Summary
Detta protokoll ger en enkel och tillförlitlig metod för produktion av livskraftiga precisionsskurna leverskivor från möss. Ex vivo vävnadsprover kan upprätthållas under laboratorievävnad kultur villkor för flera dagar, vilket ger en flexibel modell för att undersöka lever patobiologi.
Abstract
Att förstå mekanismerna för leverskada, leverfibros och cirros som ligger bakom kroniska leversjukdomar (dvs. virushepatit, alkoholfri fettlever, metabolisk leversjukdom och levercancer) kräver experimentell manipulering av djurmodeller och in vitro-cellkulturer. Båda teknikerna har begränsningar, såsom kravet på ett stort antal djur för in vivo manipulation. Men in vitro cellkulturer reproducerar inte strukturen och funktionen av den multicellulära levermiljön. Användningen av precisionsskurna leverskivor är en teknik där enhetliga skivor av livskraftig muslever upprätthålls i laboratorievävnadskultur för experimentell manipulation. Denna teknik upptar en experimentell nisch som finns mellan djurstudier och in vitro-cellodlingsmetoder. Det presenterade protokollet beskriver en enkel och tillförlitlig metod för att isolera och odla precisionsskurna leverskivor från möss. Som en tillämpning av denna teknik, ex vivo lever skivor behandlas med gallsyror för att simulera kolestatisk leverskada och slutligen bedöma mekanismerna för lever fibrogenesis.
Introduction
Patogenesen vid de flesta kroniska leversjukdomar (dvs. virushepatit, alkoholfri steatohepatit, kolastatisk leverskada och levercancer) innebär komplexa interaktioner mellan flera olika levercelltyper som driver inflammation, fibrogenes och cancerutveckling1,2. För att förstå de molekylära mekanismer som ligger till grund för dessa kroniska leverbaserade sjukdomar måste interaktionerna mellan flera levercelltyper undersökas. Medan flera lever cellinjer (och mer nyligen, organoider) kan odlas in vitro, dessa modeller inte exakt efterlikna den komplexa struktur, funktion och cellulär mångfald av lever mikromiljö3. Dessutom kan odlade leverceller (i synnerhet transformerade cellinjer) avvika från sin ursprungliga källbiologi. Djurmodeller används experimentellt för att undersöka samspelet mellan flera levercelltyper. De kan dock bli betydligt reducerade i omfattning för experimentell manipulation, på grund av betydande effekter utanför målet i extrahepatiska organ (t.ex. vid testning av potentiella terapeutiska).
Användningen av precisionsskurna leverskivor (PCLS) i vävnadskultur är en experimentell teknik som först används i läkemedelsmetabolism och toxicitetsstudier, och det innebär skärning av livskraftiga, ultratunna (cirka 100−250 μm tjocka) leverskivor. Detta möjliggör direkt experimentell manipulation av levervävnad ex vivo4. Tekniken överbryggar en experimentell klyfta mellan in vivo djurstudier och in vitro-cellodlingsmetoder, vilket övervinner många nackdelar med båda metoderna (dvs. praktiska gränser för de experimentsom kan utföras i hela djur samt förlust av struktur/funktion och cellulär mångfald med in vitro-cellodlingsmetoder).
Dessutom ökar PCLS avsevärt experimentell kapacitet jämfört med hela djurstudier. Som en mus kan producera mer än 48 leverskivor, Detta underlättar också användningen av både kontroll och behandlingsgrupper från samma lever. Dessutom separerar tekniken fysiskt levervävnaden från andra organsystem; Därför avlägsnar den potentiella effekter utanför målet som kan uppstå hos hela djur vid testning av effekterna av exogena stimuli.
I det här protokollet genereras PCLS med en vibrerande med ett sidleds vibrerande blad. Andra studier har framgångsrikt använt en Krumdieck vävnad slicer, som beskrivs i Olinga och Schuppan5. I vibratomen förhindrar sidovibrationer av bladet att riva den ultratunna vävnaden som orsakas av skjuvspänning, eftersom bladet trycks in i vävnaden. Både vibratome och Krumdieck vävnad sårskivare fungerar effektivt utan strukturell inbäddning av levervävnad, vilket effektiviserar skivningsproceduren. Denna teknik kan också användas för att skapa PCLS från sjuka lever, inklusive de från mus modeller av fibros/cirros6 och leversteatos7.
Förutom att visa de tekniker som krävs för beredning och vävnadkultur av PCLS, undersöker denna rapport också livskraften hos dessa ex vivo vävnader genom att mäta adenosin tripfosfat (ATP) nivåer och undersöka vävnad histologi för att bedöma nekros och fibros. Som ett representativt experimentellt förfarande behandlas PCLS med patofysiologiska koncentrationer av tre olika gallsyror (glykofiska, taurocholic och cholic syror) för att simulera kolastatisk leverskada. I samband med kolestatisk leverskada har särskilt taurocholicsyra visat sig vara signifikant ökad hos både serum och galla hos barn med cystisk fibros-associerade leversjukdom8.
Lever stamceller har också behandlats in vitro med taurocholic syra för att simulera de förhöjda taurocholic syra nivåer som observerats hos patienter, och denna behandling orsakade ökad spridning och differentiering av lever stamceller mot en gallan (cholangiocyte) fenotyp9. Därefter behandlades PCLS ex vivo med förhöjda nivåer av taurocholic syra, och ökade cholangiocyte markörer observerades. Detta stöder in vitro observation att taurocholic syra driver gallans spridning och / eller differentiering i samband med pediatrisk cystisk fibros-associerade leversjukdom9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med den australiska koden för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål vid QIMR Berghofer Medical Research Institute med godkännande från institutets djuretiska kommitté. Manliga C57BL/6 möss (15−20 veckor) erhölls från Animal Resources Centre, WA, Australien.
OBS: Alla lösningar, media, instrument, hårdvara och rör som kommer i kontakt med proverna måste steriliseras eller noggrant desinficeras med en 70% etanollösning och hanteras med sterila tekniker för att minimera risken för odlingskontaminering.
1. Installation av vibratomen
- Förbered steril Krebs-Henseleit buffertlösning med 2 g/L glukos (Tabell över material). Kontrollera att buffertens pH-värdet är 7,4. Om pH är högre, mätta bufferten med carbogen (95% O2 + 5% CO2) eller inkubera inom en 5% CO2 vävnadkultur inkubator för att korrigera bikarbonat buffrar systemet. Kyl den förseglade sterila buffertlösningen vid 4 °C.
- Sätt in vibratomebladet i skärarmen. Se till att klingan är ordentligt fastsatt på skärarmen, eftersom vibrationer kan leda till att bladet lossnar.
- Desinficera bladet och skärarmen med en 70% etanollösning.
VARNING: Undvik kontakt med bladet. - Desinficera buffertfacket med en 70% etanollösning och torka den med en steril vävnad.
- Sätt i buffertfacket i vibratomen och dra åt monteringsmekanismen.
- Ställ skärarmen på den högsta tillgängliga höjden.
- Ställ bladvinkeln på 10° under horisontell, sluttande nedåt på provet. Se till att bladvinkeln är ordentligt fastsatt.
OBS: Den optimala bladvinkeln kan variera beroende på vibratomemodellen och vävnadsegenskaperna. - Desinficera provhållaren med en 70% etanollösning.
- Anslut kylvattnet till Peltiertermelkylaren som sitter under buffertfacket.
OBS: Vissa vibratome modeller använder ett isbad för kylning istället. - Fäst vattenutröret i ett avlopp och slå på vattnet. Ställ kylaren på 4 °C. Kör kylvatten med en hastighet av >400 ml/min.
- Fyll buffertbrickan nästan till toppen med steril iskalla Krebs-Henseleit buffert (med 2 g/L glukos). Lämna ytterligare Krebs-Henseleit buffertlösning på is.
2. Avlägsnande och beredning av lever
- Sterilisera eller desinficera alla kirurgiska instrument, inklusive böjda pincett, platta fyrkantiga pincett, pincett, kirurgiska klämmor och sax med hjälp av autoklav.
- Före avlägsnande av lever, djupt söva möss med hjälp av en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg ketamin och 12,5 mg/kg xylazine.
OBS: Andra bedövningsmedel kan användas, eller möss kan avlivas genom CO2 kvävning/livmoderhalscancer störning om levern snabbt avlägsnas för att förhindra hypoxi-inducerad skada. - Desinficera hudytor på möss genom vätning med en 70% etanollösning. Säkra möss på ryggen med alla extremiteter fästa på en dissekerande bräda.
- Gör ett vertikalt mittinsnitt i huden från basen av bukhålan till strax ovanför membranet.
OBS: Snitt mot extremiteterna görs för att underlätta indragning av huden. - Dra huden tillbaka medan du skär någon bindväv mellan huden och bukhålan. Förhindra att håret överförs till bukhålan så mycket som möjligt. Nåla fast eller kläm bort huden från bukhålan.
- Använd rena pincett och sax, öppna bukhålan och nedre brösthålan.
- Ta bort levern snabbt utan att skada loberna
- Med trubbiga verktyg (t.ex. platta fyrkantiga pincett), styr de övre leverloberna nedåt mot buken. Skär bindväv en kring de övre leverloberna med sax.
- Styr leverloberna uppåt mot membranet. Håll den centrala vaskulära bunten i levern med pincett.
OBS: Det påverkar inte proceduren om den centrala kärlbunten är skadad. - Dra den centrala vaskulära bunten bort från musen och skär den återstående bindväv, blodkärl, etc. för att ta bort levern. Var noga med att inte 1) skada leverloberna och 2) skuren i mag-tarmkanalen, eftersom detta kan förorena levern med mikroorganismer.
- Placera borttagen lever i en steril 10 cm vävnadkulturskålen halvfylld med iskall Krebs-Henseleit buffertlösning. Använd ett trubbigt instrument för att styra loberna, skär mitten av levern för att dela upp den i separata lober.
- Välj en leverlob (använd den största först), och placera den platt sida ner på en ny steril 10 cm maträtt. Förvara alla andra leverlober i skålen i Krebs-Henseleit buffertlösning lagras på is för senare användning.
- Trimma cirka 10% av materialet från den högsta kanten av leverloben medan liggande platt.
OBS: Trimning är viktigt, eftersom denna vävnadskant kommer att kontakta skärbladet först; Därför, en vävnad kant som är relativt vinkelrät mot skärbladet kommer att förhindra vävnad komprimering som kan uppstå på grund av grunda vinklar i den oklippta leverloberna. - Trimma de andra tre vävnadskanterna.
OBS: Detta tar bort en del av den fibrösa Glissonkapseln och kommer att underlätta separationen av vävnadsskivorna. - Montering av leverloben på provhållaren
- Placera ett tunt lager cyanoakrylatlim (superlim eller medicinskt/veterinärklasscyanoakrylatlim) på provhållaren mot framsidan, dimensionerat något större än den trimmade leverloben.
OBS: Kontrollera att cyanoakrylatlimmet inte innehåller icke-cyanoakrylattillsatser. - Plocka försiktigt upp leverloben med sterila pincett med hjälp av ett hörn bort från skäreggen, klappa sedan torka någon restbuffert från den platta sidan av leverloben med sterilt absorberande material.
- Placera den stora platta sidan av leverloben på cyanoakrylat limplåstret med den största kanten vänd mot framsidan. Låt den härda i luften i 1−2 min.
OBS: Cyanoakrylat lim bota snabbt (~ 2 min) som svar på kvarvarande fukt och vävnadproteiner, och de kommer att ordentligt fästa vävnaden till provhållaren.
- Placera ett tunt lager cyanoakrylatlim (superlim eller medicinskt/veterinärklasscyanoakrylatlim) på provhållaren mot framsidan, dimensionerat något större än den trimmade leverloben.
3. Produktion av leverskivor
- Placera provhållaren med den bifogade leverloben i vibratomebuffertfacket. Se till att leverloben är helt täckt av buffert.
OBS: Fyll på buffertlösningen Krebs-Henseleit om det behövs. Om buffertnivån skymmer skärprocessen, öka eller minska nivån. - Ställ in skärhastigheten.
OBS: Detta kan behöva bestämmas empiriskt beroende på vibratomemodellen och bladegenskaperna. Som startguide använder du en hastighet på 57 Hz/3 420 rpm. Vibratomehastigheten kan mätas med hjälp av ett ljudspektrum analysator program på en smartphone. - Sänk skärbladet tills det ligger precis ovanför leverloben med hjälp av höjdratten. Kör den vibrerande skärarmen över provet.
- Sätt tillbaka klingan med vevhandtaget bakåt. Aktivera vibrationerna när du returnerar bladet. När bladet har återlämnats och inte är ovanför provet, sänk bladhöjden med 250 μm.
- Upprepa skärprocessen tills vävnadens överdel tas bort. Kassera de första en eller två skivorna, eftersom dessa kommer att innehålla Glissons kapsel och därför inte innehåller mycket funktionell levervävnad jämfört med andra skivor.
- För att skära leverskivor, långsamt för auktorerande bladet i vävnaden genom att vrida handtaget. Använd en liten pensel (desinficeras med en 70% etanollösning) för att försiktigt styra vävnaden under skärprocessen.
- Använd penseln för att lyfta de skurna vävnadsskivorna och placera vävnadsskivan i ett sterilt rör av iskall Krebs-Henseleit-buffert. När det inte används, håll röret på is mellan skivor.
OBS: Ibland, vävnaden inte riva under styckningsprocessen, men för de flesta ändamål vävnaden är fortfarande användbar. - Upprepa skärprocessen tills basen av leverloben har uppnåtts. Kassera alla leverskivor som har synligt härdat lim.
OBS: Det härdade limmet syns som vita områden på vävnadsskivorna. En typisk leverlob kommer bara att ha en användbar tjocklek på ca 2 mm. Därför produceras endast omkring åtta 250 μm leverskivor från varje lob. - Skär vävnaden skivor tills nära cyanoakrylat lim. Skär inte i limmet.
- Upprepa hela processen med andra leverlober tills det erforderliga antalet vävnadsskivor erhålls.
- För att rengöra det härdade cyanoakrylatlimmet och vävnaden från provhållaren, använd antingen ett blad för att skrapa bort den härdade lim-/vävnadsblandningen, eller mjuka upp och rengör blandningen med aceton eller dimetylsulfoxid.
4. Vävnadskultur
OBS: Allt vävnadsodlingsarbete måste utföras i en steril laminär flödeshuva.
- I en vävnadskultur laminär akvarell, pipett 1 ml av Williams E-medium som innehåller 2,0 g/L glukos, 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 2 mM L-glutamin tillägg, 100 U/ml penicillin, och 100 μg/ml streptomycin i 12 väl vävnad kulturplattor.
OBS: Andra antibiotika och svampdödande medel kan också läggas till. Vissa studier har använt tillsatser i vävnadsinkubationsmediet (dvs. dexametason och insulin10),men dessa kan störa cellsignalering. - Placera röret som innehåller leverskivor från is i vävnadskulturhuven. För att ta bort vävnadsskivorna, snurra försiktigt blandningen och försiktigt tippa in i en steril 10 cm skålen medan du virvlar.
- Med sterila vassa pincett och en skalpell skär du vävnadsskivorna i ungefär enhetliga storlekar (t.ex. 15 mm2).
Obs: Det här steget utförs för att säkerställa en jämn yta. Eftersom muslever lober är betydligt olika i storlek och vissa vävnad skivor kommer att riva, kommer detta att producera en rad PCLS med varierande yta områden. PCLS slutliga ytområdesstorlekar beror på hur mycket material som behövs i efterföljande analysprogram och hur många replikat som behövs. Skära stora PCLS i mindre flera bitar av samma ungefärliga storlek kommer medfödd tillåta ett ökat antal experimentella replikat. - Använd sterila pincett eller en liten pensel, överför de skurna vävnadsskivorna till brunnarna på en 12 brunnsplatta som innehåller 1 ml medium.
OBS: Var noga med att bekräfta konsistensen av tjocklek och form av vävnadskivor. Avsnitt som är mörkare än genomsnittet tyder på att vävnadstjockleken är större och måste kasseras. Lättare skivor tyder på förekomsten av härdad cyanoakrylat lim och måste kasseras. - Inkubera levern skivor vid 37 °C och 5% CO2 under 95% luftfuktighet.
OBS: Andra grupper har använt metoder för att förbättra syretillförseln till PCLS, som verkar förlänga vävnadöverlevnadstiden6,,10,,11,,12,,13 (se diskussionsavsnitt). - Följande dag, ändra odlingsmediet med hjälp av en manuell pipett (snarare än sug) för att förhindra förlust av vävnad genom sugfel. Därefter ändra mediet på PCLS dagligen. PCLS är nu redo för experimentell användning.
5. Exempel på tillämpning av PCLS
- Vid 16 h efter generation, behandla PCLS med tre olika gallsyror: glykolsyra (GCA), taurocholic syra (TCA) och kolsyra (CA) (som natriumsalter, alla vid en koncentration av 150 μM) i 2 dagar.
- Efter 2 dagars gallsyrabehandling, extrahera mRNA genom att placera vävnadsskivor i iskalla RNA lysbuffert och snabbt homogenisera med pärlor med en bead homogenisator (Tabell över material).
- Rena RNA med hjälp av en RNA-isoleringsssats(Tabell över material)och skapa cDNA från det renade RNA.
- Utför kvantitativ polymeraskedjereaktion(Tabell över material)med hjälp av specifika grundfärger (tabell 1) på cDNA för att undersöka genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma cellens lönsamhet för PCLS över tiden mättes vävnadsATP-nivåerna. ATP-nivåer är vanligtvis proportionella mot lönsamheten. PCLS (ca 15 mm2 i område) odlades i normala Williams E medium med 10% FBS, sedan vid specifika tidpunkter, var leverskivor bort från vävnadkultur och homogeniserades med både ATP och protein (för normalisering) koncentrationer(Tabell över material) som mäts (figur 1A). För biokemiska analyser som denna, normalisering är viktigt, eftersom den skurna lever skivor är inte nödvändigtvis identiska i dimensioner. ATP-nivåer (i förhållande till protein) undertrycktes omedelbart efter isolering och efter 1 h (figur 1A), vilket tyder på kortsiktig metabolisk stress från kylning och skärförfaranden. Atp-nivåerna som återvunnits med 3 h. ATP-nivåer förblev dock förhöjda på upp till 5 dagars vävnadskultur, vilket tyder på ingen signifikant minskning av lönsamheten. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning av leverskivor föreslog att begränsad vävnadsnekros (kännetecknas av nukleär lungorfomism) inträffade i kultur från cirka dag 2 och 3. Vävnadsnekrosnivåerna utvecklades till allvarliga dag 5 (figur 1B). Med tanke på dessa morfologiska data, tillsammans med ATP-resultaten, rekommenderas att använda denna experimentella vävnadsmodell i upp till 3 dagar.
PCLS visade också ökande kollagen ackumulering vid senare kultur tidpunkter, vilket framgår av förtjockning av Picro-sirius röd-färgade kollagen fibrer på dag 5(Figur 2). Denna förtjockning av kollagenfibrer tyder på att spontana fibrogenic processer är aktiva i PCLS erhålls med denna metod. Denna process verkar oberoende av PCLS isolering metod ik med förtjockning av kollagenfibrer6 och profibrogenic gen uttryck14 förekommer från både vibratome och Krumdieck vävnad slicers, respektive över tiden. Utvecklingen av dessa spontana fibrogenic processer måste beaktas vid tolkningen av PCLS biologi, särskilt med experiment i samband med fibrotiska processer.
