Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor de productie van levensvatbare precisiegesneden leverschijfjes van muizen. De ex vivo weefselmonsters kunnen meerdere dagen onder laboratoriumweefselkweekomstandigheden worden bewaard, wat een flexibel model biedt om leverpathobiologie te onderzoeken.
Inzicht in de mechanismen van leverletsel, leverziekte en leverkanker vereist experimentele manipulatie van diermodellen en in vitro celculturen. Beide technieken hebben beperkingen, zoals de eis van grote aantallen dieren voor in vivo manipulatie. Echter, in vitro cel culturen niet reproduceren de structuur en functie van de meercellige hepatische omgeving. Het gebruik van precisiegesneden leverplakjes is een techniek waarbij uniforme plakjes levensvatbare muislever worden bewaard in laboratoriumweefselkweek voor experimentele manipulatie. Deze techniek neemt een experimentele niche in die bestaat tussen dierstudies en in vitro celkweekmethoden. Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode om precisiegesneden leverschijfjes van muizen te isoleren en te kweken. Als toepassing van deze techniek worden ex vivo leverschijfjes behandeld met galzuren om cholestatic leverletsel te simuleren en uiteindelijk de mechanismen van leverfibrogenese te beoordelen.
De pathogenese van de meeste chronische leverziekten (d.w.z. virale hepatitis, niet-alcoholische steatohepatitis, cholestatic leverletsel en leverkanker) omvat complexe interacties tussen meerdere verschillende leverceltypen die ontstekingen, fibrogenese en kankerontwikkelingstimuleren 1,2. Om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan deze chronische leverziekten, moeten de interacties tussen meerdere leverceltypen worden onderzocht. Terwijl meerdere levercellijnen (en meer recent, organoïden) in vitro kunnen worden gekweekt, emuleren deze modellen niet nauwkeurig de complexe structuur, functie en cellulaire diversiteit van de hepatische microomgeving3. Bovendien kunnen gekweekte levercellen (met name getransformeerde cellijnen) afwijken van hun oorspronkelijke bronbiologie. Diermodellen worden experimenteel gebruikt om de interacties tussen meerdere leverceltypen te onderzoeken. Ze kunnen echter aanzienlijk worden verminderd in de ruimte voor experimentele manipulatie, als gevolg van aanzienlijke off-target effecten in extrahepatische organen (bijvoorbeeld bij het testen van potentiële therapieën).
Het gebruik van precisiegesneden leverschijfjes (PCLS) in weefselkweek is een experimentele techniek die voor het eerst wordt gebruikt in medicijnmetabolisme- en toxiciteitsstudies, en het gaat om het snijden van levensvatbare, ultradunne (ongeveer 100-250 μm dikke) leverschijfjes. Dit maakt de directe experimentele manipulatie van leverweefsel ex vivo4mogelijk. De techniek overbrugt een experimentele kloof tussen in vivo dierstudies en in vitro celkweekmethoden, waardoor vele nadelen van beide methoden worden weggenomen (d.w.z. praktische beperkingen op het scala aan experimenten die bij hele dieren kunnen worden uitgevoerd, evenals verlies van structuur/functie en cellulaire diversiteit met in vitro celkweekmethoden).
Bovendien verhoogt PCLS de experimentele capaciteit aanzienlijk in vergelijking met hele dierstudies. Aangezien één muis meer dan 48 leverschijfjes kan produceren, vergemakkelijkt dit ook het gebruik van zowel controle- als behandelingsgroepen uit dezelfde lever. Bovendien scheidt de techniek het leverweefsel fysiek van andere orgaansystemen; daarom verwijdert het potentiële off-target effecten die kunnen optreden bij hele dieren bij het testen van de effecten van exogene stimuli.
In dit protocol worden PCLS gegenereerd met behulp van een vibratoom met een lateraal trillend blad. Andere studies hebben met succes gebruik gemaakt van een Krumdieck weefselsnijmachine, zoals beschreven in Olinga en Schuppan5. In het vibratoom voorkomt laterale trilling van het blad scheuren van het ultradunne weefsel veroorzaakt door schuifspanning, omdat het blad in het weefsel wordt geduwd. Zowel de vibratoom en Krumdieck weefsel snijmachine werken effectief zonder structurele inbedding van leverweefsel, die de snijden procedure stroomlijnt. Deze techniek kan ook worden gebruikt om PCLS te maken van zieke levers, met inbegrip van die van muismodellen van fibrose/cirrose6 en hepatische steatose7.
Naast het aantonen van de technieken die nodig zijn voor de bereiding en weefselkweek van PCLS, onderzoekt dit rapport ook de levensvatbaarheid van deze ex vivo weefsels door het meten van adenosine trifosfaat (ATP) niveaus en het onderzoeken van weefselhistologie om necrose en fibrose te beoordelen. Als representatieve experimentele procedure worden PCLS behandeld met pathofysiologische concentraties van drie verschillende galzuren (glycocholic, taurocholic en choliczuren) om cholestatische leverletsel te simuleren. In de context van cholestatic leverletsel is aangetoond dat met name taurocholiczuur aanzienlijk is toegenomen in zowel het serum als de gal van kinderen met cystische fibrosegeassocieerde leverziekte8.
Levervoorlopercellen zijn ook in vitro behandeld met taurocholiczuur om de verhoogde taurocholiczuurniveaus te simuleren die bij patiënten worden waargenomen, en deze behandeling veroorzaakte verhoogde proliferatie en differentiatie van levervoorlopercellen naar een biliaire (cholangiocyte) fenotype9. Vervolgens werden PCLS ex vivo behandeld met verhoogde niveaus van taurocholiczuur, en verhoogde cholangiocyte markers werden waargenomen. Dit ondersteunt de in vitro observatie die taurocholic zuur stimuleert galproliferatie en / of differentiatie in de context van pediatrische cystische fibrose-geassocieerde leverziekte9.
Het protocol toont de toepassing van murine PCLS isolatie en weefselcultuur, en de procedures zijn ontworpen om zowel levensvatbaarheid en nut te beoordelen, evenals de effecten van exogene bemiddelaars van lever pathobiologie met behulp van biochemische testen, histologie, en qPCR te onderzoeken. Het experimentele nut van PCLS weefselcultuur bij knaagdieren en mensen is aangetoond in een breed scala van toepassingen, waaronder experimentele onderzoeken in microRNA15/RNA9/e…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië (Grant No. APP1048740 en APP1142394 tot G.A.R.; APP1160323 naar J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van het NHMRC van Australië (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo werd ondersteund door het TALENTO programma van Madrid, Spanje (T1-BIO-1854).
10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
Protractor | Generic | To measure blade angle | |
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
Scalpel Blade | Mixed | ||
Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
Square-Head Foreceps | Mixed | ||
Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
Surgical Clamps | Mixed | ||
Surgical Forceps | Mixed | ||
Surgical Pins | Mixed | ||
Surgical Scissors | Mixed | ||
Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |