1994).
  42. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87 (4), 675-686 (1996).
  43. Keller-Costa, T., et al. Identity of a tilapia pheromone released by dominant males that primes females for reproduction. Current Biology. 24 (18), 2130-2135 (2014).
  44. Sorensen, P. W., Hara, T. J., Stacey, N. E. Extreme olfactory sensitivity of mature and gonadally-regressed goldfish to a potent steroidal pheromone, 17a,20b-dihydroxy-4-pregnen-3-one. Journal of Comparative Physiology A. 160 (3), 305-313 (1987).
  45. Keller-Costa, T., Canário, A. V. M., Hubbard, P. C. Olfactory sensitivity to steroid glucuronates in Mozambique tilapia suggests two distinct and specific receptors for pheromone detection. Journal of Experimental Biology. 217 (23), 4203-4212 (2014).
  46. Hubbard, P. C., Mota, V., Keller-Costa, T., da Silva, J. P., Canário, A. V. M. Chemical communication in tilapia: a comparison of Oreochromis mossambicus with O. niloticus. General and Comparative Endocrinology. 207, 13-20 (2014).

Tags

Tilbagetrækning olfaction følsomhed nerve fisk forsuring aminosyre elektrofysiologi ekstracellulær
Ekstracellulær multienhedsoptagelse fra teleosts olfaktoriske nerve
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular … More

Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts. J. Vis. Exp. (164), e60962, doi:10.3791/60962 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter