Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfaktorisk nerve av teleosts

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/60962
Automatic Translation
1, 1,2
1Centro de Ciências do Mar, 2Universidade do Algarve

Summary

Ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfactory nerve er en følsom, robust og reproduserbar metode for å vurdere olfaktorisk følsomhet i marine fisk. Den registrerer primære sensoriske innganger og er uavhengig av ekstern saltholdighet.

Abstract

Nyere studier har vist at havforsuring påvirker olfaktorisk drevet atferd hos fisk. Dette kan delvis skyldes en reduksjon i olfaktorisk følsomhet i høyt PCO2/lavt pH-vann. For å vurdere effekten av havforsuring, eller olfaktorisk følsomhet i marin fisk generelt, foreslår vi at ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfaktornerven er den metoden for valg. Selv om den er invasiv, er den følsom, robust, reproduserbar og uavhengig av ekstern saltholdighet (i motsetning til elektro-olfactogram [EOG], for eksempel). Videre registrerer den en primær sensorisk inngang i CNS, før sentral behandling. Vi viser at denne metoden kan vise en reduksjon i olfaktorisk følsomhet som er både midlertidig og luktavhengig, ved hjelp av en rekke aminosyrer for å konstruere konsentrasjonsresponskurver og beregne terskler for deteksjon.

Introduction

Fisk er avhengige av olfaction for mange aspekter av deres liv, inkludert å finne mat, unngå rovdyr, vurdere potensielle kamerater og migrasjon, blantannet 1,2,3. Derfor vurderer olfaktorisk følsomhet i fisk (Hva lukter de? Hvor følsomme er de for disse forbindelsene?) er avgjørende for å forstå disse prosessene fullt ut. Videre kan antropogene effekter på miljøet, som havforsuring og forurensning, ha dype effekter på olfaktorisk system, selv på sublethal nivåer, fordi det nødvendigvis er i intim kontakt med det omkringliggende vannet4. In vivo elektrofysiologi er den eksperimentelle tilnærmingen til valg for å vurdere olfaktorisk følsomhet hos fisk. Tre hovedteknikker er tilgjengelige: elektro-olfactogram (EOG), elektro-encefalogram (EEG) registrert fra olfactory pære, og multi-enhet opptak fra olfactory nerve5.

EOG er den mest brukte av disse tre6. Det er en direkte strøm (DC) felt potensial registrert over olfactory epitel og antas å være den oppsummerte generator potensialer av de olfactory reseptor nevroner (ORNer) reagerer på en gitt lukt. Men som det er registrert i vannet, i stedet for inne i fisken, er amplituden av respons ikke bare avhengig av signalet som genereres av fisken, men også på ledningsevnen til det omkringliggende vannet; jo høyere ledningsevne (eller jo lavere motstand), jo lavere vil være amplituden. Dette kan bety at EOG er en mindre følsom metode i sjøvann enn ferskvann7.

EEG registrert fra olfaktorisk pære er også mye brukt i undersøkelse av olfaction i fisk. Olfaktorisk pære er imidlertid første-ordre behandlingssenter for olfaktorisk sensorisk inngang8; Det er svært organisert i glomeruli, og dermed avhenger responsen som er registrert sterkt av plasseringen av opptakselektrodene. For eksempel behandles inngangen fra ORNer som oppdager aminosyrer av glomeruli i det laterale området av olfaktoriske pærer, mens det fra konspesifikke avledede kjemikalier er rettet mot medialregionen9,10,11,12. Feromonal input kan rettes til svært lokaliserte glomeruli i olfaktorisk pære. Avhengig av også anatomien til den aktuelle arten, kan den ideelle opptaksposisjonen for en gitt lukt ikke være lett tilgjengelig.

Multi-enhet opptak fra olfactory nerve omgår de viktigste problemene med EOG og EEG skissert ovenfor. Når den registrerer handlinger potensialer passerer ned aksonene til ORNene fra epitelet til pæren, er det et primært sensorisk signal. Og som det er registrert inne i fisken, amplituden av respons er uavhengig av ekstern saltholdighet. Likevel, selvfølgelig har det noen ulemper. For det første, avhengig av artens anatomi, er det nødvendig med mer omfattende kirurgi for å avsløre olfaktornerven enn for EOG. For det andre, fordi signalet er mindre enn EOG, krever det litt mer sofistikert, og derfor dyrt, utstyr. En generell beskrivelse av andre eksperimentelle tilnærminger er gitt av John Caprio5. Målet med denne artikkelen er å skissere hvordan man registrerer ekstracellulære multi-unit svar fra olfaktorisk nerve av seabream (Sparus aurata) in vivo til aminosyre luktstoffer som et eksempel på denne teknikken, og hvordan å identifisere, og overvinne, noen av de vanligste problemene som oppstår i et slikt eksperiment.

Protocol

Vedlikehold og eksperimentering av dyr ble utført i sertifiserte eksperimentelle anlegg og fulgte portugisisk nasjonal lovgivning (DL 113/2013) under en "gruppe-1" lisens av Veterinærdirektoratet, Landbruksdepartementet, Rural Development and Fisheries of Portugal. Siden denne protokollen innebærer dyrehåndtering, må den godkjennes av det lokale og/eller nasjonale organet som regulerer velferden til dyr som brukes i vitenskapelige eksperimenter, i tillegg må forskerne ha riktig opplæring og lisenser for å utføre slike prosedyrer.

1. Stimulans forberedelse

MERK: De fleste fisk har svært følsomt olfaktorisk system, og derfor må det være stor forsiktighet når du forbereder olfaktoriske stimuli som skal brukes i forsøket. Glasset som brukes til å utgjøre stimuli bør vaskes i 5% blekemiddel (natriumhypokloritt), skylles grundig med vann fra springen og tørket. Skyll glasset grundig før bruk med sjøvann (det samme vannet som brukes til å lage stimulansfortynningene). Vær forsiktig med at ingenting av dette vannet kommer i kontakt med bar hud.

  1. Lag 100 ml 10-2 M L-glutamin, L-leucin og L-serin; oppbevares 1 ml aliquots av hver ved -20 °C til bruk.
  2. På dagen for eksperimentet, forberede fra disse aliquots, 10-3 M til 10-7 M løsninger (i trinn av x10 fortynning) ved hjelp av både kontroll og høyt CO2 sjøvann.
    MERK: L-serine (10-3 M) vil bli brukt som en positiv kontroll, eller standard. Vann som brukes til å gjøre opp fortynninger av stimuli, og behandlet på nøyaktig samme måte som stimuli, men uten tilsetning av lukt, vil bli brukt som negativ kontroll eller blank.

2. Tilberedning av kontroll og høyt CO2-vann

  1. Forbered kontrollvann ved å samle 1 L kullfiltrert sjøvann.
    1. Bruk en pH-sonde til å kontrollere pH-en; det bør være rundt 8,2. Hvis ikke, boble med atmosfærisk luft til denne pH er nådd.
    2. Ved hjelp av en alkalitetstitreator måle alkaliteten av vannet.
    3. Mål vanntemperaturen og saltholdigheten.
  2. Forbered høyt CO2-vann ved å filtrere 1 L sjøvann, og boble deretter CO2 til ønsket pH er nådd.
    1. Bruk en pH-sonde til å kontrollere pH-en; det bør være rundt 7,7.
    2. Ved hjelp av en alkalitetstitreator, mål alkaliteten til vannet.
    3. Mål vanntemperaturen og saltholdigheten.
  3. Bestem CO2-trykket i både kontroll og høyt CO2-vann ved hjelp av en programvare som er utviklet for å beregne CO2-parametere i vann (f.eks. CO2Calc-programvare13).
    1. I inngangsvinduet legger du til verdiene for vann pH, temperatur, saltholdighet og total alkalitet (figur 1).
    2. Velg konstanter, enheter og skalaer (se de anbefalte verdiene i figur 2).
    3. Trykk på knappeprosessen for å bestemme CO2-trykk.
      MERK: Figur 3 viser et eksempel på et resultatark.

3. Fremstilling av fisken

MERK: Et sjøbryte på 200–400 g brukes i denne protokollen.

  1. Bedøve fisken byimmersion i vannavsjøvann som inneholder MS222 (etyl-3-aminobenzoat metansulfonat salt). Når responsen på en haleklemme har stoppet, injiser i flankemuskelen den nevromuskulære blokkeringen gallamintriatyid (10 mg·kg-1 i fysiologisk saltvann).
    MERK: Konsentrasjonen av bedøvelse som brukes varierer mellom arter; for et sjøbre på 200-400 g, bruk 200 mg· L-1 bufret med 400 mg· L-1 NahCO3.
  2. Plasser den bedøvede fisken på en polstret støtte. Den nøyaktige formen og størrelsen avhenger av modellartene; for seabream (200-400 g), bruk en polstret V-formet støtte, laget i huset.
  3. Plasser et silisiumrør (diameter = 10 mm) i munnen, koble røret til en nedsenkbar pumpe i et reservoar av bedøvelsesholdig, luftet sjøvann og pump vann over gjellene på ~ 100 ml · min-1· kg-1.
    MERK: Størrelsen på silisiumrøret som brukes, avhenger av størrelsen på fisken.
  4. Sett jordingspinnen inn i flankemuskelen og koble den til forsterkerens hodetrinn).
  5. Dekk fisken med fuktig klut (eller papirhåndkle) med bare hodet eksponert, slik at belegget ikke beholder utgangen av vann fra gjellene.
    MERK: Øynene kan dekkes med biter av fuktig papir/klut eller svart plast.
  6. Plasser røret til stimulansleveringssystemet, det vil si glassrøret som er koblet til en tilførsel av bakgrunn sjøvann, inn i neseboret.
    MERK: Mikro-hematokritrør kan brukes (lengde = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); disse kan trekkes til et finere punkt på en elektrode avtrekker for bruk med mindre fisk. Det er viktig å sikre at olfaktorepitelet holdes vått under operasjonen (beskrevet nedenfor).
  7. Eksponer olfaktoriske nerver ved å fjerne huden og beinet i skallen mellom øynene (olfaktoriske nerver vanligvis løpe sammen mellom øynene) ved hjelp av en dental (ideelt) eller hobby (f.eks Dremel) drill eller gullsmedpoleringsmaskin (med dental drill-bits) under et dissekerende mikroskop (inne i et Faraday bur).
    1. I seabream fjerner du den delen av skallen rett over øynene, med en sirkelsag, fra bare fremre til øynene for å bare bakre for dem. Deretter, ved hjelp av en borkrone, fjern beinet mellom øynene; olfaktoriske nerver ligger mellom øynene.
  8. Når tilstrekkelig bein er ryddet, fjerne fett og bindevev overliggende nerver ved hjelp av fine tang; vær forsiktig med å ikke skade nervene eller punktere noen blodkar.
    MERK: Erfaring vil bidra til å avgrense disseksjonen; jo mindre disseksjon, jo mer stabilt preparatet vil være. Imidlertid må tilstrekkelig vev ryddes; for de uerfarne, når olfaktoriske pærer er bare synlige, klar litt mer fremre for å utsette den delen av nervene som de blir med pærene for å tillate riktig posisjonering av elektrodene.
  9. Rengjør elektrodene før bruk ved å koble dem til negativ stang av en 3V DC-kilde (f.eks. to AA-batterier i serien) og plassere spissen i fysiologisk saltvann (eller sjøvann fortynnet 1:3 i ferskvann) i 20-30 s; en jevn strøm av små bobler bør sees kommer fra spissen.
  10. Når olfaktoriske nerver er utsatt, setter du inn opptakselektrodene (holdt på mikromanipulatorer) i en posisjon som gir maksimal respons på standarden (f.eks. 10-3 M L-serin), og en minimal respons på det tomme. Bruk parylenbelagte wolframelektroder (Materialsekk) som er koblet til hodestadiet på en vekselstrøm (AC) forforsterker.
    MERK: I seabream er de sterkeste svarene på aminosyrer vanligvis sett med elektrodene plassert i sidesiden av nerven, nær der den blir med olfaktorisk pære. Dette kan gjelder for andre arter, da den glomerulære organiseringen av pæren er bredt lik blant arter. Men erfaring er alltid den beste læreren.