Vi har tidigare visat betydande induktion av cholangiocyte-specifika genconnexin 43 (Cx43) och utsönding av glutamyl transpeptidase (Ggt1) protein av TCA i PCLS9. Uttryck för cholangiocyte-specifika gener i förhållande till hushållningkontroller (glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas [Gapdh] och hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 [Hprt1]) i PCLS behandlade med TCA, GCA eller CA undersöktes av qPCR med hjälp av specifika primers. I enlighet med en tidigare rapport, en betydande induktion i uttryck för kolangiocyte-specifika gener cytokeratin 19 (CK19; Figur 3A) och connexin 43 (Cx43; Figur 3B) observerades av både GCA och TCA. Ggt1 uttryck ökades av både gallsyror; även om detta inte nådde statistisk signifikans, möjligen på grund av experimentell variation (figur 3C). Uttrycket av CA påverkades inte av någon gallsyra. Induktion av cholangiocyte-specifika gener tyder på att GCA kan också vara inblandade i kolestatisk leverskada, som tidigare rapporterats för TCA8,9.
Figur 1: Vävnadslönsamhet för precisionsskurna leverskivor (PCLS). (A)ATP- och proteinnivåerna i PCLS mättes omedelbart (T + 0) och vid 1 h, 3 h, 6 timmar och 1−5 dagar efter isolering. (B) För att undersöka cellmorfologi, PCLS var fast, paraffin-inbäddade, sektionerade, och färgade med H & E omedelbart (dag 0) och vid 1, 2 och 5 dagar efter isolering. Ett Kruskal-Wallis-test med Dunns test med flera jämförelser utfördes i förhållande till T + 0. Alla data representeras som medelvärde ± SEM (n = 2−3 möss) med *p < 0,05. Skalstrecken representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedömning av collagenedfall i PCLS. PCLS var fasta, paraffin-inbäddade, avsnittade, och färgade med Picro-Sirius Red att visualisera kollagen fibrer på dagar 0, 1, 2 och 5 efter isolering. Skalstrecken representerar 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gallsyror inducerar kolangiocytespecifikt genuttryck. Vid 16 h post-isolering ändrades medium på PCLS, och nytt medium tillsattes tillsammans med 150 μM glykolsyra (GCA), taurocholic (TCA) eller cholic (CA) syror (natriumsalter). PCLS skördades efter 2 dagar, och uttryck för cytokeratin 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B), och γ-glutamyl transpeptidase 1(Ggt1; C) undersöktes i förhållande till det geometriska medelvärdet av Gapdh och Hprt1. Dunnetts flera jämförelsetest utfördes i förhållande till obehandlade kontrollvävnadsskivor (n = 15). Alla data representeras som medelvärde ± SEM (n = 4 möss, treektsegment; *p < 0,05, **p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: qPCR primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet visar tillämpningen av murine PCLS isolering och vävnad kultur, och förfarandena är utformade för att bedöma både lönsamhet och nytta samt undersöka effekterna av exogena medlare av lever patobiologi med hjälp av biokemiska analyser, histologi och qPCR. Den experimentella nyttan av PCLS-vävnadskultur hos gnagare och människor har visats i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive experimentella undersökningar i microRNA15/RNA9/protein uttryck16, metabolism17, viral infektion dynamik10,,18, infektion signalering19, tumör invasion12, toxicitet studier4,13,15,20, DNA-skador studier21, cellbiologi14, och sekretstudier9.
Medan ATP nivåer indikerar cellulär lönsamhet i PCLS upp till 5 dagar i kultur, H & E färgning tyder på att svår nekros inträffade med 5 dagar i kultur. Den viktigaste faktorn som verkar begränsa lönsamheten för PCLS är syre tillgänglighet6,11. Flera studier har inkluderat förbättrad syretillgänglighet och därmed ökat lönsamhetstiden för PCLS i vävnadskultur. Metoder som används för att öka syretillgängligheten inkluderar inkubationstid av vävnad i syrerika atmosfärer10,,11, användning av syrebäraren perfusion perfluorodekalin12, skakar/rullande kulturen under inkubationstiden6,,10,,13, och vävnadsodlingsplattor som är utformade för att maximera syresättningen6.
Nyligen har ett innovativt luftflytande gränssnitt vävnad smittar system beskrivits med funktionell nytta anges på längre än 7 dagar i kultur14. Detta protokoll använder omgivande atmosfäriskt syre i en normal vävnad kultur inkubator. Metoden gör det möjligt för PCLS att vara tillgänglig för laboratorier som inte har mycket specialiserad, anpassad utrustning för att säkert förbättra syretillförseln. Men om sådana metoder för att förbättra syretillförseln finns tillgängliga, kan de förbättra långsiktig PCLS lönsamhet i kulturen.
Ansamling av kollagen i PCLS efter dag 3 i kultur tyder på att spontana fibrogenic processer är aktiva inom denna modell. Spontan fibros har också observerats tidigare i PCLS6,14,22,23,24 och är eventuellt medierad av skadeassocierade molekylära mönster (BUP) som frigörs av skärprocessen eller vävnadnekros. DAMMSPS fungera som signalering molekyler som därefter aktivera pro-fibrotic signalering vägar25,26. Dessutom kan spontan fibros i PCLS medieras av kemokiner som frigörs från aktivering av stellate celler och/eller Kupfferceller (dvs. omvandla tillväxtfaktor beta [TGF-β]). I detta sammanhang, en nyligen publicerad artikel av Bigaeva et al.24 tyder på att spontanfibros i PCLS delvis medieras av TGF-β signalering, som inkubation av PCLS med TGF-β hämmare Galunisertib hämmade genuttryck förändringar i samband med spontanlever fibros. En annan möjlig mekanism är att skivningsproceduren initialt inducerar cellspridningssignaleringsvägar och inmatning av hepatocyter i cellcykeln. Denna mekanism misslyckas dock och resulterar i cellcykelgripande i mitten av G1 fas27. Cell cykel gripandet är associerad med lever fibros snarare än lever förnyelse28.
I det representativa experimentella förfarandet behandlas PCLS med tre olika gallsyror (GCA, TCA och CA) i 2 dagar för att simulera kolestatisk leverskada. Två av gallsyrorna (GCA och TCA) inducerar betydande uttryck för CK19 och Cx43, som är gener som är associerade med cholangiocyte-funktionen. Detta tyder på expansion eller differentiering av celler mot en cholangiocyte härstamning i PCLS behandlas med dessa gallsyror. Detta är förenligt med vårt tidigare arbete som visar en liknande effekt med Hjälp av TCA9 på PCLS. Dessutom är det också förenligt med in vivo observationer som visar utfodring taurocholate till råttor ökar cholangiocyte nummer29. Behandlingen av levervävnad skivor med gallsyror simulerar lever kolestas, och det spekuleras att ökningen av uttrycket av gener som är associerade med cholangiocyte funktion är ett försök av levervävnaden att skapa ytterligare gallgångarna för att öka gallsekretion. Med tanke på den specifika induktionav dessa gener produceras av de konjugerad gallsyror (GCA och TCA) men inte unconjugated CA, det misstänks att dessa effekter medieras av sfingosin-1-fosfat receptor 2, en cell yta receptor med förmånsaktivering av konjugerade gallsyror30.
En viktig begränsning av tillämpningen av PCLS är individuell replikatvariabilitet. Eftersom levern inte är homogen och det finns variation i produktionen, leverskivor tenderar att ha större biologisk variation än cellkultur experiment. I experimentella studier med få variabler, såsom det representativa förfarande som visas ovan, övervinns detta med hjälp av ett ökat antal replikat. Detta kan dock bli ett problem för större screeningstudier. Sammanfattningsvis är det beskrivna protokollet en enkel och tillförlitlig metod för att studera aspekter av leverpatobiologi ex vivo, som kräver lite specialiserad utrustning med undantag för vibratomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsanslag från National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (Grant No. APP1048740 och APP1142394 till G.A.R.; APP1160323 till J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm stöds av en Senior Research Fellowship från NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo stöddes av TALENTO-programmet i Madrid, Spanien (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
