Summary
Denne protokol giver en enkel og pålidelig metode til produktion af levedygtige præcision-cut leverskiver fra mus. Ex vivo vævsprøver kan opretholdes under laboratorievæv kultur betingelser for flere dage, hvilket giver en fleksibel model til at undersøge leveren patobiologi.
Abstract
Forståelse af mekanismerne i leverskader, leverfibrose, og skrumpelever, der ligger til grund for kroniske leversygdomme (dvs. viral hepatitis, ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, metabolisk leversygdom, og leverkræft) kræver eksperimentel manipulation af dyremodeller og in vitro-cellekulturer. Begge teknikker har begrænsninger, såsom kravet om et stort antal dyr til in vivo manipulation. In vitro-cellekulturer gengiver dog ikke strukturen og funktionen af det flercellede levermiljø. Brugen af præcision-cut leverskiver er en teknik, hvor ensartede skiver af levedygtige muselever opretholdes i laboratoriet væv kultur for eksperimentel manipulation. Denne teknik indtager en eksperimentel niche, der eksisterer mellem dyreforsøg og in vitro celle kultur metoder. Den præsenterede protokol beskriver en enkel og pålidelig metode til at isolere og kultur præcision-cut leverskiver fra mus. Som en anvendelse af denne teknik, ex vivo leverskiver behandles med galdesyrer til at simulere cholestatisk leverskade og i sidste ende vurdere mekanismerne i hepatisk fibrogenese.
Introduction
Patogenesen af de fleste kroniske leversygdomme (dvs. viral hepatitis, ikke-alkoholiske steatohepatitis, cholestatisk leverskade og leverkræft) indebærer komplekse interaktioner mellem flere forskellige levercelletyper, der driver inflammation, fibrogenesis, og kræft udvikling1,2. For at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse kroniske leverbaserede sygdomme, skal samspillet mellem flere levercelletyper undersøges. Mens flere hepatiske cellelinjer (og for nylig, organoids) kan dyrkes in vitro, disse modeller ikke præcist efterligne den komplekse struktur, funktion, og cellulære mangfoldighed af leveren mikromiljø3. Desuden kan dyrkede leverceller (især transformerede cellelinjer) afvige fra deres oprindelige kildebiologi. Dyremodeller anvendes eksperimentelt til at undersøge samspillet mellem flere levercelletyper. De kan dog blive betydeligt reduceret i mulighederne for eksperimentel manipulation på grund af betydelige off-target-virkninger i ekstrahepatiske organer (f.eks. ved test af potentielle terapeutiske).
Brugen af præcisionsskårne leverskiver (PCLS) i vævskultur er en eksperimentel teknik, der første gang anvendes i lægemiddelmetabolisme- og toksicitetsundersøgelser, og det indebærer skæring af levedygtige, ultratynde (ca. 100−250 μm tykke) leverskiver. Dette muliggør direkte eksperimentel manipulation af levervæv ex vivo4. Teknikken bygger bro mellem in vivo-dyreforsøg og in vitro-cellekulturmetoder og overvinder mange ulemper ved begge metoder (dvs. praktiske grænser for de forskellige forsøgsforsøg, der kan udføres hos hele dyr samt tab af struktur/funktion og cellulær mangfoldighed med in vitro-cellekulturmetoder).
Desuden øger PCLS forsøgskapaciteten betydeligt sammenlignet med hele dyreforsøg. Som en mus kan producere mere end 48 leverskiver, Dette letter også brugen af både kontrol og behandling grupper fra samme lever. Desuden adskiller teknikken fysisk levervævet fra andre organsystemer; Den fjerner derfor potentielle off-target-effekter, der kan opstå hos hele dyr, når virkningerne af udefrakommende stimuli testes.
I denne protokol genereres PCLS ved hjælp af en vibratome med en sideværts vibrerende klinge. Andre undersøgelser har med succes brugt en Krumdieck væv pålægsmaskine, som beskrevet i Olinga og Schuppan5. I vibratomen forhindrer lateral vibration af klingen at rive det ultratynde væv på grund af forskydningsstress, da klingen skubbes ind i vævet. Både vibratome og Krumdieck væv pålægsmaskine arbejde effektivt uden strukturel indlejring af levervæv, som strømliner udskæring procedure. Denne teknik kan også bruges til at skabe PCLS fra syge lever, herunder dem fra musemodeller af fibrose/ skrumpelever6 og leversteatose7.