4. Elektrofysiologiske opptak

MERK: Som med de fleste elektrofysiologier må opptak med flere enheter finne sted i et Faraday-bur. Ekstracellulær opptak krever imidlertid vanligvis ikke et vibrasjonsbord; de fleste bevegelser vil komme fra fisken. Likevel er det nødvendig med et sterkt, stabilt bord med en metalloverflate for å sikre de magnetiske basene til mikromanipulatorstativene.

  1. Sett opp et stimulansleveringssystem slik at den raske overgangen fra rent bakgrunnsvann til stimulansholdig vann, for eksempel ved hjelp av en magnetdrevet treveisventil. Koble det vanlige uttaket til røret som frakter vann til olfaktorisk rosett, og legg den ene linjen i et sjøvannsreservoar og den andre i testløsningen.
    MERK: Når ventilen er byttet (ved å passere likestrøm), bytter vannstrømmen fra bakgrunnsvann til det som inneholder luktstoffet. Stimulansen bør gis lenge nok til å se en klar topp i den integrerte responsen, etterfulgt av en overnattingsperiode; tiden som brukes i gjeldende protokoll er 4 s, men lengre tid kan være nødvendig avhengig av arten.
  2. Koble ventildriveren til utløseren av en analog-digital omformer (f.eks. Digidata); når ventilen byttes fra bakgrunn til stimulansholdig linje, vil dette starte opptaket av dataene. Konfigurer programvaren til å starte opptaket ved utløserhendelsen og fortsette i en forhåndsbestemt periode (f.eks. 10 s).
    MERK: Ti sekunder skal være nok, men dette kan forkortes eller forlenges, avhengig av det eksperimentelle spørsmålet.
  3. Kontroller stabiliteten til preparatet ved å teste (registrere og måle amplituden til den integrerte responsen) gjentatte ganger med standarden, 10-3 M L-serin i dette tilfellet, og la 1 min gå mellom påfølgende stimuli.
    MERK: Avhengig av til en viss grad på arter og luktstoff, bør svarene ha en amplitude innen 10% av hverandre (som tommelfingerregel), og bør ha en rask start, stige til maksimal aktivitet og gå tilbake til baseline etter at stimulansen er fraværende (figur 4).
  4. Registrer olfaktoriske nerveresponser på aminosyrer i kontroll sjøvann (fra den laveste til høyeste konsentrasjonen) og la 1 min gå mellom påfølgende stimuli.
    MERK: Det er mulig at det for noen arter og/eller noen luktstoffer er mer tid nødvendig. Men for aminosyrer og sjøstråle er 1 min tilstrekkelig.
  5. Registrer responsen på 10-3 M serin og en kontroll vann tom løsning.
  6. Bytt bakgrunnsvannet fra kontroll sjøvann til høyt CO2 sjøvann, ved å plassere bakgrunnslinjen i flasken med høyt CO2 sjøvann.
    MERK: Det anbefales å sette inn et annet hematocritrør (eller tilsvarende) i enden av stimulans- og bakgrunnslinjene for å unngå å berøre vannet og sikre at enden av røret forblir i vannet.
  7. Før testing av responsen fra olfaktornerven til aminosyrer i høyt CO2 sjøvann, må du beholde olfaktoriske epitelet med høyt CO2-vann ved å følge det høye CO2-vannet over olfaktorepitelet i noen minutter.
    MERK: Erfaring har vist at for seabream er 5 min tilstrekkelig.
  8. Registrer olfaktoriske nerveresponser på aminosyrer i høyt CO2 sjøvann (fra den laveste til høyeste konsentrasjonen).
  9. Registrer responsen på en høy CO2 vann blank løsning.
  10. Registrer responsen på 10-3 M serin og en kontroll vann tom løsning.
    MERK: Råsignalet (nerveaktiviteten) skal filtreres (lav passering rundt 2000–5000 Hz, høypass 50–300 Hz) og sendes til en analog-digital omformer (Materialse ). For enklere kvantifisering av nerveaktivitet, kan råsignalet også integreres ved hjelp av en lekk integrator (Table of Materials) og sendes til den analoge digitale omformeren, og derfra kan både rå og integrerte signaler til en datamaskin som kjører riktig programvare (f.eks. Axoscope).

