Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.
Kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı ve karaciğer kanseri) altında yatan karaciğer hasarı, hepatik fibrozis ve siroz mekanizmalarının anlaşılması, hayvan modelleri ve in vitro hücre kültürleri. Her iki teknik de in vivo manipülasyon için hayvanların çok sayıda gereksinimi gibi sınırlamalar vardır. Ancak in vitro hücre kültürleri çok hücreli hepatik ortamın yapısını ve işlevini yeniden üretmez. Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin kullanımı, deneysel manipülasyon için laboratuvar doku kültüründe tek tip fare karaciğeri dilimlerinin muhafaza edildiği bir tekniktir. Bu teknik, hayvan çalışmaları ve in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında var olan deneysel bir niş kaplar. Sunulan protokol, farelerden hassas kesilmiş karaciğer dilimlerini izole etmek ve kültürü yapmak için basit ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Bu tekniğin bir uygulaması olarak, ex vivo karaciğer dilimleri kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek ve sonuçta hepatik fibrogenez mekanizmaları değerlendirmek için safra asitleri ile tedavi edilir.
En kronik karaciğer hastalıklarının patogenezi (yani, viral hepatit, nonalkolik steatohepatit, kolestatik karaciğer hasarı ve karaciğer kanseri) inflamasyon sürücü birden fazla farklı karaciğer hücre tipleri arasında karmaşık etkileşimler içerir, fibrogenezis, ve kanser gelişimi1,2. Bu kronik karaciğer bazlı hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için, birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimler araştırılmalıdır. Birden fazla hepatik hücre hatları (ve daha yakın zamanda, organoidler) in vitro kültürlü olabilir iken, bu modeller doğru karmaşık yapısı, fonksiyonu taklit etmez, ve hepatik mikroçevre hücresel çeşitlilik3. Ayrıca, kültürlü karaciğer hücreleri (özellikle, dönüştürülmüş hücre hatları) orijinal kaynak biyolojisi sapma olabilir. Hayvan modelleri deneysel olarak birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılır. Ancak, ekstrahepatik organlardaki (örn. potansiyel terapötikleri test ederken) önemli ölçüde hedef dışı etkiler nedeniyle deneysel manipülasyon kapsamı önemli ölçüde azalabilir.
Doku kültüründe hassas kesim karaciğer dilimlerinin (PCLS) kullanımı ilk olarak ilaç metabolizması ve toksisite çalışmalarında kullanılan deneysel bir tekniktir ve uygulanabilir, ultra ince (yaklaşık 100−250 μm kalınlığında) karaciğer dilimlerinin kesilmesini içerir. Bu karaciğer dokusu ex vivo4doğrudan deneysel manipülasyon sağlar. Bu teknik, in vivo hayvan çalışmaları ile in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında deneysel bir uçurum arasında köprü kurarak, her iki yöntemin de birçok dezavantajının üstesinden gelerek (örneğin, tüm hayvanlarda yapIlebilen deneylerin çeşitliliğinin pratik sınırları nın yanı sıra in vitro hücre kültürü yöntemleri ile yapı/fonksiyon ve hücresel çeşitlilik kaybı) arasında deneysel bir boşluk vardır.
Ayrıca, PCLS tüm hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük ölçüde deneysel kapasitesini artırır. Bir fare 48’den fazla karaciğer dilimleri üretebilir gibi, bu da aynı karaciğer hem kontrol ve tedavi gruplarının kullanımını kolaylaştırır. Buna ek olarak, teknik fiziksel olarak diğer organ sistemlerinden karaciğer dokusu ayırır; bu nedenle, eksojen uyaranların etkilerini test ederken tüm hayvanlarda oluşabilecek potansiyel hedef dışı etkileri ortadan kaldırır.
Bu protokolde, PCLS yanal titreşen bıçak ile bir vibratom kullanılarak oluşturulur. Diğer çalışmalar başarıyla olinga ve Schuppan5açıklandığı gibi, bir Krumdieck doku dilimleyici kullandık. Vibratomda, bıçağın yanal titreşimi, bıçak dokuya itilirken, kesme stresinin neden olduğu ultra ince dokunun yırtılmalarını önler. Hem vibratom hem de Krumdieck doku dilimleyicisi, dilimleme işlemini kolaylaştıran karaciğer dokusunun yapısal olarak gömülmeden etkin bir şekilde çalışır. Bu teknik aynı zamanda fibrozis / siroz6 ve hepatik steatoz7fare modelleri de dahil olmak üzere, hastalıklı karaciğerlerden PCLS oluşturmak için kullanılabilir.
Bu rapor, PCLS’nin hazırlanması ve doku kültürü için gerekli teknikleri göstermenin yanı sıra, adenozin trifosfat (ATP) düzeylerini ölçerek ve nekroz ve fibrozisi değerlendirmek için doku histolojisini inceleyerek bu ek sinol dokuların canlılığını da incelememektedir. Temsili bir deneysel prosedür olarak, PCLS kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek için üç farklı safra asitleri (glikokolik, taurokolik ve kolik asitler) patofizyolojik konsantrasyonları ile tedavi edilir. Kolestatik karaciğer hasarı bağlamında, özellikle taurokolik asit kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı olan çocukların hem serum hem de safra önemli ölçüde artmış olduğu gösterilmiştir8.
Karaciğer progenitor hücreleri de hastalarda gözlenen yüksek taurokolik asit düzeylerini simüle etmek için taurokolik asit ile in vitro tedavi edilmiştir, ve bu tedavi bir biliyer doğru karaciğer progenitor hücrelerinin artan çoğalma ve farklılaşmasına neden oldu (kolanjiyosit) fenotip9. Daha sonra, PCLS taurokolik asit yüksek düzeyde ex vivo tedavi edildi, ve artmış kolanjiyosit belirteçleri gözlendi. Bu, taurokolik asit in vitro gözlem pediatrik kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı bağlamında safra proliferasyonu ve / veya farklılaşma sürücüler destekler9.
Protokol, murine PCLS izolasyon ve doku kültürünün uygulanmasını göstermektedir ve prosedürler hem canlılık hem de yarar değerlendirmek ve biyokimyasal tahliller, histoloji ve qPCR kullanarak karaciğer patobiyolojisi eksojen mediatörlerin etkilerini incelemek için tasarlanmıştır. Kemirgenlerde ve insanlarda PCLS doku kültürünün deneysel faydası, mikroRNA15/RNA9/protein ekspresyonu16, metabolizma17, viral …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (Grant No) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. APP1048740 ve APP1142394 g.a.r. için; APP1160323 için J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm Avustralya NHMRC kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenir (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo, Madrid, İspanya’nın TALENTO programı (T1-BIO-1854) tarafından desteklendi.
10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
Protractor | Generic | To measure blade angle | |
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
Scalpel Blade | Mixed | ||
Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
Square-Head Foreceps | Mixed | ||
Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
Surgical Clamps | Mixed | ||
Surgical Forceps | Mixed | ||
Surgical Pins | Mixed | ||
Surgical Scissors | Mixed | ||
Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |