Summary
Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor de productie van levensvatbare precisiegesneden leverschijfjes van muizen. De ex vivo weefselmonsters kunnen meerdere dagen onder laboratoriumweefselkweekomstandigheden worden bewaard, wat een flexibel model biedt om leverpathobiologie te onderzoeken.
Abstract
Inzicht in de mechanismen van leverletsel, leverziekte en leverkanker vereist experimentele manipulatie van diermodellen en in vitro celculturen. Beide technieken hebben beperkingen, zoals de eis van grote aantallen dieren voor in vivo manipulatie. Echter, in vitro cel culturen niet reproduceren de structuur en functie van de meercellige hepatische omgeving. Het gebruik van precisiegesneden leverplakjes is een techniek waarbij uniforme plakjes levensvatbare muislever worden bewaard in laboratoriumweefselkweek voor experimentele manipulatie. Deze techniek neemt een experimentele niche in die bestaat tussen dierstudies en in vitro celkweekmethoden. Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode om precisiegesneden leverschijfjes van muizen te isoleren en te kweken. Als toepassing van deze techniek worden ex vivo leverschijfjes behandeld met galzuren om cholestatic leverletsel te simuleren en uiteindelijk de mechanismen van leverfibrogenese te beoordelen.
Introduction
De pathogenese van de meeste chronische leverziekten (d.w.z. virale hepatitis, niet-alcoholische steatohepatitis, cholestatic leverletsel en leverkanker) omvat complexe interacties tussen meerdere verschillende leverceltypen die ontstekingen, fibrogenese en kankerontwikkelingstimuleren 1,2. Om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan deze chronische leverziekten, moeten de interacties tussen meerdere leverceltypen worden onderzocht. Terwijl meerdere levercellijnen (en meer recent, organoïden) in vitro kunnen worden gekweekt, emuleren deze modellen niet nauwkeurig de complexe structuur, functie en cellulaire diversiteit van de hepatische microomgeving3. Bovendien kunnen gekweekte levercellen (met name getransformeerde cellijnen) afwijken van hun oorspronkelijke bronbiologie. Diermodellen worden experimenteel gebruikt om de interacties tussen meerdere leverceltypen te onderzoeken. Ze kunnen echter aanzienlijk worden verminderd in de ruimte voor experimentele manipulatie, als gevolg van aanzienlijke off-target effecten in extrahepatische organen (bijvoorbeeld bij het testen van potentiële therapieën).
Het gebruik van precisiegesneden leverschijfjes (PCLS) in weefselkweek is een experimentele techniek die voor het eerst wordt gebruikt in medicijnmetabolisme- en toxiciteitsstudies, en het gaat om het snijden van levensvatbare, ultradunne (ongeveer 100-250 μm dikke) leverschijfjes. Dit maakt de directe experimentele manipulatie van leverweefsel ex vivo4mogelijk. De techniek overbrugt een experimentele kloof tussen in vivo dierstudies en in vitro celkweekmethoden, waardoor vele nadelen van beide methoden worden weggenomen (d.w.z. praktische beperkingen op het scala aan experimenten die bij hele dieren kunnen worden uitgevoerd, evenals verlies van structuur/functie en cellulaire diversiteit met in vitro celkweekmethoden).
Bovendien verhoogt PCLS de experimentele capaciteit aanzienlijk in vergelijking met hele dierstudies. Aangezien één muis meer dan 48 leverschijfjes kan produceren, vergemakkelijkt dit ook het gebruik van zowel controle- als behandelingsgroepen uit dezelfde lever. Bovendien scheidt de techniek het leverweefsel fysiek van andere orgaansystemen; daarom verwijdert het potentiële off-target effecten die kunnen optreden bij hele dieren bij het testen van de effecten van exogene stimuli.
In dit protocol worden PCLS gegenereerd met behulp van een vibratoom met een lateraal trillend blad. Andere studies hebben met succes gebruik gemaakt van een Krumdieck weefselsnijmachine, zoals beschreven in Olinga en Schuppan5. In het vibratoom voorkomt laterale trilling van het blad scheuren van het ultradunne weefsel veroorzaakt door schuifspanning, omdat het blad in het weefsel wordt geduwd. Zowel de vibratoom en Krumdieck weefsel snijmachine werken effectief zonder structurele inbedding van leverweefsel, die de snijden procedure stroomlijnt. Deze techniek kan ook worden gebruikt om PCLS te maken van zieke levers, met inbegrip van die van muismodellen van fibrose/cirrose6 en hepatische steatose7.
Naast het aantonen van de technieken die nodig zijn voor de bereiding en weefselkweek van PCLS, onderzoekt dit rapport ook de levensvatbaarheid van deze ex vivo weefsels door het meten van adenosine trifosfaat (ATP) niveaus en het onderzoeken van weefselhistologie om necrose en fibrose te beoordelen. Als representatieve experimentele procedure worden PCLS behandeld met pathofysiologische concentraties van drie verschillende galzuren (glycocholic, taurocholic en choliczuren) om cholestatische leverletsel te simuleren. In de context van cholestatic leverletsel is aangetoond dat met name taurocholiczuur aanzienlijk is toegenomen in zowel het serum als de gal van kinderen met cystische fibrosegeassocieerde leverziekte8.
Levervoorlopercellen zijn ook in vitro behandeld met taurocholiczuur om de verhoogde taurocholiczuurniveaus te simuleren die bij patiënten worden waargenomen, en deze behandeling veroorzaakte verhoogde proliferatie en differentiatie van levervoorlopercellen naar een biliaire (cholangiocyte) fenotype9. Vervolgens werden PCLS ex vivo behandeld met verhoogde niveaus van taurocholiczuur, en verhoogde cholangiocyte markers werden waargenomen. Dit ondersteunt de in vitro observatie die taurocholic zuur stimuleert galproliferatie en / of differentiatie in de context van pediatrische cystische fibrose-geassocieerde leverziekte9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Australische code voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden op QIMR Berghofer Medical Research Institute met goedkeuring van het instituut dier ethiek comite. Mannelijke C57BL/6 muizen (15−20 weken oud) werden verkregen uit het Animal Resources Centre, WA, Australië.
OPMERKING: Alle oplossingen, media, instrumenten, hardware en buizen die contact opnemen met de monsters moeten worden gesteriliseerd of grondig gedesinfecteerd met een 70% ethanoloplossing en behandeld met behulp van steriele technieken om het risico op cultuurverontreiniging te minimaliseren.
1. Opstelling van het vibratoom
- Bereid steriele Krebs-Henseleit bufferoplossing met 2 g/L glucose(Tabel met materialen). Controleer of de pH van de buffer 7,4 is. Als de pH hoger is, verzadig de buffer met carbogen (95% O2 + 5% CO2)of uitbroed binnen een 5% CO2 weefselkweekincubator om het bicarbonaatbufferingssysteem te corrigeren. Koel de verzegelde steriele bufferoplossing bij 4 °C.
- Steek het vibratoommes in de snijarm. Zorg ervoor dat het mes stevig aan de snijarm is bevestigd, omdat trillingen ervoor kunnen zorgen dat het mes loskomt.
- Desinfecteer het mes en de snijarm met een 70% ethanoloplossing.
LET OP: Vermijd contact met het mes. - Desinfecteer de bufferlade met een 70% ethanoloplossing en veeg deze af met een steriel weefsel.
- Steek de bufferlade in het vibratoom en draai het montagemechanisme aan.
- Stel de snijarm in op de maximaal beschikbare hoogte.
- Stel de bladhoek in op 10° onder horizontaal, schuin naar beneden naar het monster. Zorg ervoor dat de hoek van het blad goed is bevestigd.
