Summary
Vi presenterer en optimalisert tandemmassetag (TMT) merkingsprotokoll som inneholder detaljert informasjon for hvert av følgende trinn: proteinutvinning, kvantifisering, nedbør, fordøyelse, merking, innsending til et proteomikkanlegg og dataanalyser.
Abstract
Proteomiske teknologier er kraftige metoder som kan hjelpe vår forståelse av virkningsmekanismer i biologiske systemer ved å gi et globalt syn på virkningen av en sykdom, behandling eller annen tilstand på proteomen som helhet. Denne rapporten gir en detaljert protokoll for utvinning, kvantifisering, nedbør, fordøyelse, merking og påfølgende dataanalyse av proteinprøver. Vår optimaliserte TMT-merkingsprotokoll krever en lavere konsentrasjon med tag-label og oppnår konsekvent pålitelige data. Vi har brukt denne protokollen til å evaluere proteinuttrykksprofiler i en rekke musevev (dvs. hjerte, skjelettmuskulatur og hjerne) samt celler dyrket in vitro. I tillegg viser vi hvordan man evaluerer tusenvis av proteiner fra det resulterende datasettet.
Introduction
Begrepet "proteomics" ble først definert som storskala karakterisering av hele proteinkomplementet til en celle, vev eller organisme1. Proteomiske analyser muliggjør undersøkelse av mekanismer og cellulære prosesser involvert i sykdomsutvikling, terapeutiske veier og sunne systemer ved hjelp av teknikker for å utføre relativ kvantifisering avproteinuttrykksnivåer 2. De første beskrivelsene av slike studier ble publisert i 1975 og demonstrerte bruken av todimensjonal polyakrylamid gelelektroforese (2D-PAGE) til dette formålet1,,3. 2D-metoden skiller proteiner basert på ladning (isoelektrisk fokusering, IEF) og molekylær masse (natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektroforese, eller SDS-PAGE)4. I årevis var kombinasjonen av 2D-PAGE og påfølgende tandemmassespektrometri utført på hver gelkomponent den vanligste umålrettede proteinuttrykksanalyseteknikken utført og identifiserte mange tidligere ukjente proteinuttrykksprofiler5,6. Generelle ulemper med 2D-PAGE-tilnærmingen er at det er tidkrevende, fungerer ikke bra for hydrofobe proteiner, og det er begrensninger i det totale antall proteiner vurdert på grunn av lav følsomhet7,8.
Den stabile isotopmerkingen ved aminosyrer i cellekultur (SILAC) metoden ble den neste populære tilnærmingen til å identifisere og kvantifisere proteinoverflod i prøver9. Den består av metabolsk merking av celler som inkuberes i medium som mangler en standard essensiell aminosyre og supplert med en isotop-merket versjon av den spesifikke aminosyren10. Fordelen med denne teknikken er dens effektivitet og presis merking9. Hovedbegrensningen til SILAC-tilnærmingen er først og fremst den reduserte cellevekstfrekvensen forårsaket av isotopetikett inkorporering, noe som kan være spesielt utfordrende i relativt følsomme cellelinjer som modellerer menneskelige sykdommer11.
I 2003 ble en roman og robust proteomikk teknikk som involverer tandem masse tag (TMT) isobaric etiketter introdusert til feltet12. TMT merking er en kraftig metode på grunn av sin økte følsomhet for å oppdage relative protein uttrykk nivåer og posttranslational modifikasjoner13. Fra og med denne publiseringsdatoen er TMT-sett utviklet som samtidig kan merke 6, 10, 11 eller 16 prøver. Som et resultat er det mulig å måle peptid overflod i flere forhold med biologiske replikerer samtidig14,15,16. Vi har nylig brukt TMT til å karakterisere hjerteproteomisk profil av en musemodell av Barth syndrom (BTHS)17. Ved å gjøre dette var vi i stand til å demonstrere utbredt forbedring i hjerteprofilene til BTHS-mus behandlet med genterapi og identifisere nye proteiner påvirket av BTHS som avslørte nye terapeutiske veier involvert i kardiomyopatier.
Her beskriver vi en detaljert metode for å utføre multipleks TMT kvantitative proteomikkanalyser ved hjelp av vevsprøver eller cellepellets. Det kan være nyttig å utføre prøveforberedelsen og merkingen før innsending til en kjerne fordi de merkede tryptiske peptidene er mer stabile enn rå frosne prøver, ikke alle kjerner har erfaring med å håndtere alle prøvetyper, og forbereder prøver i et laboratorium kan spare tid for kjerner, som ofte har lange backlogs. For detaljerte beskrivelser av massespektroskopidelen av denne prosessen, se Kirshenbaum et al. og Perumal et al.18,19.
Prøveforberedelsesprotokollen består av følgende hovedtrinn: ekstraksjon, kvantifisering, nedbør, fordøyelse og merking. De viktigste fordelene med denne optimaliserte protokollen er at den reduserer kostnadene ved merking, forbedrer proteinutvinning og konsekvent genererer data av høy kvalitet. I tillegg beskriver vi hvordan du analyserer TMT-data for å screene tusenvis av proteiner på kort tid. Vi håper at denne protokollen oppfordrer andre forskningsgrupper til å vurdere å innlemme denne kraftige metodikken i sine studier.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee fra University of Florida godkjente alle dyrestudier.
1. Tilberedning av reagenser
- Forbered CHAPS Lysis Buffer (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS og 1 proteasehemmer cocktailtablett per 50 ml buffer). Buffer uten proteasehemmere kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder eller buffer med proteasehemmer lagret ved -20 °C opptil 1 år.
- Forbered 100 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB): Tilsett 500 μL 1 M TEB til 4,5 ml ultrapure vann.
- Forbered 200 mM tris (2-karboksyetyetylen) fosfinhydroklorid (TCEP): Tilsett 70 μL 0,5 M TCEP, en denaturing reagens, til 70 μL ultrapure vann. Tilsett deretter 35 μL av 1 M TEB.
- Forbered 5% hydroksyamin: Tilsett 50 μL 50% hydroksyamin til 450 μL på 100 mM TEB.
2. Protein ekstraksjon
- Isoler quadriceps muskel fra en euthanized mus i henhold til en IACUC godkjent protokoll. Frys og vedlikehold ved -80 °C eller fortsett med protokollen for umiddelbar bruk.
- Klipp for å isolere ca 10 mg fersk eller frossen quadriceps musevev. Separate fibre ved hjelp av pinsett når du arbeider med skjelettmuskulatur. Alternativt, hvis du arbeider med cellekulturer, resuspend ~ 3 x 106 celler i 300 μL chaps lysis buffer og hoppe til trinn 2.4.
- Homogeniser vev ved hjelp av en perle disrupter ved hjelp av 2 ml rør fylt med ca 200 μL av 1 mm zirkonia / silika perler og 500 μL chaps lysis buffer. Skaler opp eller ned etter behov (f.eks. 5 mg vev i 250 μL CHAPS lysisbuffer).
- Utfør sonikering (10x for 10 s hver med 50% amplitude og 30 s intervaller på is) for å frigjøre protein bundet til DNA. De samme DNA-nedbrytningsresultatene kan oppnås enten med sprøytelys ved å passere lysate 10x gjennom en 21 G nål festet til en 1 ml sprøyte, eller ved benzonase inkubasjon (44 U/ml) ved 37 °C i 30 min.
- Sentrifuger lysatet ved 16.000 x g i 10 min ved 4 °C og overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør.
3. Proteinmåling
- Bestem proteinkonsentrasjonen av supernatant ved hjelp av etablerte protokoller (se Tabell over materialer).
MERK: Det er best å bruke prøver ved ≥ 2 μg/μL, men mindre konsentrerte prøver kan også brukes. Hvis en mindre konsentrert prøve brukes, vil det være nødvendig å justere volumene til reduksjons-/alkylerende reagenser i trinn 5.1. - Klargjør en BSA standard kurvefortynning ved hjelp av CHAPS lysis buffer.
- Følg produsentens instruksjoner, og les etter 15 min absorbansen på 750 nm.
4. Reduksjon/alkylerende reagensbehandling
- Overfør 200 μg protein per tilstand til et nytt sentrifugerør og juster til et endelig volum på 100 μL ved hjelp av CHAPS lysis buffer. Det er mulig å skalere opp til 200 μL når proteinkonsentrasjonen er for lav, men ikke glem å justere volumet for reduksjon/alkylerende reagens.
- Tilsett 5 μL av TCEP på 200 mM og inkuber ved 55 °C i 1 time.
- Umiddelbart før bruk, forberede 375 mM iodoacetamid ved å oppløse ett rør av iodoacetamid (dvs. 9 mg) i 132 μL av 100 mM TEAB. Beskytt denne løsningen mot lys.
- Tilsett 5 μL av 375 mM iodoacetamid til prøven og inkuber i 30 min ved romtemperatur (RT) beskyttet mot lys.
5. Metanol/kloroform nedbør20
- Tilsett 400 μL metanol til hver 100 μL protein og kort vortex prøver.
- Sentrifuge ved 9000 x g for 10 s ved RT. Dette er å innlemme væsker deponert på sidene av prøverøret.
- Tilsett 100 μL kloroform til blandingen og kort vortex. Bruk 200 μL kloroform hvis prøven har en høy konsentrasjon av fosfolipider.
- Sentrifuge ved 9000 x g for 10 s ved RT. Dette er å innlemme væsker deponert på sidene av prøverøret.
- Tilsett 300 μL vann og vortex kraftig. Det er viktig å oppnå en homogen løsning.
- Sentrifuge ved 9000 x g i 1 min ved RT. Vær svært forsiktig for å unngå å forstyrre lagene når du overfører røret til et stativ.
MERK: Røret skal nå inneholde tre faser: 1) Topplag (dvs. supernatant), en blanding av vann og metanol; 2) Midterste lag (dvs. interphase), hvit utfelt protein; og 3) Bunnlag (dvs. bunnfase), kloroform. - Fjern forsiktig supernatanten.
- Tilsett 300 μL metanol i gjenværende interfase og bunnfase. Vortex kraftig.
- Sentrifuge ved 9000 x g i 2 min ved RT. Vær svært forsiktig for å unngå å forstyrre lagene når du overfører røret til et stativ.
- Fjern forsiktig supernatanten.
- Aspirer så mye væske som mulig under en strøm av luft (f.eks. ved hjelp av en vakuumkonsentrator) ved RT til pelleten bare er litt fuktig (~ 10 min). Siden den nødvendige tiden kan være forskjellig for hver prøve, sjekk hvert 2 minutt for å vurdere. Oppbevar pelleten ved -80 °C inntil videre behandling.
6. Protein fordøyelse
- Resuspend den utfelte proteinpellet i 100 μL TEAB lysis buffer.
MERK: Det er valgfritt å måle proteinkonsentrasjonen på dette trinnet. - Umiddelbart før bruk, klargjør 1 μg/μL trypsin ved å tilsette 100 μL av trypsinlagringsløsningen (50 mM eddiksyre) til bunnen av hetteglasset med 100 μg trypsinglass og inkuber i 5 min ved RT. Oppbevar gjenværende reagens i engangsdoser ved -80 °C.
- Tilsett 2,5 μL trypsin per 100 μg protein. Fordøy prøven over natten ved 37 °C. Dette trinnet er avgjørende for fullstendig solubilisering av proteinet; ikke endre disse betingelsene. Etter fordøyelsen er det valgfritt å måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av standard proteinanalyser.