5. Dataanalyse

  1. Trekk amplituden til den integrerte responsen til det tomme (i mV) fra amplituden til de integrerte svarene på alle stimuli.
  2. Normaliser svar på stimuli ved å dele amplituden til den forrige responsen på standarden (10-3 M serin); dette reduserer inter- og intra-fisk variasjon.
  3. Beregn terskler for deteksjon ved lineær regresjon av konsentrasjonsresponskurvene (på en halvloggaritmisk plott), i henhold til formelloggen(N + 1,5) = enlogg C + B, hvor C er molarkonsentrasjonen, N er normalisert responsalitud, og a og b erkonstanter 7,14.
    MERK: Terskelen for deteksjon er da verdien for x der y = 0,1761 (det vil si logg 1.5; N = 0); konsentrasjonen over hvilke et svar vil bli sett (det vil si at fisken kan lukte den). Noen luktstoffer fremkaller sigmoidal konsentrasjonsresponskurver når de plottes halvloggaritmisk (f.eks. kalsium15,16; i dette tilfellet kan de normaliserte dataene monteres på en treparameter Hill-plott som vil gi maksimal respons amplitude og EC50 (det vil si [luktmiddel] som gir halv maksimal respons; også et mål på følsomhet).
  4. Sammenlign terskler for deteksjon og/eller maksimal responsalitud og EC50 av stimuli testet i kontrollvann og de som testes i høyt CO2-vann.

Representative Results

En typisk respons på den positive kontrollen (10-3 M L-serine; Figur 4A) og negativ kontroll (tom; Figur 4B) registrert fra olfaktornerven til et sjøjord er vist i figur 4. I nærvær av stimulansen (svart horisontal bar; i olfaktorhulen, i kontakt med olfaktoriske epitel), legg merke til den raske økningen i aktivitet (reflektert i oppadgående nedbøyning av det integrerte signalet) til en topp innen omtrent ett sekund av stimulansen, etterfulgt av en periode med overnatting (mens stimulansen fortsatt er tilstede), og en retur til baseline aktivitet når stimulansen er avsluttet. Den absolutte amplituden av responsen er svært avhengig av elektrodeposisjon; Hvis det registreres en lav amplitudrespons, kan du prøve å endre elektrodeposisjonene. En langsommere økning til toppaktivitet kan skyldes at røret som bærer det stimulansholdige vannet til det olfaktoriske epitelet som plasseres for langt unna epitelet; prøve å flytte neserøret nærmere (men ikke berøre) epitelet. Legg merke til at det tomme derimot fremkaller lite eller ingen respons. En betydelig positiv respons (det vil si økning i aktivitet) til det tomme kan indikere forurensning av vannet som brukes til å fortynninger av stimuli; å lage friske fortynninger med rent vann (og glass) bør løse dette. Hvis ikke, kan det være nødvendig med en grundigere rengjøring av vannsystemet (inkludert aktiverte kullfiltre). En negativ respons (det vil si reduksjon i aktivitet) kan indikere en liten endring i strømningshastigheten når ventilen byttes på grunn av for eksempel en blokkering i ventilen.

En typisk konsentrasjonsresponskurve (plottet halvloggaritmisk), i dette tilfellet til L-leucin (10-7 M til 10-3 M), er vist i figur 5A. Legg merke til at økende konsentrasjoner av luktstoffet fremkaller stadig større økninger i aktivitet, og derfor i amplituden av de integrerte svarene. En tomt av de normaliserte dataene, og deres tilsvarende lineære regresjon, vises i figur 5B. Den estimerte terskelen for deteksjon kan beregnes ut fra verdien x når y = 0,1761 (det vil si log1.5; der N = 0). I dette tilfellet er denne verdien -7,48; det vil si den beregnede terskelen for L-leucin i denne fisken er 10-7,48 M. Eksponenten α kan på samme måte estimeres fra lineær regresjon av de normaliserte dataene på et loggloggplott; loggN = αlog [lukt] + konstant. Faktoren γ gir deretter økningen i luktkonsentrasjon som kreves for å øke responsalituden med en loggenhet; det vil si at det er et estimat av brattheten i konsentrasjonsresponskurven17. I dette eksemplet, α = 0,277 og γ = 3,61; Derfor, for å øke responsen amplitude ti ganger (det vil si en loggenhet; log10 = 1), må stimulanskonsentrasjonen økes med 103,61-fold (4074 ganger).

En typisk sigmoidal konsentrasjonsresponskurve (figur 6A) når plottet halv logaritmisk, i dette tilfellet til L-glutamin, er vist i figur 6B. En lignende konsentrasjonsavhengig økning i respons amplitude er sett; Men ved høyere konsentrasjoner blir denne økningen mindre slik at responsalituden når maksimalt (Nmaks). Dette gjør at dataene kan monteres på en tre parameter Hill ligning:
Equation 1

På denne måten kan EC50 (luktkonsentrasjonen der en 50% maksimal respons fremkalles) og Hill co-effektiv (et mål på brattheten i skråningen av den lineære delen av sigmoidalkurven) beregnes.

