Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה לייצור פרוסות כבד בר קיימא לחתוך מפני עכברים. Vivo דגימות רקמות לשעבר יכול להישמר תחת רקמת המעבדה התנאים התרבות במשך ימים מרובים, מתן מודל גמיש לבחון פתוביולוגיה בכבד.
Abstract
הבנת המנגנונים של פגיעה בכבד, פיברוזיס בצהבת, ושחמת כי התחתון מחלות כבד כרונית (כלומר, נגיפי הפטיטיס, מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים, מחלת כבד מטבולית, סרטן הכבד) דורש מניפולציה ניסויית של מודלים של בעלי חיים. ובתרבויות של תאי מבחנה שתי טכניקות יש מגבלות, כגון הדרישה של מספר גדול של בעלי חיים עבור מניפולציה vivo. עם זאת, בתרבויות מחוץ לגופית לא לשכפל את המבנה ואת התפקוד של הסביבה הכבד הרב-תאיים. השימוש של פרוסות הכבד בדיוק לחתוך היא טכניקה שבה פרוסות אחיד של כבד העכבר הקיימא נשמרים בתרבות רקמת המעבדה לטיפול ניסיוני. טכניקה זו ממלאת את הנישה הניסיונית הקיימת בין לימודי בעלי חיים ובשיטות תרבות של תאי מבחנה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה פשוטה ואמינה לבידוד והתרבות לחתוך בדיוק פרוסות הכבד מעכברים. כיישום של טכניקה זו, פרוסות vivo הכבד לשעבר מטופלים עם חומצות מרה כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי ובסופו של דבר להעריך את המנגנונים של פיברוגנזה הכבד.
Introduction
הפתוגנזה של רוב מחלות הכבד כרונית (כלומר, דלקת הכבד ויראלי, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים, פגיעה בכבד כולסטטי וסרטן הכבד) כרוך אינטראקציות מורכבות בין סוגים שונים של תאי הכבד הכונן הדלקת, פיברוגנזה, סרטן התפתחות1,2. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס המחלות הכרוניות המבוססות על הכבד, יש לחקור את האינטראקציות בין סוגי תאי הכבד המרובים. בעוד קווי הכבד מרובים (ולאחרונה, אורגנואידים) יכול להיות תרבותי בתוך מבחנה, מודלים אלה לא לחקות במדויק את המבנה המורכב, פונקציה, ומגוון הסלולר של מיקרוסביבה הכבד3. יתרה מזאת, תאי כבד מתורבתים (בפרט, קווי תאים שעברו טרנספורמציה) עלולים לסטות מהביולוגיה המקורית של המקור. מודלים בעלי חיים משמשים ניסויים כדי לחקור את האינטראקציות בין סוגי תאי הכבד המרובים. עם זאת, הם עשויים להיות מופחתים באופן משמעותי בהיקף של מניפולציה ניסויית, בשל השפעות משמעותיות מחוץ ליעד באיברים הכבד ביותר (למשל, כאשר בדיקת therapeutics פוטנציאלי).
השימוש המדויק בפרוסות הכבד (pcls) בתרבות הרקמה היא טכניקה ניסיונית המשמשת לראשונה מטבוליזם של תרופות ומחקרים רעילות, והוא כולל את החיתוך של קיימא, בדיקת דק (סביב 100 לערך 250 יקרומטר עבה) הכבד פרוסות. זה מתיר את מניפולציה ניסיוני ישיר של רקמת הכבד לשעבר vivo4. הטכניקה מגשרת על פער ניסיוני בין מחקרי בעלי חיים vivo ובשיטות תרבות של תאי מבחנה, התגברות על החסרונות הרבים של שתי השיטות (כלומר, מגבלות מעשיות על מגוון הניסויים שניתן לבצע בחיות שלמות, כמו גם אובדן מבנה/תפקוד ומגוון הסלולר עם שיטות התרבות של תאי מבחנה).
יתר על כן, PCLS מגביר במידה רבה את הקיבולת הניסיונית בהשוואה למחקרים בעלי חיים שלמים. כמו עכבר אחד יכול לייצר יותר מ 48 פרוסות הכבד, זה גם מקל על השימוש הן בשליטה והן קבוצות טיפול מאותו כבד. בנוסף, הטכניקה מפרידה פיזית את רקמת הכבד ממערכות איברים אחרים; לכן, הוא מסיר תופעות פוטנציאליות מחוץ ליעד שיכולות להתרחש בחיות שלמות בעת בדיקת ההשפעות של גירוי אקסוגני.
בפרוטוקול זה, PCLS מופקים באמצעות הרטט עם להב רוטט. מחקרים אחרים השתמשו בהצלחה Krumdieck רקמת רקמה, כפי שמתואר Olinga ו שוסטר5. בתוך הרטט, רטט לרוחב של הלהב מונע קריעה של הרקמה האולטרה דקה הנגרמת על ידי מתח הטיה, כמו להב נדחף לתוך הרקמה. הן מבצעה הרטט ו Krumdieck רקמות לעבוד ביעילות ללא הטבעה מבנית של רקמת הכבד, אשר מייעל את הליך הפרוסות. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ליצור PCLS מכבדים חולים, כולל אלה מדגמי העכבר פיברוזיס/שחמת6 ו steatosis הכבד7.
בנוסף להדגים את הטכניקות הדרושות לתרבות ההכנה והרקמה של pcls, דו ח זה גם בוחן את הכדאיות של רקמות אלה vivo ex על ידי מדידת אדנוזין טריפוספט (ATP) רמות בדיקת היסטולוגיה רקמות להעריך נמק פיברוזיס. כהליך ניסיוני מייצג, pcls מטופלים עם ריכוזי pathophysiological של שלוש חומצות מרה שונות (גליקולפילית, טאורוכופילית, חומצות כולית) כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי. בהקשר של פציעה בכבד כיס המרה, חומצה taurocholic בפרט הוכח להיות גדל באופן משמעותי הן סרום ומרה של ילדים עם סיסטיק פיברוזיס הקשורים בכבד המחלה8.
תאים מחולל הכבד גם טופלו בחלל החוץ עם חומצה taurocholic לדמות את רמות החומצה הגבוהות taurocholic נצפתה בחולים, טיפול זה גרם התפשטות מוגברת ובידול של תאים מחולל הכבד לקראת המרה (המרה) פנוטיפ9. לאחר מכן, PCLS טופלו לשעבר vivo עם רמות גבוהות של חומצה taurocholic, ומוגברת סמנים המרה הלוציט נצפו. זה תומך בהתבוננות מחוץ לגופית כי חומצה taurocholic מניע התפשטות המרה ו/או בידול בהקשר של רפואת ילדים סיסטיק פיברוזיס הקשורים מחלת כבד9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי החיות בוצעו בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ולשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות במכון למחקר רפואי ע י מכון ברגפר, באישור ועדת האתיקה של בעלי החיים. זכר C57BL/6 עכברים (15 עד 20 שבועות) התקבלו ממרכז משאבי בעלי חיים, WA, אוסטרליה.
הערה: כל הפתרונות, המדיה, המכשירים, החומרה והצינורות הקשורים לדגימות חייבות להיות מעקרים או מעוקרים באופן יסודי עם תמיסת אתנול 70% ומטופלת באמצעות טכניקות סטריליות כדי למזער את הסיכון לזיהום תרבותי.
1. ההתקנה של התאמת הרטט
- הכנת פתרון מאגר קרבס סטרילי-Henseleit עם 2 g/L גלוקוז (טבלת חומרים). בדוק כי ה-pH של המאגר הוא 7.4. אם ה-pH הוא גבוה יותר, לרוויה המאגר עם קרבוגן (95% O2 + 5% CO2) או מודונט בתוך 5% co2 חממה התרבות רקמה כדי לתקן את המערכת ביקרבונט אגירה. להכניס למקרר את הפתרון האטום של מאגר סטרילי ב-4 ° c.
- הכנס את להב הרטט לתוך הזרוע החותכת. ודא כי הלהב הוא קבוע היטב את הזרוע חיתוך, כמו תנודות יכול לגרום ללהב לבוא רופף.
- חטא את הלהב ואת הזרוע חיתוך עם פתרון אתנול 70%.
התראה: הימנע ממגע עם הלהב. - לחטא את מגש מאגר עם פתרון אתנול 70% ולנגב אותו עם רקמה סטרילית.
- הכנס את מגש המאגר לתוך הרטט והדק את מנגנון ההרכבה.
- הגדר את הזרוע החותכת לגובה המרבי הזמין.
- הגדר את זווית הלהב ל-10 ° מתחת לאופקי, משופע מטה למדגם. ודא שזווית הלהב תוקנה באופן הדוק.
הערה: זווית הלהב האופטימלית עשויה להיות שונה בהתאם למודל הרטט ולמאפייני הרקמה. - לחטא את מחזיק הדגימה בתמיסה. של 70% אתנול
- חברו את המים הצוננים לצידנית התרמואלקטריים של פלטייר הממוקם מתחת למגש המאגר.
הערה: חלק מדגמי הרטט משתמשים באמבט קרח לצינון במקום. - התקן את צינור המים לניקוז. והפעל את המים הגדר את הצידנית ל-4 ° c. הפעל מים מצוננים בקצב של > 400 מ ל/דקה.
- למלא את מגש המאגר כמעט למעלה עם סטרילי קר מאגר קרבס-Henseleit (עם גלוקוז 2 g/L). השאר פתרון מאגר נוסף של Krebs-Henseleit על הקרח.
2. הסרת כבד והכנה
- חטא או חטא את כל כלי הניתוח כולל מלקחיים מעוקלים, מלקחיים שטוחים מרובע טיפ, מלקחיים, מלחציים כירורגיים, ומספריים באמצעות אוטוקלינג.
- לפני הסרת הכבד, עכברים מורדם עמוקות באמצעות הזרקה התוך הצפק של 100 mg/ק"ג ו 12.5 מ"ג/ק"ג xylazine.
הערה: ניתן להשתמש בהרדמה אחרת, או שעכברים יכולים להיות מורדמים על ידי שיתוף2 חנק צוואר הרחם אם הכבד מוסר במהירות כדי למנוע נזק בהשפעת היפוקסיה. - חיטוי משטחי העור על עכברים על ידי הרטבה עם 70% אתנול פתרון. עכברים מאובטחים על גבם. עם כל הגפיים המוצמדים ללוח מבתר
- להפוך את קו האמצע אנכית חתך לתוך העור מהבסיס של חלל הבטן כדי ממש מעל הסרעפת.
הערה: חתכים לעבר הגפיים עשויים להקל על הנסיגה של העור. - משוך את העור לאחור תוך חיתוך כל רקמת החיבור בין העור לבין חלל הבטן. למנוע העברת שיער לחלל הבטן ככל האפשר. להצמיד או להדק את העור הרחק מחלל הבטן.
- באמצעות מלקחיים ומספריים נקיים, פתח את חלל הבטן ואת חלל החזה התחתון.
- הסרת הכבד במהירות מבלי לפגוע באונות
- באמצעות כלים בוטה (למשל, מלקחיים שטוח קצה מרובע), מדריך את האונות בכבד העליון כלפי מטה לכיוון הבטן. חותכים את רקמת החיבור סביב האונות בכבד העליון באמצעות מספריים.
- מדריך את האונות הכבד כלפי מעלה לכיוון הסרעפת. להחזיק את צרור כלי הדם המרכזי של הכבד עם מלקחיים.
הערה: הוא לא ישפיע על ההליך אם צרור כלי הדם המרכזי ניזוק. - משוך את צרור כלי הדם המרכזי הרחק מהעכבר וחותכים את רקמת החיבור הנותרת, כלי הדם, וכו ' כדי להסיר את הכבד. לטפל לא 1) לפגוע באונות הכבד 2) חותכים למערכת העיכול, כמו זה עשוי לזהם את הכבד עם מיקרואורגניזמים.
- מניחים את הכבד הוסר לתוך סטרילי 10 ס מ רקמת העור מאכל חצי מלא עם הקרח קר קרבס-Henseleit מאגר פתרון. באמצעות כלי קהה להנחות את האונות, לחתוך את מרכז הכבד כדי לחלק אותו לאונות נפרדות.
- בחר אונה אחת הכבד (להשתמש הגדול ביותר הראשון), ולמקם אותו בצד שטוח למטה אל הצלחת חדש סטרילי 10 ס מ. לשמור את כל האונות הכבד האחרים בצלחת של הפתרון באגירה Krebs-Henseleit מאוחסן בקרח לשימוש הבאים.
- קיצוץ סביב 10% של החומר מהקצה הגבוה ביותר של אונה הכבד תוך שכיבה שטוח.
הערה: זמירה חשוב, כמו קצה הרקמה הזאת יהיה ליצור קשר עם להב החיתוך הראשון; לכן, קצה רקמת כי הוא בניצב יחסית להב חיתוך ימנע דחיסת רקמות שיכול להתרחש בגלל זוויות שטחיות באונות הכבד נימולים. - חתוך את שלושת הקצוות האחרים של הרקמה.
הערה: פעולה זו מסירה חלק מהקפסולה של גליסון הסיבי ותהפוך את הפרדת הרקמה לקלה יותר. - הרכבת את אונה הכבד על מחזיק הדגימה
- מניחים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילי (דבק-דביק או רפואי/וטרינרי דבק ציאנואקרילי) על מחזיק הדגימה כלפי החזית, בגודל קצת יותר גדול מאשר אונה הכבד גזוז.
הערה: בדוק שדבק הציאנואקריאקרילי אינו כולל תוספים שאינם מוספים לציאנואקריל. - בעדינות להרים את האונה הכבד עם מלקחיים סטרילי באמצעות פינה הרחק את חוד החיתוך, ואז טפיחה יבש כל מאגר שיורית מהצד השטוח של אונה הכבד באמצעות חומר סופג סטרילי.
- מניחים את הצד השטוח הגדול של אונה הכבד על טלאי דבק כציאנואקרילי עם הקצה הגדול ביותר הפונה לכיוון החזית. הרשו לו לרפא באוויר במשך 1-2 דקות.
הערה: דבקים ציאנואקריל מרפאים במהירות (~ 2 דקות) בתגובה ללחות שיורית וחלבונים ברקמות, והם יחברו בחוזקה את הרקמה למחזיק הדגימה.
- מניחים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילי (דבק-דביק או רפואי/וטרינרי דבק ציאנואקרילי) על מחזיק הדגימה כלפי החזית, בגודל קצת יותר גדול מאשר אונה הכבד גזוז.
3. ייצור פרוסות כבד
- מניחים את מחזיק הדגימה עם אונה של הכבד המצורפת לתוך מגש מאגר הרטט. ודא שאונה הכבד מכוסה במלואו במאגר.
הערה: במידת הצורך, מעלה את רמת הפתרון של מאגר קרבס-Henseleit הקרה. אם רמת המאגר מסתירה את תהליך החיתוך, הגדל או הקטן את הרמה. - . הגדר את מהירות החיתוך
הערה: ייתכן שיהיה צורך באופן אמפירי בהתאם לדגם הרטט ולמאפייני הלהב. כמדריך התחלתי, להשתמש במהירות של 57 Hz/3420 rpm. מהירות הרטט ניתן למדוד באמצעות יישום מנתח הספקטרום אודיו על הטלפון החכם. - הנמך את להב החיתוך עד שהוא ממוקם ממש מעל אונה הכבד באמצעות חיוג גובה. תריץ את הזרוע החותכת. מעל הדגימה
- החזר את הלהב בחזרה. בעזרת ידית הקראנק ברוורס הפעילו את הויברציות. תוך כדי החזרת הלהב לאחר שהלהב חזר ואינו מעל המדגם, הנמך את גובה הלהב על-ידי 250 μm.
- חזרו על תהליך החיתוך עד להסרת החלק העליון של הרקמה. השמט את הפרוסות הראשונות, מכיוון שאלה יכילו את הקפסולה של גליסון ולכן אינן מכילות רקמת כבד תפקודית במיוחד בהשוואה לפרוסות אחרות.
- כדי לחתוך פרוסות כבד, התקדם לאט את הלהב הרוטט לתוך הרקמה על ידי הפעלת הידית. השתמש מכחול קטן (חיטוי עם 70% אתנול פתרון) כדי להנחות בעדינות את הרקמה במהלך תהליך החיתוך.
- השתמש במכחול כדי להרים את פרוסות הרקמה לחתוך ולמקם את פרוסת הרקמה לתוך צינור סטרילי של מאגר קרבס-Henseleit קר-קרח. כשלא בשימוש, שמרו על השפופרת על הקרח בין הפרוסות.
הערה: לעיתים, הרקמה מתבעת בתהליך החיתוך, אך לרוב המטרות הרקמה עדיין שימושית. - חזור על תהליך החיתוך עד לבסיס של אונה הכבד הגיע. להיפטר כל פרוסות הכבד שניתן לראות דבק נרפא.
הערה: הדבק הנרפא נראה כאזורים לבנים על פרוסות הרקמה. האונה של הכבד אופייני רק יש עובי שמיש של סביב 2 מ"מ. לכן, רק סביב 8 250 יקרומטר פרוסות הכבד מיוצרים מכל אונה. - חותכים את פרוסות הרקמה עד לקרבת הדבק הארוך. . אל תחתוך את הדבק
- חזור על התהליך כולו עם אונות אחרות הכבד עד המספר הנדרש של פרוסות רקמות מתקבל.
- כדי לנקות את הדבק והרקמה הרפאקריניקה מבעל הדגימה, השתמשו בלהב כדי לגרד את הדבק/הרקמה הנרפאים מהתערובת, או לרכך ולנקות את התערובת עם אצטון או דימתיל סולפוקסיד.
4. תרבית רקמה
הערה: יש לבצע את כל העבודות של תרבות הרקמה במכסה זרימה סטרילית.
- בתרבות רקמה למינטת זרימה כיפה, פיפטה 1 מ ל של ויליאם E בינונית המכילה 2.0 g/L גלוקוז, 10% סרום של שור עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין תוסף, 100 U/mL פניצילין, ו 100 μg/mL סטרפטומיצין לתוך 12 ובכן לוחות תרבות רקמה.
הערה: ניתן גם להוסיף אנטיביוטיקה וסוכני פטרת אחרים. מחקרים מסוימים השתמשו תוספים במדיום דגירה הרקמה (כלומר, דקסמטסון ואינסולין10), אבל אלה יכולים להפריע איתות התא. - מניחים את הצינור המכיל פרוסות כבד מקרח לתוך המכסה של תרבות הרקמה. כדי להסיר את פרוסות הרקמה, בעדינות מערבולת את התערובת בעדינות עצה לתוך מאכל 10 ס מ סטרילי בזמן מתערבל.
- באמצעות מלקחיים חד-שנתייםואזמל, חותכים את פרוסות הרקמה למידות אחיד (כגון 15 מ"מ 2).
הערה: שלב זה מבוצע כדי להבטיח שטח משטח עקבי. בגלל האונות בכבד העכבר שונים באופן משמעותי בגודל וכמה פרוסות רקמה יקרעו, זה יפיק מגוון של PCLS עם משטח שונים באזורים. הגדלים האחרונים של שטח ה-PCLS תלויים בכמות החומר הדרושה ביישומי הניתוח הבאים ובמספר הפעולות הדרושות. חיתוך PCLS גדול לחתיכות מרובות קטן יותר באותו גודל משוער לאפשר מספר גדל ומוגבר של משכפל ניסיוני. - באמצעות מלקחיים סטריליים או מכחול קטן, להעביר את פרוסות רקמה לחתוך לבארות של 12 צלחת לוחית המכילה 1 מ ל של בינוני.
הערה: דאג לאשר את העקביות של עובי וצורה של פרוסות רקמה. מקטעים הכהים יותר מהממוצע מצביעים על עובי הרקמה גדול יותר וצריך להיפטר מהם. פרוסות קלות יותר מציעות נוכחות של דבק ציאנואקרילי מרפא וצורך להיפטר ממנו. - מודטה את פרוסות הכבד ב 37 ° צ' ו 5% CO2 תחת 95% לחות.
הערה: קבוצות אחרות השתמשו בשיטות כדי לשפר את אספקת החמצן ל-pcls, אשר מופיעים כדי להאריך את זמן הישרדות הרקמה6,10,11,12,13 (ראהמקטעהדיון). - ביום שלמחרת, שנו את אמצעי התרבות באמצעות פיפטה ידני (במקום יניקה) כדי למנוע אובדן רקמות באמצעות שגיאות יניקה. לאחר מכן, שנה את המדיום ב-PCLS מדי יום. ה-PCLS מוכנים כעת לשימוש ניסיוני.
5. לדוגמה יישום של PCLS
- ב 16 h לאחר הדור, לטפל pcls עם שלוש חומצות מרה שונות: חומצה גליכופילית (gca), חומצה taurocholic (tca), וחומצה כולית (CA) (כמו מלחי נתרן, הכל בריכוז של 150 μm) עבור 2 ימים.
- לאחר 2 ימים של טיפול בחומצת מרה, חלץ mRNA על-ידי הצבת פרוסות רקמה במאגר לפירוק הקרח הקר של RNA והומוגון במהירות באמצעות חרוזים עם הומוגניצר חרוז (טבלת חומרים).
- לטהר את ה-RNA באמצעות ערכת בידוד RNA (טבלת חומרים) וליצור cdna מתוך rna מטוהרים.
- ביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותית (טבלת חומרים) באמצעות צבעי יסוד ספציפיים (שולחן 1) על cdna כדי לבחון את הביטוי הגנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע את הכדאיות התאית של PCLS לאורך זמן, רמות ATP של רקמות נמדדו. רמות ATP הן יחסיות בדרך כלל לכדאיות. PCLS (סביב 15 מ"מ2 באזור) היו תרבותיים במדיום E של ויליאם רגיל עם 10% fbs, ואז בנקודות זמן ספציפיות, פרוסות הכבד הוסרו מן התרבות רקמה הומוגניים עם ATP ו חלבון (עבור נורמליזציה) ריכוזי (טבלת חומרים) נמדד (איור 1א). בשביל ביוכימיים אומר כך, הנורמליזציה חשובה, מאחר שפרוסות הכבד החתוכים אינן זהות בהכרח בממדים. רמות ATP (יחסית לחלבון) דוכאו מיד לאחר בידוד ואחרי 1 h (איור 1א), מציע לחץ מטבולית לטווח קצר מהליכי הצינון והגזירה. עם זאת, רמות ATP ששוחזרו על ידי 3 h. ATP נותרו מוגבה עד 5 ימים של תרבות רקמות, המציין לא ירידה משמעותית בכדאיות. המטאוקסילין והאאוזין (H & E) כתמים של פרוסות הכבד הראו כי נמק מוגבל רקמות (מאופיין הפלאומורפיזם גרעינית) התרחשה בתרבות מסביבות ימים 2 ו-3. רמות נמק ברקמות התקדמו למצב חמור ביום 5 (איור 1ב). מומלץ להשתמש במודל הרקמה הניסיוני הזה למשך עד 3 ימים בהתחשב בנתונים מורפולוגיים.
PCLS גם הציג הצטברות קולגן הגדלת בזמן התרבות מאוחר יותר, כפי שמוצג על ידי עיבוי של Picro-סיריוס מוכתם סיבי קולגן ביום 5 (איור 2). עיבוי זה של סיבי קולגן מציע כי תהליכים הפיברוגניים ספונטנית פעילים PCLS המתקבלים באמצעות שיטה זו. תהליך זה מופיע ללא תלות מתודולוגיה לבידוד PCLS עם התעבות של סיבי קולגן6 וביטוי גנים profibrogenic14 המתרחשים הן הרטט Krumdieck ers רקמות, בהתאמה, לאורך זמן. הפיתוח של התהליכים הפיברוגניים הספונטניים הללו צריך להילקח בחשבון בעת פענוח ביולוגיה של PCLS, במיוחד עם ניסויים הקשורים לתהליכים פיברוטיים.
בעבר הצגנו את האינדוקציה המשמעותית של הקונאנגיוציט הספציפי גנים 43 (Cx43) והפרשה של glutamyl tranptidase (Ggt1) חלבון על ידי TCA ב pcls9. הביטוי של גנים ספציפיים המרה ביחס לבקרת משק הבית (גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז [שוטפת] ו-היפוקססיאת פוספורטברואז 1 [Hprt1]) ב pcls שטופלו tca, gca, או CA נבדקו על ידי qpcr באמצעות התחל הספציפי. בהתאם לדוח הקודם, השראה משמעותית בביטוי המרה של גנים מיוחדים של החקולציט 19 (CK19; איור 3א) וקונשין 43 (Cx43; איור 3ב) נצפו על ידי שני הצדדים ו-tca. Ggt1 ביטוי הוגדלה על-ידי שתי חומצות מרה; למרות שאין זה מגיע למשמעות סטטיסטית, אולי עקב וריאציה ניסיונית (איור 3ג). הביטוי של CA לא הושפע על ידי חומצה מרה כלשהי. אינדוקציה של גנים ספציפיים של הצ'ולה מרמז כי gca עשוי גם להיות מעורב בפגיעה בכבד כולסטטי, כפי שדווח בעבר על tca8,9.
איור 1: הכדאיות ברקמה של פרוסות כבד מדוייקות (PCLS). (א) ה-ATP ורמות החלבון ב-pcls נמדדו מיד (T + 0) ובשעה 1, 3 h, 6 h ו-1-5 ימים לאחר בידוד. (ב) לבחון את מורפולוגיה התא, pcls היו קבועים, פרפין-מוטבע, מנות, ו מוכתם עם H & E מיד (יום 0) ו ב 1, 2, ו 5 ימים לאחר בידוד. מבחן קרוקל-ווליס עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן בוצע ביחס ל-T + 0. כל הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM (n = 2 לשלושה עכברים) עם * p < 0.05. פסי הסרגל מייצגים 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכת התצהיר של קולגן ב-PCLS. PCLS היו קבועים, פרפין-מוטבע, מנות, ו מוכתם עם Picro-סיריוס אדום כדי להמחיש סיבי קולגן בימים 0, 1, 2, ו 5 לאחר בידוד. פסי הסרגל מייצגים 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חומצות מרה לגרום המרה ביטוי גנטי ספציפי. ב 16 h לאחר בידוד, בינוני על pcls השתנה, ו בינוני חדש נוספה יחד עם 150 μm גליכופילית (gca), taurocholic (tca), או כולית (CA) חומצות (נתרן מלחי). PCLS נקצרו לאחר יומיים, ואת הביטוי של ציטוקרטין 19 (CK19; A), קונשין 43 (Cx43; ב), ו-γ-glutamyl tranptidase 1 (Ggt1; ג) נבדק ביחס לממוצע הגיאומטרי של הHprt1. בדיקת ההשוואות המרובות של דנטו בוצעה ביחס לפרוסות רקמת בקרה לא מטופלות (n = 15). כל הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM (n = 4 עכברים, פרוסות מטריפליאט; * p < 0.05, * * p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. שולחן 1: התחל בלוח הראשון
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול ממחיש את היישום של מורטין PCLS בידוד ותרבות רקמות, ואת ההליכים נועדו להעריך הן הכדאיות ואת כלי השירות, כמו גם לבחון את ההשפעות של מגשרים אקסוגני של הכבד ביולוגית באמצעות assays היסטולוגיה הביוכימי, ו qPCR. השירות הניסיוני של התרבות רקמות pcls במכרסמים ובבני אדם כבר הפגינו במגוון רחב של יישומים, כולל חקירות ניסיוני בתוך מיקרוארנה של המחלה15/RNA9/חלבון ביטוי16, חילוף החומרים17, זיהום נגיפי הדינמיקה10,18, זיהום איתות19, הפלישה הגידול12, לימודי רעילות4,13,15,20 מחקרים21, ביולוגיה של התא14, ולימודי הפרשה9.
בעוד שרמות ATP מציינות את הכדאיות התאית ב-PCLS עד 5 ימים בתרבות, H & E כתמים מראים כי נמק חמור התרחש 5 ימים בתרבות. הגורם העיקרי שנראה להגביל את הכדאיות של PCLS הוא זמינות החמצן6,11. מספר מחקרים כללו את זמינות החמצן המשופרת וכתוצאה מכך הגבירו את זמן הכדאיות של PCLS בתרבות הרקמה. שיטות המשמשות להגברת זמינות החמצן כוללות את הדגירה של הרקמה באווירה עשירה בחמצן10,11, שימוש במנשא החמצן perluorodecאלין12, לנענע/לגלגל את התרבות במהלך הדגירה6,10,13, ולוחיות התרבות של רקמות שנועדו למקסם את החמצן6.
לאחרונה, מערכת חדשנית האוויר נוזלי ממשק רקמת המערכת תוארה עם שירות פונקציונלי הצהיר במשך יותר מ -7 ימים בתרבות14. פרוטוקול זה משתמש בחמצן אטמוספירי. בחממה נורמלית לתרבות הרקמה השיטה מאפשרת ל-PCLS להיות נגיש למעבדות שאין להן מומחיות גבוהה, ציוד מותאם אישית כדי לשפר בבטחה את אספקת החמצן. עם זאת, אם שיטות כאלה כדי לשפר את אספקת החמצן זמינים, הם עשויים לשפר את הכדאיות לטווח ארוך PCLS בתרבות.
הצטברות של קולגן ב-PCLS לאחר יום 3 בתרבות מציע כי תהליכים הפיברוגניים ספונטנית פעילים בתוך המודל הזה. פיברוזיס ספונטנית נצפתה גם קודם לכן ב-pcls6,14,22,23,24 והוא אולי מתווכת על-ידי דפוסי מולקולריים הקשורים נזק (damps) שוחרר על ידי תהליך הגזירה או נמק רקמות. Damps לפעול כמו מולקולות איתות כי לאחר מכן הפעל pro-פיברוטיק שבילים איתות25,26. יתר על כן, פיברוזיס ספונטנית ב-PCLS יכול להיות מתווכת על ידי נוגדנים שוחרר מן ההפעלה של תאים stellate ו/או תאים מקופלת (כלומר, שינוי גורם הצמיחה ביתא [TGF-β]). בהקשר זה, מאמר שנערך לאחרונה על ידי Bigaeva ואח '24 מציע כי פיברוזיס ספונטנית ב-pcls הוא חלק בתיווך על ידי tgf-β איתות, כמו דגירה של pcls עם tgf-β מעכב Galunisertib מעכבות גנים ביטוי שינויים הקשורים פיברוזיס הכבד ספונטנית. מנגנון אפשרי נוסף הוא כי הליך הפרוסות בתחילה גורם הפצת תאים מסלולים איתות וכניסה של hepatocytes לתוך מחזור התא; עם זאת, מנגנון זה נכשל ותוצאות מעצר מחזור התא בשלב באמצע G127. מעצר מחזור התא משויך פיברוזיס הכבד ולא התחדשות הכבד28.
בהליך ניסיוני הנציג, PCLS מטופלים עם שלוש חומצות מרה שונות (GCA, TCA, ו-CA) עבור 2 ימים כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי. שניים של חומצות מרה (GCA ו-TCA) לגרום ביטוי משמעותי של CK19 ו Cx43, אשר הם גנים הקשורים בתפקוד הכולאנגציט. זה מרמז על התרחבות או הבחנה של תאים לקראת שושלת המרה באמצעות PCLS מטופלים עם חומצות מרה אלה. הדבר מתאים לעבודה הקודמת שלנו, המציגה אפקט דומה באמצעות TCA9 ב-pcls. כמו-כן, היא מתאימה גם לתצפיות vivo המציגות האכלה בטאורוקולאט לחולדות מגדילה את מספרי המרה29. הטיפול של פרוסות רקמת הכבד עם חומצות מרה מדמה כולאוסטזיס הכבד, והוא מעריך כי העלייה בביטוי של גנים הקשורים לפונקציה המרה הוא ניסיון על ידי רקמת הכבד כדי ליצור נוסף ductules המרה כדי להגדיל את הפרשת המרה. בהינתן האינדוקציה הספציפית של גנים אלה מופק על ידי חומצות מרה מצומת (GCA ו TCA) אבל לא המצומים CA, הוא חשד כי ההשפעות הללו מתווכת על-ידי הקולטן ספיגוסינוס-1-פוספט משני, קולטן משטח התא עם הפעלה מועדף על ידי חומצות מרה מצומדות30.
מגבלה אחת של מפתח היישום של PCLS היא בודדים שכפול השונות. כיוון שהכבד אינו הומוגנית ויש שונות בייצור, פרוסות הכבד נוטות להיות ביולוגיות גדולות יותר מניסויים בתרבות התא. במחקרים ניסיוניים עם מספר משתנים, כגון הליך הנציג המתואר לעיל, הדבר מתגבר על ידי שימוש במספר גדל של שכפול. עם זאת, הדבר עשוי להפוך לסוגיה עבור לימודי הקרנה גדולים יותר. לסיכום, הפרוטוקול המתואר הוא שיטה פשוטה ואמינה כדי ללמוד היבטים של הכבד פתוביולוגיה לשעבר vivo, המחייב ציוד מיוחד קטן למעט עבור הרטט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר של המועצה הלאומית לחקר הבריאות והרפואה (NHMRC) של אוסטרליה (גרנט לא. APP1048740 ו-APP1142394 לG.A.R.; APP1160323 to J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). גרנט Ramm נתמך על ידי מלגת מחקר בכיר מ NHMRC של אוסטרליה (גרנט לא. APP1061332). מנואל פרננדז-רוחו נתמך על ידי התוכנית TALENTO של מדריד, ספרד (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