Ud over at demonstrere de teknikker, der er nødvendige for fremstilling og vævskultur af PCLS, undersøger denne rapport også levedygtigheden af disse ex vivo-væv ved at måle adenosintrifosfat (ATP) niveauer og undersøge vævhistologi til vurdering af nekrose og fibrose. Som en repræsentativ eksperimentel procedure behandles PCLS med patofysiologiske koncentrationer af tre forskellige galdesyrer (glykocholic, taurocholic og cholic syrer) for at simulere cholestatisk leverskade. I forbindelse med kolestatisk leverskade har især taurocholic syre vist sig at være signifikant forøget i både serum og galde hos børn med cystisk fibroserelateret leversygdom8.
Leverstamceller er også blevet behandlet in vitro med taurocholic syre for at simulere de forhøjede taurocholic syreniveauer observeret hos patienter, og denne behandling forårsagede øget spredning og differentiering af leverstamceller mod en galde (cholangiocyt) fænotype9. Efterfølgende blev PCLS behandlet ex vivo med forhøjede niveauer af taurocholic syre, og øget cholangiocyt markører blev observeret. Dette understøtter in vitro observation, at taurocholic syre drev galdespredning og / eller differentiering i forbindelse med pædiatriske cystisk fibrose-associeret leversygdom9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den australske kode for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål på QIMR Berghofer Medical Research Institute med godkendelse fra instituttets dyreetiske komité. Mandlige C57BL/6 mus (15−20 uger gamle) blev fremstillet fra Animal Resources Centre, WA, Australien.
BEMÆRK: Alle opløsninger, medier, instrumenter, hardware og rør, der kommer i kontakt med prøverne, skal steriliseres eller desinficeres grundigt med en 70 % ethanolopløsning og håndteres ved hjælp af sterile teknikker for at minimere risikoen for dyrkningsforurening.
1. Opsætning af vibratome
- Forbered steril Krebs-Henseleit buffer opløsning med 2 g /L glukose (Tabel af materialer). Kontroller, at bufferens pH-visning er 7,4. Hvis pH-værdien er højere, skal bufferen mættes med carbogen (95 % O2 + 5 % CO2)eller inkuberes inden for en 5% CO 2-vævskulturkuvøs for at korrigere bikarbonatbuffersystemet.2 Den forseglede sterile bufferopløsning opbevares i køleskab ved 4 °C.
- Sæt vibratome-klingen ind i skærearmen. Sørg for, at klingen sidder tæt fast på skærearmen, da vibrationer kan medføre, at klingen løsner sig.
- Desinficere klingen og skærearmen med en 70% ethanolopløsning.
FORSIGTIG: Undgå kontakt med klingen. - Desinficere bufferbakken med en 70% ethanolopløsning og tør den af med et sterilt væv.
- Sæt bufferbakken ind i vibratome og stram monteringsmekanismen.
- Indstil skærearmen til den maksimale tilgængelige højde.
- Indstil klingevinklen til 10° under vandret og skrånende nedad til prøven. Sørg for, at klingevinklen er tæt fastgjort.
BEMÆRK: Den optimale klingevinkel kan variere afhængigt af vibratome-modellen og vævsegenskaberne. - Prøveholderen desinficeres med en 70 % ethanolopløsning.
- Tilslut kølevandet til Peltier stermoelektriske køler, der er placeret under bufferbakken.
BEMÆRK: Nogle vibratome modeller bruger et isbad til køling i stedet. - Fastgør vand-out rør til et afløb og tænde for vandet. Sæt køleren til 4 °C. Tør kølevandet med en hastighed på >400 ml/min.
- Fyld bufferbakken næsten til toppen med steril iskold Krebs-Henseleit buffer (med 2 g/l glukose). Efterlad yderligere Krebs-Henseleit bufferløsning på is.
2. Fjernelse og forberedelse af lever
- Sterilisere eller desinficere alle kirurgiske instrumenter, herunder buede pincet, flade firkantede spids pincet, pincet, kirurgiske klemmer, og saks ved hjælp af autoklavering.