Figure 1
Figur 1: Programvare skjermbilde som viser inndatavinduet fra programmet CO2Calc. Uthevet (røde bokser) er feltene som kreves for beregning av karbonatparameter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Programvareskjermbilde som viser inngangsvinduet for de aktuelle konstantene, enhetene og skalaene. Verdiene som vises anbefales for forhold der de beskrevne eksperimentene ble utført; de kan forandre seg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Programvareskjermbilde som viser resultatvinduet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Typiske multi-unit svar registrert ekstracellulært fra olfaktorisk nerve av seabream in vivo som svar på 10-3 M L-serine (A) og blank (B). Øvre spor viser de integrerte svarene og lavere spor viser rå (nerve) signal. Stimuli ble brukt på olfaktoriske epitel (horisontale barer). Legg merke til den raske økningen i aktivitet i løpet av 1-nivået, en topp i aktivitet, etterfulgt av en overnattingsperiode (mens luktstoffet fortsatt ble levert til epitelet) og en retur til baselinenivåer når luktleveransen har opphørt. Liten eller ingen økning i aktivitet ses etter stimulering med vann behandlet på samme måte som lukt fortynninger, med unntak av å legge til lukt (blank). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Typisk konsentrasjonsresponskurve for L-leucin registrert ekstracellulært fra olfaktornerven in vivo. (A)Etter hvert som konsentrasjonen av L-leucin påføres olfaktoriske epitel (horisontale stenger) øker fra 10-7 Mtil 10 -3 M, ses en samtidig økning i aktiviteten i nerven. Øvre spor viser de integrerte svarene og lavere spor viser rå (nerve) signal. (B)Lineær regresjon (R2 = 0,97) av normaliserte data plottet semi-logaritmisk for å beregne terskelen for deteksjon som verdi for logg [L-leucin] når logg(N + 1.5) = 0.1761 (det vil si hvor N = 0). I dette eksemplet er denne verdien -7,48; den estimerte terskelen for deteksjon for L-leucin i denne fisken er derfor 10-7,48 M. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Typisk konsentrasjonsresponskurve for L-glutamin registrert ekstracellulært fra olfaktornerven in vivo. (A)Etter hvert som konsentrasjonen av L-glutamin påføres olfaktoriske epitel (horisontale stenger) øker fra 10-7 Mtil 10 -3 M, ses en samtidig økning i aktiviteten i nerven. Øvre spor viser de integrerte svarene og lavere spor viser rå (nerve) signal. (B)Semi-logaritmisk plott av normaliserte data montert på en tre-parameter Hill ligning (R2 = 0,99). I dette eksemplet er den beregnede EC50 = 3,11 μM og Hill co-effektiv = 0,565). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den nåværende studien beskriver bruken av multi-unit (ekstracellulær) opptak fra olfaktorisk nerve av seabream (S. aurata), en marine sparid av stor betydning i akvakultur. Denne eksperimentelle tilnærmingen kan imidlertid brukes bredt på annen fisk; kirurgi og nøyaktig plassering av elektroder vil helt klart avhenge av anatomien til olfaktorisk system, og valg og konsentrasjon av bedøvelse kan avhenge av arten som studeres. For eksempel er olfaktorisk nerve av gullfisken (Carassius auratus) kort; i dette tilfellet ville det være enklere å registrere EEG fra olfaktorisk pære. Valget av lukt kan også avhenge av arten til en viss grad. Den nåværende studien brukte aminosyrer. Så vidt forfatterne er klar over, alle fiskearter undersøkt til dags dato har olfaktorisk følsomhet for aminosyrer1,18. Denne følsomheten har vært innblandet er ulike prosesser som mat plassering, kjemisk kommunikasjon og anerkjennelse av natal farvann19,,20,,21,,22,,23. Imidlertid er følsomheten til forskjellige arter, generelt sett, ganske like og er ikke avhengig av livsstil eller habitat. De er også veldefinerte molekyler og er billig og lett tilgjengelig. Disse grunnene gjør dem ideelle test stimuli for studier på olfaction i fisk, spesielt de som undersøker effekten av antropogene forstyrrelser (f.eks forsuring eller forurensning), hvor resultatene lett kan sammenlignes på tvers av arter24.

Avhengig av den aktuelle arten kan forberedelsene til multi-unit opptak forbli stabile i flere timer; amplituden av respons på den interne standarden (10-3 M L-serin i den nåværende studien) bør ikke variere med mer enn 10% mellom påfølgende tester. Eventuelle vesentlige avvik fra denne tommelfingerregelen kan skyldes: (i) bevegelse av fisken, og derfor forskyvning av elektrodene og / eller nese-rør; (ii) forurensning av vannet, for eksempel ved å komme i kontakt med eksperimentererens hender (spesielt hvis lavere konsentrasjoner av en gitt luktmiddel gir større respons enn høyere konsentrasjoner); eller (iii) forverring av preparatets helse). I tilfelle (i), bør fisken kontrolleres for å ha flyttet; I så fall, omplassere det, og tilsett mer bedøvelse til vannet og / eller gi en ny dose gallamin triethiodide. Tillat 5 min og test standarden på nytt. Hvis responsen fortsatt er mindre, kan elektrodene og/eller neserøret flyttes til det registreres tilstrekkelig stor respons. I tilfelle (ii), bare remake en frisk fortynning serie av luktstoff, ved hjelp av rent glass og vann. I tilfelle (iii), kontroller at strømmen av vann over fiskens gjeller er tilstrekkelig, at vannet strømmer over gjellene (det vil si spennende via opercula, i stedet for munnen), og vannet er godt luftet. Ulike fiskearter har vidt forskjellige temperaturpreferanser; sikre at laboratoriet) temperaturen (og at vannet i kontakt med fisken) er så nær temperaturen som fisken holdes på som mulig. Sørg også for at fisken ikke er stresset, og unngå å flytte dem (selv fra en tank til en annen) i minst en uke før opptak. Elektrisk støy er selvfølgelig banen til en elektrofysiologs liv; Den nåværende artikkelen er imidlertid ikke riktig medium for å diskutere hvordan man kan overvinne / redusere dette. Likevel er 'The Axon Guide' (tilgjengelig fritt som pdf for nedlasting fra produsentens hjemmeside) en kilde til praktiske råd om støyminimering. Når en stor, stabil respons fremkales av standard stimulans, og en konsentrasjonsserie gir en konsentrasjonsavhengig økning i amplitud, med minimal respons på det tomme, kan opptaksresponser på teststimuli begynne. Noen forfattere gir samme stimulans tre ganger, og beregner det aritmetiske gjennomsnittet for etterfølgende dataanalyse. Dette er imidlertid tekniske repliker, og denne tilnærmingen vil øke tiden en opptaksøkt tar med tre ganger. De nåværende forfatterne foretrekker å teste en gitt lukt en gang, men alltid en del av en konsentrasjonsresponskurve. Dette tillater ikke bare beregning av terskelen for deteksjon eller EC50 (som beskrevet), men sikrer også at konsentrasjoner nær de som fisken vil oppleve i sitt naturlige miljø testes (dette er ikke alltid kjent). Videre er eventuelle ytre responser, på grunn av forurensning for eksempel, lettere å oppdage; disse kan deretter gjentas ved hjelp av en nylaget prøve om nødvendig.

Multi-enhet opptak fra olfactory nerve kan være invasiv, men det er mer følsomt enn EOG når registrert i sjøvann7, som det er uavhengig av ekstern saltholdighet. Det kan derfor brukes til å vurdere olfaktorisk følsomhet for luktstoffer, som kalsium og natrium, endringer i konsentrasjonene som også vil påvirke konduktiviteten og dermed spenninger registrert15. Som et estimat av antall ORN-er som reagerer på en gitt lukt (det vil si handlingspotensialer som reiser langs ORN-aksoner fra olfaktoriske epitel til pæren), representerer det et rått, ubehandlet signal (innledende behandling av olfaktorisk inngang begynner i pærene). Derfor er det en bedre parameter for å vurdere de direkte effektene av forurensende stoffer, som tungmetaller og miljøendringer, for eksempel pH, på olfaktorisk system enn EOG eller EEG24,25. Opptak fra olfaktorisk pære i sjøvann med høy PCO2 (og derfor lav pH) kan påvirkes av sentrale effekter av pH på neural behandling; 'GABAEn reseptorteori' av havforsuring26, hvorved reduksjon i vann pH forårsaker en omfordeling av Cl- og HCO3- ion i CSF og et påfølgende skifte av GABAergic aktivering fra hemmende (hyperpolarizing) til excitatory (depolariserende). Videre, i slike studier, er det viktig å vurdere effekten av forsuring eller forurensende stoffer ved hjelp av luktkonsentrasjoner som ligner på de fisken sannsynligvis vil møte i sitt naturlige miljø. For aminosyrer er dette i nano til mikromosområde27,28,29; nær terskelen for påvisning av disse forbindelsene i fisk1,18. Estimering av terskelen for deteksjon for en gitt lukt kan gi noen ide om viktigheten og / eller biologisk rolle olfaktorisk følsomhet. For eksempel har sjøsøye (Petromyzon marinus) høy olfaktorisk følsomhet for spesifikke gallesyrer utgitt av larver ned til en terskel på 10-13 M30; Denne følsomheten gjør det mulig for voksne å lokalisere og identifisere egnede gyteområder, og fungerer derfor som en migrerende feromon over lang avstand. Tilsvarende har moden kvinnelig sjøøye høy olfaktorisk følsomhet for sædceller (terskel 10-14 M), et polyamin utgitt i milten av menn, som deretter tiltrekker dem til reiret av spermierende menn31. Andre fisk har også olfaktorisk følsomhet for polyamin32,,33,,34,,35, men ikke med tilstrekkelig lave terskler for deteksjon for å støtte en lignende feromonal rolle; I stedet foreslås unngåelse av råtnende fisk. Likevel, med så høye olfaktoriske følsomheter, er det mulig å forestille seg at en liten reduksjon i følsomhet (det vil si økning i terskel), selv når responsalituden ikke reduseres dramatisk, kan forårsake alvorlige problemer for fisk24.

Når plottet semi-logaritmisk, konsentrasjon-respons kurver til luktstoffer kan være eksponentiell, lineær eller sigmoidal18. Når det gjelder aminosyrer, er slike halvloggaritmiske konsentrasjonsresponskurver enten lineære (det vil vil vil ha logaritmisk), sigmoidal eller effektfunksjoner7. At ingen metning av responsen er sett (det vil si ingen platå i konsentrasjonsresponskurven, selv ved supra-miljøkonsentrasjoner) skyldes sannsynligvis flere reseptorer som binder seg til individuelle aminosyrer, avhengig av konsentrasjonen, i stedet for hver aminosyre som binder seg til en bestemt reseptor; som konsentrasjonen av en gitt aminosyre øker, flere reseptorer er i stand til å binde den og derfor svare. Likevel kan fisk skille mellom blandinger av aminosyrer36,37,38,39; dette skyldes sannsynligvis kombinatoriske aktivitetsmønstre fremkalt i olfaktoriske pærer12,,40; aksonene til alle ORNer som uttrykker det samme reseptorproteinet avsluttes på samme glomeruli i olfaktoriske pærer41,,42,og en aminosyre kan aktivere mer enn én glomerulus.

Imidlertid kan svært spesifikke luktstoffer, som feromoner, fremkalle sigmoidal eller kvasi-sigmoidal konsentrasjonsresponskurver43,44. Slutningen, men ikke empirisk testet, er at disse olfaktoriske reaksjonene skyldes svært spesifikke reseptorer som binder feromonmolekylet og lite annet. Derfor, over en gitt konsentrasjon, er alle reseptorer okkupert, og ytterligere økninger vil ikke fremkalle ytterligere svar i andre ORNer. Derfor kan disse dataene monteres på en tre-parameter Hill tomt, og maksimal respons, EC50 og Hill co-effektiv kan beregnes15,,45,,46. Dette kan gi verdifull informasjon, for eksempel tilsynelatende affinitet og tilsynelatende reseptornummer, at lineære eller eksponentielle konsentrasjonsresponskurver ikke kan gi.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeid i forfatternes lab støttes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, prosjekter PTDC/BIA-BMA/30262/2017 og UID/Multi/04326/2019 og kontraktsprogram DL57/2016/CP1361/CT0041 til ZV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC pre-amplifier Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL104 Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) 1440A Analogue-digital converter.
EMG Integrator Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL703 Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage Made in-house To reduce electrical noise.
Filter Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL125/6 Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide Sigma-Aldrich (Portugal) G8134 Neuromuscular blocker
L-glutamine Sigma-Aldrich (Portugal) G3126 Amino acid used as odorant
L-leucine Sigma-Aldrich (Portugal) L80000 Amino acid used as odorant
L-serine Sigma-Aldrich (Portugal) S4500 Amino acid used as odorant
Metalic base-plate Any Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes Any To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators Narishige International Ltd (London, UK) M-152 Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Sigma-Aldrich (Portugal) E10505 Anesthetic
pH probe Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI12302 Probe to measure pH of water.
Refractometer Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI96822 Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Portugal) 746398 For saline solution
Solenoid valves The Lee Co. (Essex, CT, USA) LFAA1201618H For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope Zeiss, Leica, Olympus Any suitable model. For dissection and placement of electrodes.
Titrator Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI84531 Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ World Precision Instruments (Hitchin, UK) TM31A10 Extracellular electrodes.
Valve Driver Made in-house 12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible) Any To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasumyan, A. O. The olfactory system in fish: structure, function, and role in behaviour. Journal of Ichthyology. 44 (Suppl 2), S180-S223 (2004).
  2. Michel, W. C. Chemoreception. The Physiology of Fishes. Evans, D. H., Claiborne, J. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 471-497 (2006).
  3. Wisenden, B. D. Chemical cues that indicate risk of predation. Fish Pheromones and Related Cues. Sorensen, P. W., Wisenden, B. D. , John Wiley & Sons Inc. Ames, IA. 131-148 (2015).
  4. Tierney, K. B., et al. Olfactory toxicity in fishes. Aquatic Toxicology. 96 (1), 2-26 (2010).
  5. Caprio, J. In vivo olfactory and taste recordings in fish. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Current Techniques and Protocols. Spielman, A. I., Brand, J. G. , CRC Press. Boca Raton, FL. 251-261 (1995).
  6. Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electoolfactogram: a review of its history and uses. Microscopy Research and Technique. 58, 152-160 (2002).
  7. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Ozório, R. O. A., Valente, L. M. P., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to amino acids in the blackspot seabream (Pagellus bogaraveo): a comparison between olfactory receptor recording techniques in seawater. Journal of Comparative Physiology A. 197 (8), 839-849 (2011).
  8. Hamdani, E. H., Døving, K. B. The functional organization of the fish olfactory system. Progress in Neurobiology. 82 (2), 80-86 (2007).
  9. Hara, T. J., Zhang, C. Topographic bulbar projections and dual neural pathways of the primary olfactory neurons in salmonid fishes. Neuroscience. 82 (1), 301-313 (1998).
  10. Thommesen, G. The spatial distribution of odour induced potentials in the olfactory bulb of the char and trout (Salmonidae). Acta Physiologica Scandinavica. 102, 205-217 (1978).
  11. Nikonov, A. A., Caprio, J. Electrophysiological evidence for a chemotopy of biologically relevant odors in the olfactory bulb of the channel catfish. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 1869-1876 (2001).
  12. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Chemotopic, combinatorial, and noncombinatorial odorant representations in the olfactory bulb revealed using a voltage-sensitive axon tracer. Journal of Neuroscience. 18 (23), 9977-9988 (1998).
  13. Pierrot, D. E., Lewis, E., Wallace, D. W. R. MS Excel programme developed for CO2 system calculations. ORNL/CDIAC-105a, Carbon Dioxide Information Analysis Center. , Oak Ridge National Laboratory, US Department of Energy, Oak Ridge, TN. (2006).
  14. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to catecholamines and their metabolites in the goldfish. Chemical Senses. 28 (3), 207-218 (2003).
  15. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the marine teleost Sparus aurata. Journal of Experimental Biology. 203 (24), 3821-3829 (2000).
  16. Hubbard, P. C., Ingleton, P. M., Bendell, L. A., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the freshwater teleost Carassius auratus: an olfactory role for the Ca2+-sensing receptor? Journal of Experimental Biology. 205, 2755-2764 (2002).
  17. Byrd, R. P. Jr, Caprio, J. Comparison of olfactory receptor (EOG) and bulbar (EEG) responses to amino acids in the catfish, Ictalurus punctatus. Brain Research. 249 (1), 73-80 (1982).
  18. Hara, T. J. The diversity of chemical stimulation in fish olfaction and gustation. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4 (1), 1-35 (1994).
  19. Kawabata, K. Induction of sexual behavior in male fish (Rhodeus ocellatus ocellatus) by amino acids. Amino Acids. 5 (3), 323-327 (1993).
  20. Shoji, T., Yamamoto, Y., Nishikawa, D., Kurihara, K., Ueda, H. Amino acids in stream water are essential for salmon homing migration. Fish Physiology and Biochemistry. 28 (1-4), 249-251 (2003).
  21. Yamamoto, Y., Hino, H., Ueda, H. Olfactory imprinting of amino acids in lacustrine sockeye salmon. PLoS ONE. 5 (1), e8633 (2010).
  22. Kutsyna, O., Velez, Z., Canário, A. V. M., Keller-Costa, T., Hubbard, P. C. Variation in urinary amino acids in the Mozambique tilapia: a signal of dominance or individuality?. Chemical Signals in Vertebrates 13. Schulte, B., Goodwin, T., Ferkin, M. , Springer. Cham, Switzerland. 189-204 (2016).
  23. Velez, Z., Hubbard, P. C., Hardege, J. D., Barata, E. N., Canário, A. V. M. The contribution of amino acids to the odour of a prey species in the Senegalese sole (Solea senegalensis). Aquaculture. 265, 336-342 (2007).
  24. Porteus, C. S., et al. Near-future CO2 levels impair the olfactory system of a marine fish. Nature Climate Change. 8 (8), 737-743 (2018).
  25. Velez, Z., Roggatz, C. C., Benoit, D. M., Hardege, J. D., Hubbard, P. C. Short- and medium-term exposure to ocean acidification reduces olfactory sensitivity in gilthead seabream. Frontiers in Physiology. 10, 731 (2019).
  26. Nilsson, G. E., et al. Near-future carbon dioxide levels alter fish behaviour by interfering with neurotransmitter function. Nature Climate Change. 2 (3), 201-204 (2012).
  27. Fuhrman, J. A., Ferguson, R. L. Nanomolar concentrations and rapid turnover of dissolved free amino acids in seawater: agreement between chemical and microbiological measurements. Marine Ecology - Progress Series. 33 (3), 237-242 (1986).
  28. Pomeroy, L. R., Macko, S. A., Ostrom, P. H., Dunphy, J. The microbial food web in Arctic seawater: concentration of dissolved free amino acids and bacterial abaundance and activity in the Arctic Ocean and in Resolute Passage. Marine Ecology - Progress Series. 61 (1-2), 31-40 (1990).
  29. Poulet, S. A., Williams, R., Conway, D. V. P., Videau, C. Co-occurrence of copepods and dissolved free amino acids in shelf sea waters. Marine Biology. 108 (3), 373-385 (1991).
  30. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  31. Scott, A. M., et al. Spermine in semen of male sea lamprey acts as a sex pheromone. PLoS Biology. 17 (7), e3000332 (2019).
  32. Da Silva, J. P., et al. Synthetic versus natural receptors: supramolecular control of chemical sensing in fish. ACS Chemical Biology. 9 (7), 1432-1436 (2014).
  33. Hussain, A., et al. High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor cadaverine. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 19579-19584 (2013).
  34. Michel, W. C., Sanderson, M. J., Olson, J. K., Lipschitz, D. L. Evidence of a novel transduction pathway mediating detection of polyamines by the zebrafish olfactory system. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1697-1706 (2003).
  35. Rolen, S. H., Sorensen, P. W., Mattson, D., Caprio, J. Polyamines as olfactory stimuli in the goldfish Carassius auratus. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1683-1696 (2003).
  36. Kang, J., Caprio, J. Electro-olfactogram and multiunit olfactory receptor responses to complex mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of General Physiology. 98 (4), 699-721 (1991).
  37. Kang, J., Caprio, J. Electrophysiological responses of single olfactory bulb neurons to binary mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of Neurophysiology. 74 (4), 1435-1443 (1995).
  38. Valentincic, T., Kralj, J., Stenovec, M., Koce, A., Caprio, J. The behavioral detection of binary mixtures of amino acids and their individual components by catfish. Journal of Experimental Biology. 203, 3307-3317 (2000).
  39. Valentincic, T., Wegert, S., Caprio, J. Learned olfactory discrimination versus innate taste responses to amino acids in channel catfish (Ictalurus punctatus). Physiology and Behavior. 55 (5), 865-873 (1994).
  40. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  41. Vassar, R., et al. Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell. 79 (6), 981-991 (1994).
  42. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87 (4), 675-686 (1996).
  43. Keller-Costa, T., et al. Identity of a tilapia pheromone released by dominant males that primes females for reproduction. Current Biology. 24 (18), 2130-2135 (2014).
  44. Sorensen, P. W., Hara, T. J., Stacey, N. E. Extreme olfactory sensitivity of mature and gonadally-regressed goldfish to a potent steroidal pheromone, 17a,20b-dihydroxy-4-pregnen-3-one. Journal of Comparative Physiology A. 160 (3), 305-313 (1987).
  45. Keller-Costa, T., Canário, A. V. M., Hubbard, P. C. Olfactory sensitivity to steroid glucuronates in Mozambique tilapia suggests two distinct and specific receptors for pheromone detection. Journal of Experimental Biology. 217 (23), 4203-4212 (2014).
  46. Hubbard, P. C., Mota, V., Keller-Costa, T., da Silva, J. P., Canário, A. V. M. Chemical communication in tilapia: a comparison of Oreochromis mossambicus with O. niloticus. General and Comparative Endocrinology. 207, 13-20 (2014).

Tags

Tilbaketrekking Utgave 164 olfaction følsomhet nerve fisk forsuring aminosyre elektrofysiologi ekstracellulær
Ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfaktorisk nerve av teleosts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular … More

Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts. J. Vis. Exp. (164), e60962, doi:10.3791/60962 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter