Summary
Zebrafisk xenograft modeller giver mulighed for høj-throughput narkotika screening og fluorescerende billeddannelse af menneskelige kræftceller i en in vivo mikromiljø. Vi udviklede en arbejdsgang for storstilet, automatiseret lægemiddelscreening på patientafledte leukæmiprøver i zebrafisk ved hjælp af en automatiseret fluorescensmikroskopudstyret billedenhed.
Abstract
Patient afledte xenograft modeller er afgørende for at definere, hvordan forskellige kræftformer reagerer på narkotikabehandling i et in vivo-system. Musemodeller er standarden på området, men zebrafisk har vist sig som en alternativ model med flere fordele, herunder evnen til høj-throughput og billig narkotika screening. Zebrafisk også give mulighed for in vivo stof screening med store replikat numre, der tidligere kun var opnåelige med in vitro-systemer. Evnen til hurtigt at udføre store narkotika skærme kan åbne mulighed for personlig medicin med hurtig oversættelse af resultater tilbage til klinikken. Zebrafish xenograft modeller kunne også bruges til hurtigt at screene for handlingsrettede mutationer baseret på tumor respons på målrettede behandlinger eller til at identificere nye anti-cancer forbindelser fra store biblioteker. Den nuværende store begrænsning på området har været kvantificering og automatisering af processen, således at narkotika skærme kan gøres på en større skala og være mindre arbejdskrævende. Vi har udviklet en arbejdsgang for xenografting primære patientprøver i zebrafisklarver og udfører store narkotikaskærme ved hjælp af en fluorescensmikroskop udstyret billedenhed og automatiseret sampler enhed. Denne metode giver mulighed for standardisering og kvantificering af engrafted tumor område og reaktion på narkotikabehandling på tværs af et stort antal zebrafisk larver. Samlet set er denne metode fordelagtig i forhold til traditionel cellekultur stof screening, da det giver mulighed for vækst af tumorceller i en in vivo miljø i hele narkotikabehandling, og er mere praktisk og omkostningseffektiv end mus til store in vivo narkotika skærme.
Introduction
Xenografting af primære patient kræftformer eller menneskelige kræft celle linjer i model organismer er en udbredt teknik til at studere tumor progression og adfærd in vivo, tumor respons på narkotikabehandling, og kræft celle interaktion med mikromiljøet, blandt andre. Traditionelt er celler xenografted i immun-kompromitterede mus, og dette er fortsat standardi marken. Men, denne model system har flere begrænsninger, såsom høje omkostninger, lave replikat numre, vanskeligheder med præcist at kvantificere tumor byrde in vivo, og den forlængede tid, det tager for tumorer til engraft og drug test, der skal udfyldes. I de seneste år har zebrafisk vist sig som en alternativ xenograft model, med den første er rapporteret i 2005, med grønne fluorescerende protein (GFP)-mærket menneskelige melanom cellelinjer transplanteret i blastula-trins embryoner1,2. For nylig, 2 dag post-befrugtning (dpf) zebrafisk larver er blevet brugt som xenograft modtagere til at give mulighed for kontrol af anatomiske placering af injektion og til brug i høj opløsning in vivo billeddannelse af tumor interaktion med det omgivende mikromiljø3,4.
Zebrafisk tilbyder mange fordele som en xenograft model. For det første kan voksne zebrafisk opstaldet og hurtigt opdrættet i store mængder til en forholdsvis lav pris. Hvert parringspar voksne zebrafisk kan producere hundredvis af larvefisk om ugen. På grund af deres lille størrelse, kan disse larve zebrafisk opretholdes i 96-brønd plader til høj-throughput narkotika screening. Larver behøver ikke at blive fodret i løbet af en typisk xenograft eksperiment, som deres æggeblomme-sæk giver næringsstoffer til at opretholde dem for deres første uge af livet. Desuden har zebrafisk ikke et fuldt funktionelt immunsystem før 7 dpf, hvilket betyder, at de ikke kræver bestråling eller immunsuppressive regimer før injektion af xenograft. Endelig optisk klare zebrafisk linjer giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af tumor-mikromiljø interaktioner.
Måske den mest lovende anvendelse af zebrafisk som en xenograft model er evnen til at udføre høj-throughput narkotika screening på menneskelige kræftprøver på en måde, der ikke er muligt ved hjælp af nogen anden model organisme. Larver absorberer lægemidler fra vandet gennem huden, hvilket øger brugervenligheden af administration af lægemidler5. Da dyr holdes i 96 brøndplader, typisk i 100−300 μL vand, kræver skærme mindre lægemiddelmængder sammenlignet med mus. I øjeblikket er der flere forskellige metoder til standardisering og kvantificering af virkningen af lægemidler på menneskelige tumor byrde i zebrafisk, hvoraf nogle er mere praktisk end andre til opskalering enkelt drug test til høj-throughput screening. For eksempel, nogle grupper adskille fisk i enkelt celle suspensioner, og kvantificere fluorescerende mærket eller farvede tumorceller ved billeddannelse individuelle dråber af suspensionen og kvantificere fluorescens ved hjælp af en semi-automatiseret ImageJ makro4. En semi-automatiseret hellarver imaging metode blev udviklet, hvor larve fisk blev fastsat i 96-godt plader og afbildet ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop før justering af sammensatte billeder og kvantificering af tumor celle foci6. Begge disse analyser er temmelig arbejdskrævende metoder til kvantificering, som har gjort virkelig høj-throughput narkotika screening i zebrafisk xenograft modeller upraktisk.
Dette problem er blevet løst ved udviklingen af hvirveldyr automatiseret screening teknologi (VAST) Bioimager og Large Particle (LP) Sampler, en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed (Figur 1 og Tabel af materialer), som er en virkelig automatiseret metode til høj-throughput imaging af zebrafisk larver7,8,9. Med denne enhed, er fisk bedøvet, stikprøven automatisk fra en 96-godt plade, placeret i en kapillær og roteret ind i den indstillede orientering baseret på en forudindstillet bruger præference, afbildet, og derefter enten placeret tilbage i samme brønd af en ny 96-godt plade til yderligere undersøgelser eller kasseres. Ved at kombinere denne billeddannelse teknologi med zebrafisk xenografts kan give mulighed for personlig medicin, der bruger høj-throughput narkotika screening af store stof sammensatte biblioteker mod individuelle patient tumorer. Zebrafisk xenografts tilbyder også en storstilet og billig metode til at teste både toksicitet og effekten af nye forbindelser in vivo. Zebrafisk kan bruges som et indledende screeningstrin, før du fortsætter til musexenograftmodeller.
Vi har udviklet en strømlinet arbejdsgang for xenografting primære patient leukæmiceller i zebrafisk og udfører lægemiddelskærme med høj gennemløb med automatiseret billeddannelse og kvantificering, som kan anvendes på alle andre primære patienttumorceller eller kræftcellelinje. Denne arbejdsgang udnyttede en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed til at forbedre den nuværende standardisering og kvantificering metoder og tilbyder et automatiseret alternativ til tidligere, mere arbejdskrævende metoder til kvantificering tumormasse in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (protokol 2015-2225). Patientprøver blev indsamlet under University of Kentucky's Institutional Review Board (protokol 44672). Alle dyreforsøg, der udføres efter denne protokol, skal godkendes af brugerens institutionelle dyrepleje- og brugskomité.
1. Optøning primær patient akut lymfoblastær leukæmi celler
- Optø primære patient perifere blod mononukleare celler (PBMC) fra frosne lager i en 37 °C vandbad. Umiddelbart efter at cellerne er optøet, overføres celler i deres frysende medier (90% FBS + 10% dimethylsulfoxid [DMSO]) til et konisk 15 ml rør med langsom pipettering, så luftbobler undgås. Der tilsættes 10 ml forvarmede 37 °C optøningsmedier (25% føtal kvægserum [FBS] i Iscoves modificerede Dulbeccos medium [IMDM]) dråbevis (ca. 2-3 s pr. ml) til cellerne i det koniske 15 ml rør.
BEMÆRK: PBMC'er blev indsamlet fra patientblodprøver på diagnosetidspunktet. Den buffy pels blev adskilt af tæthed centrifugering og celler blev vasket 2x i RPMI 1640 + 10% FBS. Celler blev talt og 107 celler blev frosset pr. kryovial i 1 ml frysende medier og opbevaret ved -80 °C. - Cellerne centrifugeres ved 100 x g i 10 min og aspiratmedier fra cellepellet. Gentag tilsætning af optøningsmedier, centrifugering og aspiration en ekstra gang for at fjerne eventuel resterende DMSO.
- Resuspender celler i 5 ml fosfat-buffered saltvand (PBS) og fjern 10 μL for at regne med en automatiseret celletæller eller hæmocytometer. Der tilsættes 10 μL trypanblå til 10 μL celler, der fjernes til tælling. Tæl antallet af celler pr. ml, og optag for senere at beregne den mængde, der skal genopslælse celler i til xenografting (se trin 2.5).
BEMÆRK: Typisk er 500 celler xenografted pr larve zebrafisk. For eksempel er 5 x 105 celler nødvendige for at injicere 1.000 zebrafisk. Levedygtighed bør være >85% til brug for xenografting. I dette eksperiment var cellelevedygtigheden 96% efter optøning, vurderet ved trypanblå farvning.
2. Fluorescerende mærkning celler med DiI
- Det ønskede cellenummer centrifugeres i 5 ml PBS ved 200 x g i 5 min. og aspiratsupernatant. Plettemindst 2 x 106 celler i tilfælde af sammenklumpning eller problemer med at indlæse nålen under injektionen.
- Der fremstilles 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) farvningsopløsning (5 ml PBS indeholdende 4 μL dii-plet, materialetabel)og suspenderer cellepelleten i farvningsopløsningen.
BEMÆRK: Celletætheden må ikke overstige 2 x 106 celler/ml, når den opslæmnes i farvningsopløsningen. - Inkuberceller ved 37 °C beskyttet mod lys i 20 min, vortex forsigtigt, derefter inkubere celler på is i 15 minutter beskyttet mod lys.
- Celler centrifugeres ved 200 x g i 5 min og aspirer supernatant. Celler vaskes med 5 ml PBS, centrifugeres ved 200 x g i 5 min og aspireresupernatant. Gentag vask, centrifugering, og aspiration en ekstra gang.
- Resuspender celler i 1 μL PBS pr. 250.000 levende celler og overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold genopslæmtede celler på is i mørke og straks fortsætte med at mikroinjektioner.
BEMÆRK: Dette sikrer, at 500 patientceller sprøjtes ind i zebrafisken med hver indsprøjtningspumpe på 2 nL volumen.
3. Mikroindsprøjtning zebrafisk larver
BEMÆRK: Mikroinjektioner skal udføres inden for 1-3 timer efter farvning for at forbedre cellernes levedygtighed.
- Før farvning celler og injektion, gøre agarose plader til injektion ved at hælde 25 ml 3% agarose i 1x Tris / borat / EDTA (TBE) i en petriskål og lad det størkne. Pladerne opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Også før farvning celler og indsprøjtning, dechorionate 2 dpf zebrafisk ved hjælp af pincet under en dissekere mikroskop. For manuel dechorionation, træk fra modsatte ender af den beskyttende chorion af zebrafisk med pincet, indtil chorion tårer og zebrafisk bliver unenveloped10.
BEMÆRK: Dekorionation kan også udføres ved hjælp af enzymatisk behandling med pronase, som tidligere beskrevet10. Casper (roy-/-;nacre-/-) zebrafisk blev anvendt til disse forsøg11. Enhver zebrafisk larve stamme kan bruges til xenografting. Hvis pigment forstyrrer billeddannelse eller visualisering, propylthiouracil (PTU) behandling kan bruges til at blokere melanin syntese, hvis optisk klare zebrafisk stammer ikke er tilgængelige12. - Prechill nåle ved 4 °C eller på is for at forhindre sammenklumpning af celler under mikroinjektion. Der indlæsser 5 μL farvede celler i en kølet nonfilamentous borosilikatglasnål ved hjælp af mikroloaderpipettespidser.
BEMÆRK: Mikroinjektor- og nåleopsætningsmetoder er tidligere blevet offentliggjort13. - Læg nålen i mikroinjektorens arm. Vip kanylspidsen med et sterilt barberblad. Mål dråbestørrelsen i mineralolie ved hjælp af et fasemikrometer, og hold dråbevolumen konstant på 2 nL (~0,15 mm i diameter) hele vejen igennem.
- Brug 350 μL 4 mg/ml tricaine-S til at bedøve ~ 30 dechorionated 2 dpf zebrafisk i en petriskål indeholdende 25 ml E3 medier. Efter ~ 1 min overførsel bedøvet larver til en flad overflade injektion plade (3% agarose i en petriskål) og injicere larver med en pumpe af farvede celler på det ønskede injektionssted (f.eks æggeblomme eller hjertesækken; se figur 2A, B).
BEMÆRK: Injektionsstedet bør vælges ud fra målet med forsøget. Det mest almindelige injektionssted er æggeblomme. For at få celler i omløb i blodbanen, perikardiet, kanalen af Cuvier, perivitelline plads, eller retro-orbital plads kan bruges som injektionssteder. Ortotop injektionssteder kan også bruges, såsom hjernen. - Larverne vaskes af injektionspladen i en 10 cm2 petriskål (30 larver pr. plade), der indeholder E3-mediet14 uden methylenblåt og inkuberes ved 28 °C i en restitutionsperiode på 1 time. Fortsæt injektionen, indtil der er injiceret et ønsket antal larver.
BEMÆRK: Ideelt set injicere 2−2,5-fold antallet af larver er nødvendige for eksperimenter. Der vil være nogle die-off af larver på grund af stress fra injektion og den øgede inkubationstemperatur. Typisk kan 800−1.500 zebrafisklarver injiceres af en enkelt person inden for 1-3 timer, når farvede celler injiceres efter praksis med teknikken. - Plader af indsprøjtet larver flyttes til en 34 °C-inkubator. Stenskålene af larver må ikke placeres direkte på en metalhylde i rugemaskinen for at undgå overophedning af E3-vandet. For eksempel placere en tom petriskål mellem hylden og petriskål af larver til at fungere som en buffer. Døde zebrafisklarver fjernes efter 24 og 48 timer efter injektionen (hpi).
4. Opsætning Drug Screen med Xenografted Zebrafish
-
Ved 48 hpi, skærmen zebrafisk larver for fluorescens / tumor engraftment og sundhed(Figur 2C,D). Døde eller misdannede zebrafisk fjernes, og zebrafisk vælges med lignende engraftment(figur 2C,D, 1−3 og 1'−3'). Zebrafisk uden podning(figur 2C,D, 5 og 5').
- For blommeinjicerede fisk fjernes fisk, hvor æggeblommens grænser ikke kan ses omkring enpodet cellemasse(figur 2C, 4), da det gør kvantificering vanskelig. For pericardiuminjicerede fisk fjernes fisk, hvor indsprøjtet cellemasse griber ind i blommesækken (figur 2D, 4').
- Tilføj zebrafisk til en 96-brøndplade. For at gøre dette skal du skære spidsen af en 200 μL pipettespids, der er lige stor nok til, at en 4 dpf zebrafisk kan komme igennem. Aspirer 150 μL E3-medier med en zebrafisk fra pladen ved hjælp af en P200 pipette, og tilsæt en tom brønd af en flad bund 96-brøndplade.
- Fortynd det lægemiddel, der skal testes i den ønskede mængde E3-medier, ved 150 μL pr. brønd. Forbered stof ved 2-fold den ønskede koncentration. For eksempel forberedes 20 μM lægemiddel i E3, hvis den ønskede endelige koncentration er 10 μM, da halvdelen af den samlede mængde i hver brønd består af lægemiddelopløsningen. For DMSO kontrolgruppen, tilføje DMSO på samme volumen som stoffet.
- Der tilsættes 150 μL 2x fortyndet lægemiddelopløsning til hver brønd, der indeholder zebrafisklarver i 150 μL E3, til et endeligt volumen på 300 μL med 1x lægemiddelopløsning pr. brønd.
- Pladen inkuberes ved 34 °C. Tjek for døde zebrafisk dagligt. Efter 2 dage, hvis det ønskes, genopfriske lægemidlet ved at fjerne 200 μL væske fra hver brønd af 96-brøndplade og erstatte med 200 μL 1x fortyndet lægemiddelopløsning eller DMSO i E3-medier.
BEMÆRK: De bedste resultater blev fundet efter 3 dages narkotikabehandling for dette eksperiment; Længden af narkotikabehandlingen kan dog variere mellem 2−4 dage og skal muligvis optimeres baseret på det eksperiment, der udføres, eller lægemidler, der anvendes.
5. Imaging Xenografted Zebrafish Brug af en fluorescens mikroskop udstyret Imaging Unit og automatiseret sampler enhed
- Der fremstilles 1 L frisk 4 mg/ml tricain og 1,5 L e3-medier. Fyld medieflaske 1 med E3-medie- og medieflaske 2 med tricain.
- Fjern alle uønskede fluorescerende kanaler i billedbehandlingssoftwaren, og tilføj den ønskede kanal (DiI til dette eksperiment). Kontroller den ønskede fluorescerende kanal, da et billede kun tages for kanalerne med en markering. Vælg også, hvordan billederne skal tages (z-stakke, automatisering, sløjfer i serier osv.).
BEMÆRK: Til dette eksperiment blev fokus manuelt indstillet for hver fisk afbildet for at opnå det højeste antal billeder med optimal fokus. - Image DMSO kontrol fisk før narkotika-behandlede fisk, således at den passende eksponeringstid kan indstilles i billeddannelse software. Når eksponeringen er indstillet, må eksponeringstiden ikke ændres under hele forsøget.
BEMÆRK: Fokus kan enten justeres manuelt for hver zebrafisk for at sikre, at der ikke er ude af fokus billeder, eller for fuldt automatiseret billeddannelse, kan det samme fokus bruges mellem fisk med ude af fokus billeder, der kasseres eller fisk reimaged før du udfører analyse. Desuden kan dette eksperiment udføres ved hjælp af en fluorescerende imager efterfulgt af kvantificering af fluorescens ved hjælp af ImageJ software.
6. Kvantificering af fluorescens ved hjælp af ImageJ
- Åbn ImageJ-software.
-
Gå til Fil | Åbn og vælg den ønskede .czi-fil. Softwaren vil opdrage en import muligheder vindue.
- Hvis du vil have vist stakvisninger , skal du vælge Hyperstacks, markere Åbn filer enkeltvis, kontrollere Automatisk skaleringog kontrollere Opdelte kanaler. Vælg Farveiseretfor farveindstilling .
- Klik på Plugins | Makroer | Optag.
- Klik på Billede | Juster | Tærskel. Vælg billedtype som rød i rullemenuen i højre side af tærskelvinduet. Juster minimumstærsklen, indtil softwaren kun fremhæver områder med fluorescens (Figur 3A), og klik på Anvend. Softwaren vil konvertere billedet til sort og hvid, med det valgte område i sort.
BEMÆRK: Brug den samme tærskel for hvert billede i stoffet skærmen for at holde resultaterne standardiserede og sammenlignelige. - Klik på Analysér | Mål. Softwaren vil trække op et resultatvindue, der indeholder fluorescerende område for dette billede.
- Klik på Opret i vinduet Makrooptager. Dette åbner et nyt vindue med koden for makroen. Fremhæv alle de ønskede billeder til analyse og åbn som i trin 6.2.
- Vælg Kør i vinduet med makroen. Resultatvinduet indeholder nu området for hvert billede.
BEMÆRK: Billedanalysen kan udføres individuelt uden at optage og afspille en makro samt ved at gentage ovenstående trin for hvert billede. - Kopiér de målte data til et regneark. Gennemsnit den samlede fluorescens af alle kontrolprøver (DMSO). Beregn procentforskellen ved hjælp af følgende formel: –[(gennemsnitligt DMSO-område – forsøgsområde)/gennemsnitligt DMSO-område] x 100 % (Figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den ovenfor beskrevne protokol blev zebrafisk xenografted i æggeblomme og perikardiet med primær patient PBMC'er, der oprindeligt var isoleret fra en T-celle akut lymfoblastær leukæmi (T-ALL) patient ved diagnosen og bankede som en levedygtig, frossen prøve. Ved 48 hpi blev xenografted fisk screenet for fluorescerende mærkede tumorceller (Figur 2C,D) og behandlet med kemoterapi (dexamethason eller vincristin) eller DMSO. Fisk blev afbildet ved 7 dpi, efter 3 dage på narkotikabehandling ved hjælp af en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed (Figur 3A).
Den fluorescerende område / tumor byrde blev målt for hver fisk afbildet ved hjælp af ImageJ og sammenlignet mellem de forskellige narkotikabehandling grupper og DMSO (Figur 3B). Samlet set viste xenografted fisk behandlet med vincristin det største og mest konsekvente fald i xenografted cellemasse sammenlignet med DMSO-behandlede fisk. Dexamethason behandlede fisk viste omkring halvdelen af reduktionen i tumorområde i forhold til vincristin, men stadig viste en reduktion i tumor område i forhold til DMSO (Figur 3). Dette efterlignede, hvad der blev set hos patienten, da deres leukæmi hurtigt reagerede på behandling med en kombination af dexamethason og vincristin. Disse resultater viser, at zebrafiskxenograftmodeller er i stand til at være modtagelige for lægemiddelscreening og automatiseret billeddannelse og kvantificering, hvilket giver en platform til test af forskellige patientprøver eller cellelinjer med forskellige lægemidler eller lægemiddelkombinationer.
Figur 1: Xenograft narkotika skærm og billedbehandling workflow. Skematisk af arbejdsgangen for xenografting zebrafisk larver og udfører narkotika skærm, herunder billeddannelse på en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Injektionssted og repræsentative billeder af screening xenografted fisk. Billeder af mikroinjektornålen på injektionstidspunktet i enten blommen (A) eller perikardiet (B) af 2 dpf zebrafisklarver. Repræsentative billeder af screening på 2 dpi skildrer udvælgelsen af zebrafisk til narkotika skærm (C,D). Zebrafisk med lignende engraftment (1−3 og 1'−3') bør vælges, og ikke-podede zebrafisk (5 og 5') skal fjernes. For blommeinjicerede fisk fjernes fisk, hvor æggeblommens grænser ikke kan ses omkring enpodet cellemasse (4), da det gør kvantificering vanskelig. For pericardiuminjicerede fisk fjernes fisk, hvor indsprøjtet cellemasse griber ind i æggeblommesækken (4'). Skalabar = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Narkotikabehandling kan reducere xenografted tumor område in vivo. Repræsentative billeder af zebrafisk injiceret i perikardiet eller æggeblomme efter 3 dages behandling med DMSO eller narkotika, enten vincristin eller dexamethason. Arealet af engrafted tumor masse blev kvantificeret ved at fastsætte en fluorescens tærskel ved hjælp af ImageJ, vælge alle pixels over den fastsatte tærskel, og måle området og gennemsnitlige fluorescens af de udvalgte regioner. Pixel over den valgte tærskel vises i sort, mens pixel under tærsklen vises med hvidt. Pixels blev målt i både æggeblomme og pericardium injiceres zebrafisk billeder (A). Behandling med vincristin førte til et fald i engrafted tumor område i forhold til DMSO kontrol med n = 4 fisk behandlet pr gruppe (B). SD = standardafvigelse. Skalabar = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse viste vi en standardiseret metode til optøning og injektion af primære patientleukæmiceller i zebrafisk som en xenograftmodel. Vi har også etableret en protokol for høj-throughput narkotika screening af xenografted zebrafisk ved hjælp af en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed. Tidligere, xenografts er blevet rapporteret med menneskelige cellelinjer, og kvantificering af xenografted tumorer i en høj-throughput måde har været en udfordring i marken. Denne metode tjener som grundlag for undersøgelser for at udnytte en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed som en måde at automatisere billeddannelse af xenografted zebrafisk, med det endelige mål at udføre høj-throughput narkotika skærme til at forudsige, hvilke lægemidler en bestemt patients kræft kan reagere på, hvilket åbner mulighed for mere personlig medicin.
På trods af evnen til at automatisere meget af denne protokol, er der stadig mange tekniske udfordringer, som ikke bør overses. For det første er det afgørende, at celler injiceres i zebrafisk så hurtigt som muligt efter farvning for at forhindre cellesammenklumpning og celledød. Larver skal dechorioneret, før cellen farvning protokol. Nåle til glasglødetråd en skal også holdes kolde, før nålen pålastes, for at reducere tilstopning af nålen. Derudover er det afgørende at bruge embryoner produceret af sunde voksne zebrafisk i alderen 6 måneder til 1 år for at sikre den bedste levedygtighed af xenografted larver. Endelig, xenografted fisk bør omhyggeligt screenes for tumor engraftment, og kun dem med lignende tumor mængder bør anvendes i narkotika screening for at reducere variabilitet i de endelige resultater.
Selv om vi brugte primær patient leukæmi PBMC'er til vores eksperimenter, denne protokol kan udføres med enhver tumor type eller kræft cellelinje. For cellelinjer i kulturen skal hængende celler prøves og derefter vaskes i PBS, før der fortsættes med farvningsprotokollen. Det er også vigtigt at bemærke, at podningsraten kan variere fra den ene prøve til den næste og mellem prøvetype15. For eksempel, i vores PBMC prøve, > 90% af cirkulerende PBMCs var leukæmiske blaster, men dette tal kan variere betydeligt fra den ene patient til den næste, hvilket kan påvirke engraftment sats. Da resultaterne sammenlignes med en DMSO-kontrol inden for samme prøvetype, er der en intern kontrol for engraftmentrate, men denne variation bør tages i betragtning, når det besluttes, hvor mange celler der skal injiceres pr. zebrafisk. Vi har fundet succes, når vi bruger 250−1.000 celler injiceret pr. dyr, og 500 er optimale til vores undersøgelser. Mens vores eksperimenter konkluderede, da larver var 7 dpf, ville vi ikke forvente xenografts at overleve i dyrene i længere tidspunkter, som immunsystemet begynder at udvikle sig på dette punkt, og vil sandsynligvis medføre afvisning af menneskelige celler. Immune kompromitteret zebrafisk linjer er blevet skabt, med prkdc-/-;il2rga-/- zebrafisk i stand til at indpode humane kræftceller16,17, som kan være nyttige for længere sigt xenografts eller vurdere tumor gentagelse efter narkotikabehandling. Disse immundefekte linjer skal dog vedligeholdes som heterozygoter, så larver skal genotyped før brug. Homozygotfisk skal også behandles med lægemidler til at nedbryde makrofager for at muliggøre pålidelig engraftment af humane celler, hvilket kan komplicere resultaterne af lægemiddelscreeningen. I øjeblikket er disse linjer hverken praktiske eller nødvendige for storstilet lægemiddelscreening på larver, som kan fuldføres, før immunsystemet er fuldt funktionsdygtigt ved 7 dpf18.
Vores repræsentative resultater fokuserer på injektion af celler i perikardiet og æggeblomme for nem og hurtig injektion og øget levedygtighed; dog, kræftceller kan injiceres i mange andre anatomiske steder, og vi har haft succes ved hjælp af denne arbejdsgang på andre steder, herunder kanalen af Cuvier, hjerne, retro-orbital, og perivitelline sæk. Derudover er det vanskeligt at vurdere, hvor meget af hvert lægemiddel larven fisk absorbere; hvis der kun anvendes få lægemidler, vil der ideelt set blive udført en toksicitetsskærm ved en række doser (normalt 0,1 til 25 μM) før den store analyse for at bestemme den maksimale tolererede dosis (MTD). Vi valgte at bruge MTD for hvert lægemiddel til vores analyse, men 10 μM af narkotika er almindeligt anvendt i zebrafisk området som en startkoncentration for høj-throughput narkotika screening og er generelt veltolereret. Kombinationer af lægemidler i puljer kan bruges som en indledende skærm, samt, at øge effektiviteten af screening gennem en stor volumen sammensatte bibliotek19.
Selv om denne tilgang er mere automatiseret og effektiv end tidligere rapporterede arbejdsgange, er dette stadig en arbejdskrævende og teknisk udfordrende protokol for alle uden forudgående erfaring med mikroindsprøjtning af zebrafisk. Drug screening i zebrafisk xenografts er usandsynligt, at nogensinde nå den lethed og effektivitet in vitro screening af sammensatte biblioteker og mangler nogle fordele ved mus xenograft modeller. For eksempel er en stor begrænsning med zebrafisk xenografts, at kræftceller ikke let kan hentes fra fisk efter xenografting på nyttige tal for cellebankvirksomhed eller de fleste downstream-eksperimenter. Selv hvis dette var muligt, de menneskelige kræftceller ville have været stigende i flere dage i ikke-fysiologiske temperaturer og miljøer og ville ikke være praktisk til brug i senere applikationer. Virkningerne af en lidt lavere end fysiologiske temperatur på narkotika kinetik og tumor celle respons er heller ikke kendt, og kan producere forvirrende resultater. På trods af disse forbehold udfylder zebrafisk xenografts et tomrum ved at være en mere praktisk og omkostningseffektiv metode til at udføre større in vivo-lægemiddelskærme, end det er muligt i musexenograftmodeller. Derudover kræver zebrafiskxenografter langt færre celler til injektion end musemodeller, så en lille mængde patientprøve kan spredes blandt hundreder til tusinder af zebrafisk, hvilket giver mulighed for lægemiddelskærme med store prøvenumre. Med fluorescerende mærkning, kan tumorceller overvåges fra det øjeblik, de er xenografted i larve zebrafisk, giver en vis standardisering mellem de dyr, der anvendes i narkotika skærme. Ved at kombinere disse fordele ved zebrafisk xenografts med mulighed for automatiseret billeddannelse og kvantificering af podede celler åbner op for mange muligheder for at gøre høj-throughput narkotika screening af patient tumorer til personlig medicin en realitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af en V Foundation V Scholar Award og NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (til J.S. Blackburn) og NIH Training Grant T32CA165990 (til M.G. Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