- Før fjernelse af leveren, dybt bedøve mus ved hjælp af en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg ketamin og 12.5 mg/kg xylazine.
BEMÆRK: Der kan anvendes andre bedøvelsesstoffer, eller mus kan2 aflives ved CO 2-kvælning/cervikal dislokation, hvis leveren hurtigt fjernes for at forhindre hypoxi-induceret skade. - Desinficere hudoverflader på mus ved befugtning med en 70% ethanolopløsning. Sikre mus på ryggen med alle ekstremiteter fastgjort til en dissekere bord.
- Lav en lodret midterlinjen snit ind i huden fra bunden af bughulen til lige over mellemgulvet.
BEMÆRK: Indsnit mod ekstremiteterne er lavet for at lette tilbagetrækningen af huden. - Træk huden tilbage, mens du skærer bindevæv mellem huden og bughulen. Forhindre hår fra at blive overført til bughulen så meget som muligt. Fastgør eller fastspænd huden væk fra bughulen.
- Brug rene pincet og saks, åbne bughulen og lavere brysthulen.
- Fjernelse af leveren hurtigt uden at beskadige lapperne
- Brug stumpe værktøjer (f.eks flad firkantede spids pincet), guide den øvre lever lapper nedad mod maven. Skær bindevævet omkring de øvre leverlapper ved hjælp af en saks.
- Før leverlapperne opad mod mellemgulvet. Hold den centrale vaskulære bundt af leveren med pincet.
BEMÆRK: Det vil ikke påvirke proceduren, hvis den centrale vaskulære bundt er beskadiget. - Træk den centrale vaskulære bundt væk fra musen og skær de resterende bindevæv, blodkar, etc. at fjerne leveren. Pas på ikke at 1) beskadige leverlapper og 2) skæres i mave-tarmkanalen, da dette kan forurene leveren med mikroorganismer.
- Placer den fjernede lever i en steril 10 cm vævskulturskål halvt fyldt med iskold Krebs-Henseleit bufferopløsning. Ved hjælp af en stump instrument til at guide lapper, skære sat i midten af leveren til at opdele det i separate lapper.
- Vælg en leverlap (brug den største først), og læg den fladt ned på en ny steril 10 cm skål. Opbevar alle andre leverlapper i skålen af Krebs-Henseleit bufferopløsning, der opbevares på is til senere brug.
- Trim omkring 10% af materialet fra den højeste kant af leverappen, mens liggende fladt.
BEMÆRK: Trimning er vigtig, da denne vævskant vil først kontakte klingen. Derfor vil en vævskant, der er relativt vinkelret på skærebladet, forhindre vævskompression, der kan opstå på grund af lavvandede vinkler i de uslebne leverlapper. - Trim de tre andre vævskanter.
BEMÆRK: Dette fjerner nogle af de fibrøse Glisson kapsel og vil gøre adskillelse af væv skiver lettere. - Montering af leverappen på prøveholderen
- Placer et tyndt lag cyanoacrylatlim (superlim eller medicinsk/veterinær cyanoacrylatlim) på prøveholderen mod forsiden, som er lidt større end den trimmede leverlap.
BEMÆRK: Kontroller, at cyanoacrylatlimen ikke indeholder ikke-cyanoacrylattilsætningsstoffer. - Forsigtigt afhente leveren lap med sterile pincet ved hjælp af et hjørne væk fra skærkanten, derefter dup tørre eventuelle resterende buffer fra den flade side af leveren lap ved hjælp af sterilt absorberende materiale.
- Placer den store flade side af leverappen på cyanoacrylatlimplasteret med den største kant mod forsiden. Lad den hærde i luften i 1−2 min.
BEMÆRK: Cyanoacrylatklæbende klæbemidler hærder hurtigt (~2 min) som reaktion på resterende fugt- og vævsproteiner, og de vil fastfastgøre vævet til prøveholderen.
- Placer et tyndt lag cyanoacrylatlim (superlim eller medicinsk/veterinær cyanoacrylatlim) på prøveholderen mod forsiden, som er lidt større end den trimmede leverlap.
3. Produktion af leverskiver
- Prøveholderen anbringes med den påsatte leverlap i vibratome-bufferbakken. Sørg for, at leverappen er fuldt dækket af buffer.
BEMÆRK: Fyld om nødvendigt niveauet af iskold Krebs-Henseleit-bufferopløsning op. Hvis bufferniveauet tilslører skæreprocessen, skal du øge eller formindske niveauet. - Indstil skærehastigheden.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at bestemme dette empirisk afhængigt af vibratome-modellen og klingens egenskaber. Som udgangspunkt skal du bruge en hastighed på 57 Hz/3.420 omdr./min. Vibratome-hastigheden kan måles ved hjælp af et lydspektrumanalyseprogram på en smartphone. - Sænk klingen, indtil den er placeret lige over leverappen ved hjælp af højdeskiven. Den vibrerende skærearm ledes hen over prøven.
- Sæt klingen tilbage ved hjælp af håndsvinget i bakgear. Aktiver vibrationerne, mens klingen returneres. Når klingen er vendt tilbage og ikke er over prøven, skal klingehøjden sænkes med 250 μm.
- Gentag skæreprocessen, indtil toppen af vævet er fjernet. Kassér de første en eller to skiver, da disse vil indeholde Glissons kapsel og derfor ikke indeholder meget funktionelt levervæv sammenlignet med andre skiver.
- For at skære leverskiver, langsomt skubbe vibrerende klinge ind i vævet ved at dreje håndtaget. Brug en lille pensel (desinficeret med en 70% ethanolopløsning) til forsigtigt at styre vævet under skæreprocessen.
- Brug pensel til at løfte de afskårne væv skiver og placere væv skive i et sterilt rør af iskold Krebs-Henseleit buffer. Når røret ikke er i brug, skal det holdes på is mellem skiverne.
BEMÆRK: Nogle gange, vævet gør rive under skæring proces, men for de fleste formål vævet er stadig brugbar. - Gentag skæreprocessen, indtil bunden af leverappen er nået. Kassér eventuelle leverskiver, der har synlig hærdet lim.
BEMÆRK: Den hærdede lim er synlig som hvide områder på vævsskiverne. En typisk leverlap vil kun have en brugbar tykkelse på omkring 2 mm. Derfor fremstilles der kun ca. otte 250 μm leverskiver af hver lap. - Skær vævskiverne indtil nær cyanoacrylatlimen. Må ikke skæres i limen.
- Gentag hele processen med andre leverlapper, indtil det nødvendige antal vævsskiver er opnået.
- For at rense den hærdede cyanoacrylatlim og væv fra prøveholderen skal du enten bruge en klinge til at skrabe den hærdede lim/vævsblanding af eller blødgøre og rengøre blandingen med acetone eller dimethylsulfoxid.
4. Vævskultur
BEMÆRK: Alt vævskulturarbejde skal udføres i en steril laminarstrømhætte.
- I en vævskultur laminar flow hætte, pipette 1 ml af William's E medium, der indeholder 2,0 g / L glukose, 10% føtal kvæg serum (FBS), 2 mM L-glutamin supplement, 100 U/ml penicillin, og 100 μg/ml streptomycin i 12 brønd væv kultur plader.
BEMÆRK: Andre antibiotika og svampemidler kan også tilsættes. Nogle undersøgelser har brugt tilsætningsstoffer i vævinkubationsmediet (dvs. dexamethason og insulin10),men disse kan forstyrre cellesignalering. - Placer røret indeholder leverskiver fra is i vævskultur hætte. For at fjerne vævsskiverne skal blandingen forsigtigt hvirvles rundt og forsigtigt vippes ind i en steril skål på 10 cm, mens den hvirvler rundt.
- Ved hjælp af sterile spidspincet og en skalpel skæres vævsskiverne i nogenlunde ensartede størrelser (f.eks. 15 mm2).
BEMÆRK: Dette trin udføres for at sikre et ensartet overfladeareal. Fordi muselever lapper er væsentligt forskellige i størrelse og nogle væv skiver vil rive, dette vil producere en række PCLS med varierende overfladeområder. PCLS' endelige overfladearealstørrelser afhænger af, hvor meget materiale der er behov for i efterfølgende analyseapplikationer, og hvor mange replikater der er behov for. Skæring store PCLS i mindre flere stykker af samme omtrentlige størrelse vil medfødt tillade et øget antal eksperimentelle replikater. - Ved hjælp af sterile pincet eller en lille pensel overføres de afskårne vævsskiver til brøndene på en 12 brøndplade, der indeholder 1 ml medium.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at bekræfte konsistensen af tykkelse og form af væv skiver. Sektioner, der er mørkere end gennemsnittet tyder på væv tykkelse er større og skal kasseres. Lettere skiver tyder på tilstedeværelsen af hærdet cyanoacrylat lim og skal kasseres. - Inkuber leverskiverne ved 37 °C og 5% CO2 under 95% luftfugtighed.
BEMÆRK: Andre grupper har anvendt metoder til at forbedre ilttilførsel til PCLS, som synes at forlænge vævoverlevelsestiden6,10,11,12,13 (se diskussionsafsnittet). - Den følgende dag ændres kulturmediet ved hjælp af en manuel pipette (i stedet for at suge) for at forhindre tab af væv gennem sugefejl. Derefter ændre mediet på PCLS dagligt. PCLS er nu klar til eksperimentel brug.
5. Eksempel på anvendelse af PCLS
- Ved 16 h post-generation, behandle PCLS med tre forskellige galdesyrer: glyocholic syre (GCA), taurocholic syre (TCA), og cholsyre (CA) (som natriumsalte, alle i en koncentration på 150 μM) i 2 dage.
- Efter 2 dages galdesyre behandling, udtrække mRNA ved at placere væv skiver i iskold RNA lysis buffer og hurtigt homogenisere ved hjælp af perler med en perle homogenisator (Tabel af materialer).
- Rens RNA ved hjælp af et RNA-isolationssæt (Materialstabel) og opret cDNA fra det rensede RNA.
- Udfør kvantitativ polymerasekædereaktion (Materialetabel) ved hjælp af specifikke primere (tabel 1) på cDNA'et for at undersøge genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme pcls' levedygtighed over tid blev der målt atfastsætte ATP-vævsniveauer. ATP-niveauerne er typisk proportionale med levedygtigheden. PCLS (ca. 15 mm2 i området) blev dyrket i normale William's E medium med 10% FBS, derefter på bestemte tidspunkter, leverskiver blev fjernet fra vævkultur og homogeniseret med både ATP og protein (for normalisering) koncentrationer (Tabel af materialer) måles ( Figur1A). For biokemiske analyser som denne er normalisering vigtig, da de afskårne leverskiver ikke nødvendigvis er identiske i dimensioner. ATP-niveauer (i forhold til protein) blev undertrykt umiddelbart efter isolation og efter 1 time (Figur 1A), hvilket tyder på kortvarig metabolisk stress fra køle- og skæreprocedurerne. ATP-niveauerne steg imidlertid med 3 h. ATP-niveauerne forblev forhøjede med op til 5 dages vævskultur, hvilket indikerer, at der ikke var noget signifikant fald i levedygtigheden. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af leverskiver tydede på, at begrænset vævsnekrose (karakteriseret ved nuklear pleleomorfi) forekom i kulturen fra omkring dag 2 og 3. Vævsnekroseniveauet udviklede sig til alvorlige dag 5 (figur 1B). I betragtning af disse morfologiske data, sammenværet med ATP-resultaterne, anbefales det at bruge denne eksperimentelle vævsmodel i op til 3 dage.
PCLS viste også stigende kollagen akkumulering på senere kultur tidspunkter, som det fremgår af fortykkelse af Picro-sirius rød-farvede kollagen fibre på dag 5 (Figur 2). Denne fortykkelse af kollagen fibre tyder på, at spontane fibrogene processer er aktive i PCLS opnået ved hjælp af denne metode. Denne proces synes uafhængig af PCLS isolation metode med fortykkelse af kollagen fibre6 og profibrogenic genekspression14 forekommer fra både vibratome og Krumdieck væv pålægsmaskiner, henholdsvis over tid. Udviklingen af disse spontane fibrogene skal tages i betragtning ved fortolkningen af PCLS-biologi, især med forsøg i forbindelse med fibrotiske processer.