7. Merking av peptid
- Umiddelbart før bruk, likevekt tmt etikettsett reagenser til RT.
- Løs opp hvert av hetteglassene med 0,8 mg TMT-merke gjennom tilsetning av 41 μL vannfri acetonitril til hvert rør. Inkuber reagensen i 5 min ved RT med sporadisk vortexing. Kort sentrifuger rørene.
MERK: En konsentrasjon på 0,8 mg TMT-kode er vanligvis nok til å merke to sett. Andre forskere har imidlertid vist at denne konsentrasjonen kan reduseres ytterligere og fortsatt gi pålitelige data15. - Tilsett forsiktig 41 μL av TMT-etikettreagensen til hver 100 μL-prøve.
- Inkuber reaksjonen i 1 timer ved RT.
- Tilsett 8 μL av 5% hydroksyamin til prøven og inkuber i 15 min for å slukke reaksjonen.
- Del prøvene i like mengder i et nytt sentrifugerør og oppbevares ved -80 °C.
MERK: I dette trinnet er prøvene stabile og kan sendes inn for massespektroskopi. Det er valgfritt å måle konsentrasjon på dette punktet ved hjelp av standard proteinanalyser.
8. Massespektroskopi
- Send prøvene til et proteomikkanlegg (denne studien brukte UF ICBR Proteomics Core-anlegget), hvor alle prøvene kombineres og renses ved hjelp av C18-spinnkolonner.
MERK: Diskuter med kjerneanlegget hvordan du sender inn prøvene før du forbereder dem på å bekrefte de nøyaktige trinnene de foretrekker for innsendinger. - Be om følgende fremgangsmåter per kombinert multipleksprøve: helfaseutvinning, HPLC (SCX, SE), zip tip og LC-MS/MS (2 h gradering for protein-ID, hvis >10QE Plus).
- Når dataene er samlet inn, vil kjerneanlegget behandle RAW-filer ved hjelp av leverandørlevert programvare for proteinidentifikasjon.
9. Dataanalyse
- Data leveres vanligvis fra kjernen tilbake til brukeren i 7z-format, noe som kan kreve omtrent 16 GB diskplass per hvert datasett (i dette tilfellet 11 eksempler). For databehandling må du kontrollere at en datamaskin er tilgjengelig som er minst 3,4 GHz.
- Pakk ut filer ved hjelp av 7-Zip File Manager. Disse utpakkede filene inneholder RAW-data, pdStudy format fil, og pdResultView format fil. Lagre alle filer for ytterligere analyser.
- Åpne filen ved hjelp av Proteome Discovery 2.2 Software.
MERK: Filformatet er "Filnavn.pdStudy". Hvis "Filnavn.pdResultView" åpnes, er det ikke mulig å velge kontrolleksemplet. - Velg kontrolleksempler på"Samples"-panelet.
- Åpne Resultat ved å velge ID på"Analyseresultater"-panelet.
- Eksporter til regnearkprogramvare.
- Lagre rådata (alle identifiserte proteiner).
- Åpne regnearkprogramvarefilen. Dette vil inneholde alle proteiner som er identifisert.
- I regnearkprogramvarefilen bruker du"Filter"-funksjonen til skjermen "Protein FDR Confidence: Combined" i høy (kolonne B), " #UniquePeptider" høyere enn 2 (kolonne K), og enten en av " AbundanceRatio" blank utelukkende (kolonne S opp til W).
- Sette inn en kolonne for"p-value"beregning med funksjonen
=TTEST(kontrollgruppe,eksperimentell gruppe, haler, type) - Sett inn en kolonne for "Statistisk signifikans" med funksjonen
=HVIS(p-verdi<0,05, "Signifikans","NS") - Bruk funksjonen "Filter" til å vise "Statistisk signifikans" som viser "Signifikan ". Resultatet viser de analyserte proteinene med statistisk signifikans i kontrollgruppen og eksperimentell gruppe.
- Bestem signifikant høyere eller lavere proteinuttrykksoverflod i den eksperimentelle gruppen sammenlignet med kontrollgruppen, sett inn en kolonne for "Forordning"med funksjonen
=HVIS(GJENNOMSNITT(kontrollgruppe)>GJENNOMSNITT(eksperimentell gruppe),"Upregulert","Nedregulert")
10. Metoder for å evaluere betydelige treff
- For å identifisere protein-protein interaksjoner mellom de betydelige treff identifisert i TMT studier, bruk Search Tool for retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versjon 11.021: https://string-db.org/
- For å klassifisere etter grupper (dvs. molekylær funksjon, biologiske prosesser og proteinklasser) bruk Proteinanalyse gjennom Evolutionary Relationships (PANTHER) ontology klassifisering programvare22: http://www.pantherdb.org/
- For å identifisere proteininteraksjoner på en rekke veier, bruk pathway analysis software23.
11. Proteomisk data lastes opp til en repositoriumbank
- Hvis du vil sende proteomiske data til Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) eller Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE), inkluderer du følgende informasjon: topplistefilene (behandlede massespektrumfiler i et standardformat som mzXML, mzML, eller MGF), resultatfiler (spektrumidentifikasjoner i et standardformat som mzIdentML eller mzTab), og rå spektrumfiler (rå massespektrumfiler i et ikke-standard- eller instrumentspsifikt format som . RAW-filer eller . WIFF-filer).
- Hvis du vil sende inn, oppretter du en konto og inkluderer informasjon som tilknytning og prosjektdetaljer. Deretter velger du filene som er oppført i trinn 11.1, og laster dem opp.
- Hvis du vil opprette et offisielt datasett, kjører du en arbeidsflyt for innsending på disse opplastede filene.
MERK: Etter innsending vil datasettet være privat i repositoriet bank. Med det private alternativet er dataene bare tilgjengelige for autoriserte brukere. Det finnes to ekstra alternativer: 1) Delt datasett, som gir tilgang til journal korrekturlesere og samarbeidspartnere; eller 2) Offentlig datasett, som vil vises i offentlige datasettsøk. En annen viktig funksjon i disse repositoriene er muligheten til å oppdatere de opplastede dataene og knytte etterfølgende publikasjoner til det eksisterende datasettet.
Representative Results
Friske og syke celler ble lysert i CHAPS-buffer, utarbeidet som beskrevet i vår TMT-merkemetode, og sendt til University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (UF-ICBR) Proteomics Core for Liquid Chromatography med tandem massespektrometri. Etter datainnsamling og levering fra kjernen ble datasettet åpnet i leverandørleverans programvare, og følgende cutoff-filtre ble brukt: ≥2 unike peptider, reporterioner for hver proteinprøve som finnes i alle kanaler, og inkluderer bare signifikant endrede proteiner (p ≤ 0,05). Tabell 1 oppsummerer dataene: 39 653 totalt peptider, hvorav 7211 har lik eller større enn to unike peptider, og 3829 inkluderer reporterioner for alle kanaler. P-verdiene for disse 3829 peptidene ble beregnet av Studentens t-test og p ≤ 0,05 ble ansett som signifikante. I tillegg ble en fold-endring cutoff brukt til å bestemme den relative fordelingen av proteiner fra syke sammenlignet med friske celler: nedregulert (blå) eller upregulert (rød) (Figur 1).
Listen over signifikant dysregulert proteinuttrykk ble vurdert ved hjelp av PANTHER ontology klassifiseringssystem og STRING analyser. Panther analyser viste en kategorisert liste over proteiner basert på signifikant lavere (Figur 2A) eller høyere overflod i syke celler basert på molekylær funksjon (figur 2B). Strenganalyser av proteiner av signifikant lavere (figur 2C) og høyere (Figur 2D) overflod identifiserte flere interaksjoner og sterke assosiasjoner mellom proteiner.
Figur 1: Vulkanplott som viser proteiner hvis overflod ikke ble signifikant endret (svart), betydelig senket (blå), eller betydelig økt (rød) i syke vs. friske kontrollceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative evalueringer av signifikant dysregulerte treff identifisert av PANTHER (A, B) og String (C, D) av betydelig lavere eller høyere overflod proteiner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Totalt antall peptider | Totalt identifisert | ≥ 2 unike peptider | Kvantifiserte proteiner | Signifikant endrede proteiner | |
| Lav | Høy | ||||
| 39653 | 7211 | 4457 | 3829 | 296 | 108 |
Tabell 1: Representativ tabell over kvantifiserte proteiner per datasettanalyse.
Discussion
For å kunne forberede prøver for proteomisk analyse ved hjelp av TMT-baserte isotopmerkingsmetoder, er det avgjørende å utføre proteinekstraksjoner svært nøye ved 4 °C og bruke en lysisbuffer som inneholder en proteasehemmer cocktail24,25. Proteasehemmercocktailen er en avgjørende reagens for å unngå uventet proteinnedbrytning under proteinfordøyelse. En viktig forskjell mellom vår protokoll og den nåværende som tilbys av leverandøren er at vi sterkt anbefaler bruk av CHAPS lysis buffer basert på vår erfaring med pattedyr celler og vev. Vi foreslår også å bruke en metanol / kloroform protein nedbør tilnærming for både celle pellets og vev.
Ideelt sett utføres proteinekstraksjon, måling, reduksjon/alkylerende reagensbehandlinger og metanol/kloroformnedbøye alle på samme dag. Etter denne anbefalingen vil resultere i mer nøyaktige proteinkonsentrasjoner for etterfølgende merking. Protein nedbør trinn er viktig for fjerning av reagenser som vil forstyrre tandem massespektrometri. Inkludert nedbør trinn betydelig forbedrer oppløsningen av TMT26. I sum er de store fordelene med vår TMT-protokoll høy merkingeffektivitet for ulike typer prøver, reproduserbarhet og pålitelige data som er innhentet.
Som multiplex natur denne TMT untargeted proteomics strategi fortsetter å utvide, det vil gradvis forbedre evnen til forskere over et bredt spekter av felt for å gjøre nye funn. Spesielt innen biomedisinsk felt har vi og andre funnet denne teknologien stadig mer informativ i studier som utforsker nye virkningsmekanismer ved sykdom og relative konsekvenser av ulike terapeutiske midler. Av alle disse grunnene utfyller denne kraftige teknologien repertoaret til andre OMICS-tilnærminger som brukes i moderne forskningsstudier og gir viktig informasjon som kan veilede videre terapeutisk utvikling.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne UF-ICBR-proteomikkanlegget for deres behandling av våre prøver. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
| 50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
| Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
| Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
| Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
| Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
| BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
| CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
| Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
| Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
| HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
| Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
| Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
| Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
| Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
| Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
| Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
| Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
| TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
| TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
| Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |
References
- Graves, P. R., Haystead, T. A. Molecular biologist's guide to proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS). Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Rabilloud, T., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial. Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Anderson, N. G., Anderson, N. L. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).
- Haynes, P. A., Yates, J. R. Proteome profiling-pitfalls and progress. Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).
- Zhang, G., Neubert, T. A. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation. Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).
- Wang, X., et al. SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions. Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
- Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics. Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).
- Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3. Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).
- Zecha, J., et al. TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
- Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics. Molecules. 24 (4), E701 (2019).
- Suzuki-Hatano, S., et al. AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 13, 167-179 (2019).
- Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).
- Perumal, N., et al. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants. Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).
- Plaxton, W. C. Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes. Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).
- Ryan, B. J., Henehan, G. T. Protein Chromatography: Methods and Protocols. Walls, D., Loughran, S. T. , Springer. New York. 53-69 (2017).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