OPMERKING: De optimale bladhoek kan verschillen afhankelijk van het vibratoommodel en de weefselkenmerken. - Desinfecteer de monsterhouder met een 70% ethanoloplossing.
- Sluit het koelwater aan voor de Thermo-elektrische koelkoeler van Peltier onder de bufferlade.
LET OP: Sommige vibratome modellen gebruiken een ijsbad voor koeling in plaats daarvan. - Bevestig de waterbuis aan een afvoer en zet het water aan. Stel de koeler in op 4 °C. Laat koelwater uitvoeren met een snelheid van >400 mL/min.
- Vul de bufferlade bijna naar de top met steriele ijskoude Krebs-Henseleit buffer (met 2 g/L glucose). Laat extra Krebs-Henseleit bufferoplossing op ijs.
2. Leververwijdering en -bereiding
- Steriliseren of desinfecteren alle chirurgische instrumenten, waaronder gebogen tangen, platte vierkante punt tangen, pincet, chirurgische klemmen, en schaar met behulp van autoclaving.
- Vóór de leververwijdering, diep verdoven muizen met behulp van een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine.
OPMERKING: Andere verdovingsmiddelen kunnen worden gebruikt, of muizen2 kunnen worden geëuthanaseerd door CO 2-verstikking/cervicale dislocatie als de lever snel wordt verwijderd om hypoxie-geïnduceerde schade te voorkomen. - Desinfecteer huidoppervlakken op muizen door te bevochtigen met een 70% ethanoloplossing. Zet muizen op hun rug met alle ledematen vastgepind aan een ontledende plank.
- Maak een verticale middellijn incisie in de huid vanaf de basis van de buikholte tot net boven het middenrif.
OPMERKING: Insnijdingen naar de ledematen worden gemaakt om de intrekking van de huid te vergemakkelijken. - Trek de huid terug tijdens het snijden van bindweefsel tussen de huid en de buikholte. Voorkom dat het haar zoveel mogelijk naar de buikholte wordt overgebracht. Speld of klem de huid weg van de buikholte.
- Open met behulp van schone tangen en scharen de buikholte en de onderste borstholte.
- Het verwijderen van de lever snel zonder beschadiging van de lobben
- Met behulp van botte gereedschappen (bijvoorbeeld platte vierkante punt tangen), begeleiden de bovenste lever kwabben naar beneden naar de buik. Snijd het bindweefsel rond de bovenste leverkwabben met behulp van een schaar.
- Leid de leverkwabben naar boven richting het middenrif. Houd de centrale vasculaire bundel van de lever met tangen.
OPMERKING: Het heeft geen invloed op de procedure als de centrale vasculaire bundel beschadigd is. - Trek de centrale vasculaire bundel uit de buurt van de muis en snijd het resterende bindweefsel, bloedvaten, enz. Zorg ervoor dat niet tot 1) schade aan de leverkwabben en 2) gesneden in het maag-darmkanaal, omdat dit de lever kan besmetten met micro-organismen.
- Plaats de verwijderde lever in een steriele weefselkweekschaal van 10 cm half gevuld met ijskoude Krebs-Henseleit bufferoplossing. Met behulp van een stomp instrument om de lobben te begeleiden, snijd het midden van de lever om het te verdelen in aparte lobben.
- Selecteer een leverkwab (gebruik eerst de grootste) en plaats deze plat op een nieuwe steriele schotel van 10 cm. Bewaar alle andere leverkwabben in de schaal van Krebs-Henseleit bufferoplossing opgeslagen op ijs voor verder gebruik.
- Trim ongeveer 10% van het materiaal van de hoogste rand van de leverkwab terwijl u plat ligt.
OPMERKING: Trimmen is belangrijk, omdat deze weefselrand eerst contact zal opnemen met het snijblad; daarom zal een weefselrand die relatief loodrecht staat op het snijblad weefselcompressie voorkomen die kan optreden als gevolg van ondiepe hoeken in de onbesneden leverkwabben. - Trim de andere drie weefselranden.
OPMERKING: Dit verwijdert een deel van de vezelige Glisson's capsule en zal de scheiding van het weefsel plakjes gemakkelijker te maken. - Montage van de leverkwab op de specimenhouder
- Plaats een dunne laag cyanoacrylaatlijm (superlijm of medisch/veterinaire cyanoacrylaatlijm) op de houder van het monster naar voren, iets groter dan de bijgesneden leverkwab.
OPMERKING: Controleer of de cyanoacrylaatlijm geen niet-cyanoacrylaatadditieven bevat. - Pak voorzichtig de leverkwab met steriele tangen met behulp van een hoek weg van de snijkant, dan dep droog eventuele resterende buffer van de vlakke kant van de leverkwab met behulp van steriele absorberend materiaal.
- Plaats de grote vlakke kant van de leverkwab op de cyanoacrylaatlijmpleister met de grootste rand naar voren gericht. Laat het 1,2 min in de lucht genezen.
OPMERKING: Cyanoacrylaatlijmen genezen snel (~2 min) in reactie op restvocht en weefseleiwitten, en ze zullen het weefsel stevig hechten aan de monsterhouder.
- Plaats een dunne laag cyanoacrylaatlijm (superlijm of medisch/veterinaire cyanoacrylaatlijm) op de houder van het monster naar voren, iets groter dan de bijgesneden leverkwab.
3. Productie van leverschijfjes
- Plaats de monsterhouder met de bijgevoegde leverkwab in de vibratome bufferlade. Zorg ervoor dat de leverkwab volledig is bedekt met buffer.
LET OP: Vul indien nodig het niveau van ijskoude Krebs-Henseleit bufferoplossing aan. Als het bufferniveau het snijproces verduistert, verhoogt of verlaagt u het niveau. - Stel de snijsnelheid in.
OPMERKING: Dit kan nodig zijn om empirisch te worden bepaald, afhankelijk van de vibratoom model en blad kenmerken. Gebruik als startgids een snelheid van 57 Hz/3.420 rpm. De vibratome snelheid kan worden gemeten met behulp van een audio spectrum analyzer applicatie op een smartphone. - Laat het snijblad zakken tot het zich net boven de leverkwab bevindt met behulp van de hoogteknop. Voer de trillende snijarm over het monster.
- Breng het mes terug met de krukas in omgekeerde richting. Activeer de trillingen tijdens het terugbrengen van het blad. Nadat het blad is teruggekeerd en niet boven het monster ligt, laat u de bladhoogte met 250 μm zakken.
- Herhaal het snijproces totdat de bovenkant van het weefsel is verwijderd. Gooi de eerste een of twee plakjes, omdat deze glisson's capsule bevatten en daarom niet veel functioneel leverweefsel bevatten in vergelijking met andere plakjes.
- Om leverplakjes te snijden, gaat u langzaam het trillende mes in het weefsel door het handvat te draaien. Gebruik een kleine kwast (gedesinfecteerd met een 70% ethanoloplossing) om het weefsel tijdens het snijproces voorzichtig te begeleiden.
- Gebruik de kwast om de plakjes gesneden weefsel op te tillen en plaats het weefselschijf in een steriele buis van ijskoude Krebs-Henseleit buffer. Wanneer u niet in gebruik bent, houdt u deze buis op ijs tussen plakjes.
OPMERKING: Soms scheurt het weefsel tijdens het snijproces, maar voor de meeste doeleinden is het weefsel nog bruikbaar. - Herhaal het snijproces totdat de basis van de leverkwab is bereikt. Gooi eventuele leverplakjes die zichtbare genezen lijm hebben.
OPMERKING: De uitgeharde lijm is zichtbaar als witte gebieden op de weefselschijfjes. Een typische leverkwab heeft slechts een bruikbare dikte van ongeveer 2 mm. Daarom worden slechts ongeveer acht 250 μm leverschijfjes van elke kwab geproduceerd. - Snijd de weefselschijfjes tot in de buurt van de cyanoacrylaatlijm. Snijd niet in de lijm.
- Herhaal het hele proces met andere leverkwabben totdat het vereiste aantal weefselschijfjes is verkregen.
- Om de genezen cyanoacrylaatlijm en weefsel van de specimenhouder schoon te maken, gebruik je een mes om het gezouten lijm/weefselmengsel eraf te schrapen, of verzacht en reinig het mengsel met aceton of dimethylsulfoxide.
4. Weefselkweek
OPMERKING: Al het weefselkweekwerk moet worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroomkap.
- In een weefselkweek laminaire stroomkap, pipet 1 mL van William's E medium met 2,0 g/L glucose, 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine supplement, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine in 12 put weefsel kweekplaten.
OPMERKING: Andere antibiotica en schimmelwerende middelen kunnen ook worden toegevoegd. Sommige studies hebben additieven gebruikt in het weefsel incubatiemedium (d.w.z. dexamethason en insuline10),maar deze kunnen interfereren met celsignalering. - Plaats de buis met leverplakjes van ijs in de weefselkweekkap. Om de plakjes weefsel te verwijderen, draai het mengsel voorzichtig en kiet zachtjes in een steriele schotel van 10 cm tijdens het wervelen.
- Met behulp van steriele scherppunttangen en een scalpel snijd u de weefselschijfjes in ongeveer uniforme maten (bijvoorbeeld 15 mm2).
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om een consistent oppervlak te garanderen. Omdat muisleverkwabben aanzienlijk verschillen in grootte en sommige weefselplakjes zullen scheuren, zal dit een reeks PCLS met verschillende oppervlaktes produceren. De uiteindelijke oppervlaktegrootte van de PCLS is afhankelijk van hoeveel materiaal nodig is in latere analysetoepassingen en hoeveel replica's nodig zijn. Het snijden van grote PCLS in kleinere meerdere stukken van dezelfde geschatte grootte zal aangeboren een verhoogd aantal experimentele replica's mogelijk te maken. - Breng met behulp van steriele tangen of een kleine penseel de plakjes gesneden weefsel over naar de putten van een 12-putplaat met 1 mL medium.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de consistentie van dikte en vorm van weefselplakjes wordt bevestigd. Secties die donkerder zijn dan gemiddeld suggereren dat de weefseldikte groter is en moet worden weggegooid. Lichtere plakjes suggereren de aanwezigheid van genezen cyanoacrylaatlijm en moeten worden weggegooid. - Bebroed de leverschijfjes bij 37 °C en 5% CO2 onder 95% vochtigheid.
OPMERKING: Andere groepen hebben methoden gebruikt om de zuurstoftoevoer naar PCLS te verbeteren, die de overlevingstijd van weefsellijkente verlengen 6,10,11,12,13 (zie discussiesectie). - Op de volgende dag, verander het kweekmedium met behulp van een handmatige pipet (in plaats van zuiging) om het verlies van weefsel te voorkomen door zuigfouten. Verander vervolgens dagelijks het medium op de PCLS. De PCLS zijn nu klaar voor experimenteel gebruik.
5. Voorbeeld toepassing van PCLS
- Bij 16 uur na de generatie, behandel PCLS met drie verschillende galzuren: glycocholic zuur (GCA), taurocholic zuur (TCA), en cholic zuur (CA) (als natriumzouten, allemaal bij een concentratie van 150 μM) gedurende 2 dagen.
- Na 2 dagen van galzuur behandeling, extract mRNA door het plaatsen van weefsel plakjes in ijskoude RNA lyse buffer en snel homogeniseren met behulp van kralen met een kraal homogenisator(Tabel van materialen).
- Zuiver het RNA met behulp van een RNA isolatiekit(Table of Materials)en maak cDNA uit het gezuiverde RNA.
- Voer kwantitatieve polymerase kettingreactie(Tabel van Materialen)uit met behulp van specifieke primers(tabel 1) op het cDNA om genexpressie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de levensvatbaarheid van PCLS in de loop van de tijd te bepalen, werden weefsel ATP-niveaus gemeten. ATP-niveaus zijn doorgaans evenredig aan de levensvatbaarheid. PCLS (ongeveer 15 mm2 in gebied) werden gekweekt in normale William's E medium met 10% FBS, vervolgens op specifieke tijdpunten, lever plakjes werden verwijderd uit weefselcultuur en gehomogeniseerd met zowel ATP en eiwit (voor normalisatie) concentraties(Tabel met materialen) wordt gemeten (Figuur 1A). Voor biochemische testen als deze is normalisatie belangrijk, omdat de gesneden leverschijfjes niet noodzakelijkerwijs identiek zijn in afmetingen. ATP-niveaus (ten opzichte van eiwitten) werden onmiddellijk na isolatie onderdrukt en na 1 uur(figuur 1A)wordt gesuggereerd dat op korte termijn metabolische stress van de koel- en snijprocedures wordt veroorzaakt. Echter, ATP niveaus hersteld door 3 uur. ATP niveaus bleef verhoogd op maximaal 5 dagen van weefselcultuur, wat aangeeft dat er geen significante daling van de levensvatbaarheid. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van leverschijfjes suggereerde dat beperkte weefselnecrose (gekenmerkt door nucleair pleomorphisme) zich in de cultuur voordeed vanaf ongeveer dagen 2 en 3. Weefselnecrose niveaus vorderde tot ernstig door dag 5 (Figuur 1B). Gezien deze morfologische gegevens, genomen samen met de ATP-resultaten, wordt aanbevolen om dit experimentele weefselmodel maximaal 3 dagen te gebruiken.
PCLS toonde ook toenemende collageen accumulatie op latere cultuur tijdpunten, zoals blijkt uit verdikking van Picro-sirius rood gekleurdcollageen vezels op dag 5 (Figuur 2). Deze verdikking van collageenvezels suggereert dat spontane fibrogene processen actief zijn in PCLS verkregen met behulp van deze methode. Dit proces lijkt onafhankelijk van PCLS isolatie methodologie met de verdikking van collageen vezels6 en profibrogene genexpressie14 die zich van zowel vibratome en Krumdieck weefsel slicers, respectievelijk na verloop van tijd. Bij de interpretatie van pcls-biologie moet rekening worden gehouden met de ontwikkeling van deze spontane fibrogene processen, met name bij experimenten die verband houden met vezelachtige processen.
We hebben eerder de significante inductie van cholangiocyte-specifieke gen connexin 43 (Cx43) en afscheiding van glutamyl transpeptidase(Ggt1) eiwit door TCA in PCLS9. De expressie van cholangiocyte-specifieke genen met betrekking tot huishoudelijke controles (glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase [Gapdh] en hypoxanthine fosforibosyltransferase 1 [Hprt1]) in PCLS behandeld met TCA, GCA, of CA werden onderzocht door qPCR met behulp van specifieke primers. In overeenstemming met een eerder rapport, een significante inductie in de expressie van cholangiocyte-specifieke genen cytokeratine 19 (CK19; Figuur 3A) en connexin 43 (Cx43; Figuur 3B) werd waargenomen door zowel GCA als TCA. Ggt1 expressie werd verhoogd door beide galzuren; hoewel dit geen statistische significantie bereikte, mogelijk als gevolg van experimentele variatie(figuur 3C). De expressie van CA werd niet beïnvloed door galzuur. De inductie van cholangiocyte-specifieke genen suggereert dat GCA ook betrokken kan zijn bij cholestatic leverletsel, zoals eerder gemeld voor TCA8,9.