Vi har tidligere vist den betydelige induktion af cholangiocyt-specifikke gen connexin 43 (Cx43) og sekretion af glutamyl transpeptidase (Ggt1) protein ved TCA i PCLS9. Udtrykket af cholangiocyt-specifikke gener i forhold til rengøring kontrol (glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase [Gapdh] og hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1 [Hprt1]) i PCLS behandlet med TCA, GCA, eller CA blev undersøgt ved qPCR ved hjælp af specifikke primere. I overensstemmelse med en tidligere rapport, en betydelig induktion i udtrykket af cholangiocyt-specifikke gener cytokeratin 19 (CK19; Figur 3A) og connexin 43 (Cx43; Figur 3B) blev observeret af både GCA og TCA. Ggt1 udtryk blev øget af begge galdesyrer; selv om dette ikke nåede statistisk signifikans, muligvis på grund af eksperimentel variation (figur 3C). Udtrykket af CA var upåvirket af nogen galdesyre. Induktion af cholangiocyt-specifikke gener tyder på, at GCA også kan være involveret i kolestatisk leverskade, som tidligere rapporteret for TCA8,9.
Figur 1: Vævslevedygtighed af præcisionsskårne leverskiver (PCLS). (A) ATP- og proteinniveauer i PCLS blev målt med det samme (T + 0) og ved 1 time, 3 timer, 6 timer og 1−5 dage efter isolation. (B) For at undersøge cellemorfologi blev PCLS fikseret, paraffinindlejret, opdelt og plettet med H&E med det samme (dag 0) og ved 1, 2 og 5 dage efter isolation. En Kruskal-Wallis test med Dunns flere sammenligninger test blev udført i forhold til T + 0. Alle data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 2-3 mus) med *p < 0,05. Skalastængerne repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vurdering af kollagenaflejring i PCLS. PCLS blev fastgjort, paraffin-indlejret, opdelt, og farves med Picro-Sirius Red at visualisere kollagen fibre på dag 0, 1, 2 og 5 post-isolation. Skalastængerne repræsenterer 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Galdesyrer fremkalder cholangiocyt-specifikke genekspression. Ved 16 timers post-isolation blev medium på PCLS ændret, og der blev tilsat et nyt medium sammen med 150 μM glyocholic (GCA), taurocholic (TCA) eller choliske (CA) syrer (natriumsalte). PCLS blev høstet efter 2 dage, og udtrykket af cytokeratin 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B) og γ-glutamyltranspeptidase 1 (Ggt1; C) blev undersøgt i forhold til det geometriske gennemsnit af Gapdh og Hprt1. Dunnetts flersammenligningstest blev udført i forhold til ubehandlede kontrolvævsskiver (n = 15). Alle data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 4 mus, treeksemplarer skiver; *p < 0,05, **p < 0,01). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: qPCR primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen viser anvendelsen af murine PCLS isolation og væv kultur, og procedurerne er designet til at vurdere både levedygtighed og nytte samt undersøge virkningerne af udefrakommende mediatorer af leverenpatobiologi ved hjælp af biokemiske assays, histologi, og qPCR. Den eksperimentelle nytte af PCLS vævkultur hos gnavere og mennesker er blevet påvist i en bred vifte af applikationer, herunder eksperimentelle undersøgelser i microRNA15/RNA9/ protein udtryk16, metabolisme17, viral infektion dynamik10,18, infektion signalering19, tumor invasion12, toksicitet undersøgelser4,13,15,20, DNA-skader studie21, cellebiologi14og sekresionsstudier9.
Mens ATP-niveauer indikerer cellulær levedygtighed i PCLS op til 5 dage i kultur, H & E farvning tyder på, at svær nekrose forekom af 5 dage i kultur. Den vigtigste faktor , der synes at begrænse pcls' levedygtighed , er ilttilgængelighed6,11. Flere undersøgelser har omfattet øget ilttilgængelighed og dermed øget levedygtighedstiden for PCLS i vævskultur. Metoder , der anvendes til at øge ilttilgængeligheden , omfatter inkubation af væv i iltrige atmosfærer10,11, brug af iltbærerperfusionperfluordecalin12, omrystning/rulning af kulturen under inkubation6,10,13og vævskulturplader , der er designet til at maksimere iltning6.
For nylig, en innovativ luft-flydende interface væv kultur system er blevet beskrevet med funktionelle nytte angivet på længere end 7 dage i kultur14. Denne protokol bruger omgivende atmosfærisk ilt i en normal vævskultur inkubator. Metoden gør det muligt for PCLS at være tilgængelig for laboratorier, der ikke har højt specialiseret, brugerdefineret udstyr til sikkert at forbedre iltlevering. Men hvis sådanne metoder til at forbedre iltlevering er til rådighed, de kan forbedre langsigtede PCLS levedygtighed i kulturen.
Akkumulering af kollagen i PCLS efter dag 3 i kultur tyder på, at spontane fibrogene processer er aktive inden for denne model. Spontan fibrose er også blevet observeret tidligere i PCLS6,14,22,23,24 og er muligvis medieret af skadesrelaterede molekylære mønstre (OPP'er) udgivet ved skæring proces eller væv nekrose. Moderpresser fungerer som signalmolekyler , der efterfølgende aktiverer pro-fibrotiske signalveje25,26. Desuden kunne spontan fibrose i PCLS medieres af chemokiner, der frigives fra aktivering af stellateceller og/eller Kupffer-celler (dvs. omdanne vækstfaktor beta [TGF-β]). I denne sammenhæng tyder en nylig artikel af Bigaeva et al.24 på, at spontan fibrose i PCLS til dels er medieret af TGF-β signalering, som inkubation af PCLS med TGF-β-hæmmer Galunisertib hæmmet genekspression ændringer forbundet med spontan leverfibrose. En anden mulig mekanisme er, at udskæringsproceduren i første omgang inducerer celleproliferation signalering veje og indtrængning af hepatocytter i cellecyklus; Denne mekanisme svigter imidlertid og resulterer i cellecyklusanholdelse i midten af G1-fase27. Celle cyklus anholdelse er forbundet med leverfibrose snarere end leverregenerering28.
I den repræsentative eksperimentelle procedure behandles PCLS med tre forskellige galdesyrer (GCA, TCA og CA) i 2 dage for at simulere kolestatisk leverskade. To af galdesyrerne (GCA og TCA) fremkalder signifikant ekspression af CK19 og Cx43, som er gener forbundet med cholangiocytfunktion. Dette tyder på udvidelse eller differentiering af celler i retning af en cholangiocyt afstamning i PCLS behandlet med disse galdesyrer. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere arbejde viser en lignende effekt ved hjælp af TCA9 på PCLS. Endvidere, Det er også i overensstemmelse med in vivo observationer, der viser fodring taurocholate til rotter øger cholangiocyt numre29. Behandlingen af levervæv skiver med galdesyrer simulerer hepatisk kolestase, og det er spekuleret på, at stigningen i udtrykket af gener forbundet med cholangiocyte funktion er et forsøg fra levervævet til at skabe yderligere galdegangler at øge galde sekresi. I betragtning af den specifikke induktion af disse gener er produceret af konjugerede galdesyrer (GCA og TCA), men ikke den uformonterede CA, Er det mistanke om, at disse virkninger er medieret af sphingosin-1-fosfat receptor 2, en celle overflade receptor med præferenceaktivering ved konjugerede galdesyrer30.
En vigtig begrænsning af anvendelsen af PCLS er individuel replikeringsvariabilitet. Da leveren ikke er homogen, og der er variation i produktionen, leverskiver tendens til at have større biologisk variation end cellekultur eksperimenter. I eksperimentelle undersøgelser med få variabler, såsom den repræsentative procedure vist ovenfor, er dette overvundet ved hjælp af et øget antal replikater. Dette kan dog blive et problem for større screeningsundersøgelser. Sammenfattende er den beskrevne protokol en enkel og pålidelig metode til at studere aspekter af leverpatologi ex vivo, der kræver lidt specialiseret udstyr med undtagelse af vibratome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (Grant No. APP1048740 og APP1142394 til G.A.R.; APP1160323 til J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm støttes af et Senior Research Fellowship fra NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo blev støttet af TALENTO-programmet i Madrid, Spanien (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