Figuur 1: Weefsel levensvatbaarheid van precisiegesneden leverplakjes (PCLS). (A) ATP en eiwit niveaus in PCLS werden onmiddellijk gemeten (T + 0) en op 1 uur, 3 h, 6 h, en 1−5 dagen na isolatie. (B) Om de celmorfologie te onderzoeken, werden PCLS vastgesteld, paraffine-ingebed, persectie en bevlekt met H&E onmiddellijk (dag 0) en op 1, 2 en 5 dagen na isolatie. Een Kruskal-Wallis test met dunn's meerdere vergelijkingen test werd uitgevoerd ten opzichte van T + 0. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 2−3 muizen) met *p < 0,05. De schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Beoordeling van de depositie van collageen in PCLS. PCLS werden vastgesteld, paraffine-embedded, sectie, en gekleurd met Picro-Sirius Red om collageen vezels te visualiseren op dagen 0, 1, 2, en 5 post-isolatie. De schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Galzuren veroorzaken cholangiocyte-specifieke genexpressie. Op 16 uur post-isolatie, medium op PCLS werd veranderd, en nieuw medium werd toegevoegd, samen met 150 μM glycocholic (GCA), taurocholic (TCA), of cholic (CA) zuren (natriumzouten). PCLS werden na 2 dagen geoogst en de uitdrukking van cytokeratine 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B), en γ-glutamyl transpeptidase 1 (Ggt1; C) werd onderzocht ten opzichte van het geometrische gemiddelde van Gapdh en Hprt1. Dunnett's meervoudige vergelijkingen test werd uitgevoerd ten opzichte van onbehandelde controle weefsel plakjes (n = 15). Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 4 muizen, drievoud plakjes; *p < 0,05, **p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: qPCR primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol toont de toepassing van murine PCLS isolatie en weefselcultuur, en de procedures zijn ontworpen om zowel levensvatbaarheid en nut te beoordelen, evenals de effecten van exogene bemiddelaars van lever pathobiologie met behulp van biochemische testen, histologie, en qPCR te onderzoeken. Het experimentele nut van PCLS weefselcultuur bij knaagdieren en mensen is aangetoond in een breed scala van toepassingen, waaronder experimentele onderzoeken in microRNA15/RNA9/eiwitexpressie16, metabolisme17, virale infectie dynamiek10,18, infectie signalering19, tumor invasie12, toxiciteit studies4,13,15,20, DNA-schade studies21, celbiologie14, en secretie studies9.
Terwijl ATP-niveaus geven cellulaire levensvatbaarheid in PCLS tot 5 dagen in de cultuur, H & E vlekken suggereren dat ernstige necrose zich voordeed door 5 dagen in de cultuur. De belangrijkste factor die de levensvatbaarheid van PCLS lijkt te beperken, is de beschikbaarheid van zuurstof6,11. Verschillende studies hebben een verbeterde zuurstofbeschikbaarheid opgenomen en bijgevolg de levensvatbaarheidstijd van PCLS in de weefselkweek verhoogd. Methoden die worden gebruikt om de beschikbaarheid van zuurstof te verhogen omvatten de incubatie van weefsel in zuurstofrijke atmosferen10,11, gebruik van de zuurstofdrager perfusie perfluordecalin12, schudden / rollen van de cultuur tijdens incubatie6,10,13, en weefsel cultuur platen ontworpen om zuurstofte maximaliseren6.
Onlangs, een innovatieve lucht-vloeibare interface weefsel cultuur systeem is beschreven met functioneel nut vermeld op langer dan 7 dagen in cultuur14. Dit protocol maakt gebruik van atmosferische zuurstof in een normale weefselkweek incubator. De methode maakt het mogelijk PCLS toegankelijk te zijn voor laboratoria die niet over zeer gespecialiseerde, aangepaste apparatuur beschikken om de zuurstoftoevoer veilig te verbeteren. Als dergelijke methoden ter verbetering van de zuurstoftoevoer echter beschikbaar zijn, kunnen ze de levensvatbaarheid van PCLS op lange termijn in de cultuur verbeteren.
De accumulatie van collageen in PCLS na dag 3 in de cultuur suggereert dat spontane fibrogene processen actief zijn binnen dit model. Spontane fibrose is ook eerder waargenomen in PCLS6,14,22,23,24 en wordt mogelijk bemiddeld door schade-geassocieerde moleculaire patronen (DamPs) vrijgegeven door het snijproces of weefsel necrose. Dammps fungeren als signaalmoleculen die vervolgens pro-fibrotische signaleringstrajecten25,26activeren. Bovendien kan spontane fibrose in PCLS worden bemiddeld door chemokines die vrijkomen uit de activering van stellatecellen en/of Kupffer-cellen (d.w.z. het transformeren van de bèta van de groeifactor [TGF-β]). In deze context suggereert een recent artikel van Bigaeva et al.24 dat spontane fibrose bij PCLS gedeeltelijk wordt bemiddeld door TGF-β-signalering, als incubatie van PCLS met TGF-β-remmer Galunisertib geremde genexpressieveranderingen geassocieerd met spontane hepatische fibrose. Een ander mogelijk mechanisme is dat de snijprocedure in eerste instantie celproliferatiesignaleringstrajecten en binnenkomst van hepatocyten in de celcyclus veroorzaakt; dit mechanisme faalt echter en resulteert in celcyclusstilstand medio G1-fase27. Celcyclus arrestatie wordt geassocieerd met leverfibrose in plaats van leverregeneratie28.
In de representatieve experimentele procedure worden PCLS gedurende 2 dagen behandeld met drie verschillende galzuren (GCA, TCA en CA) om cholestatic leverletsel te simuleren. Twee van de galzuren (GCA en TCA) veroorzaken significante expressie van CK19 en Cx43, die genen zijn die geassocieerd zijn met cholangiocyte-functie. Dit suggereert de uitbreiding of differentiatie van cellen naar een cholangiocyte lineage in PCLS behandeld met deze galzuren. Dit komt overeen met ons vorige werk met een vergelijkbaar effect met TCA9 op PCLS. Bovendien komt het ook overeen met in vivo waarnemingen die aantonen dat het voeden van taurocholate aan ratten de cholangiocytengetallen29verhoogt. De behandeling van leverweefsel plakjes met galzuren simuleert hepatische cholestasis, en er wordt gespeculeerd dat de toename van de expressie van genen geassocieerd met cholangiocyte functie is een poging van het leverweefsel om extra galductules te creëren om galafscheiding te verhogen. Gezien de specifieke inductie van deze genen wordt geproduceerd door de geconjugeerde galzuren (GCA en TCA), maar niet de ongeconjugeerde CA, wordt vermoed dat deze effecten worden bemiddeld door de sphingosine-1-fosfaatreceptor 2, een celoppervlaktereceptor met preferentiële activering door geconjugeerde galzuren30.
Een belangrijke beperking van de toepassing van PCLS is individuele replicerenvariabiliteit. Aangezien de lever niet homogeen is en er variabiliteit in de productie is, hebben leverplakjes de neiging om grotere biologische variatie te hebben dan celkweekexperimenten. In experimentele studies met weinig variabelen, zoals de hierboven aangetoonde representatieve procedure, wordt dit overwonnen door het gebruik van een toename van het aantal replicaties. Dit kan echter een probleem worden voor grotere screeningstudies. Samengevat, het beschreven protocol is een eenvoudige en betrouwbare methode om aspecten van lever pathobiologie ex vivo te bestuderen, die weinig gespecialiseerde apparatuur, behalve voor het vibratoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië (Grant No. APP1048740 en APP1142394 tot G.A.R.; APP1160323 naar J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van het NHMRC van Australië (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo werd ondersteund door het TALENTO programma van Madrid, Spanje (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
