Summary
Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.
Abstract
החולה הנגזרים מודלים מבע הם קריטיים בהגדרת איך סרטן שונים להגיב לטיפול בסמים ב vivo system. מודלים של עכברים הם תקן בתחום, אבל דג זברה התפתחה כמודל אלטרנטיבי עם מספר יתרונות, כולל את היכולת של תפוקה גבוהה והקרנת סמים בעלות נמוכה. Zebrafish גם לאפשר בהקרנה vivo סמים עם מספרים שכפול גדול שהיו בעבר רק השגה עם מערכות חוץ גופית. היכולת לבצע במהירות מסכי סמים בקנה מידה גדול עשויים לפתוח את האפשרות לרפואה אישית עם תרגום מהיר של תוצאות חזרה למרפאה. Zebrafish מודלים מבע יכול לשמש גם מסך במהירות עבור מוטציות שימושי מבוסס על תגובת הגידול לטיפולים ייעודיים או כדי לזהות תרכובות אנטי סרטניים חדש מספריות גדולות. המגבלה העיקרית הנוכחית בתחום מהווה כמות ואוטומציה של התהליך כך שניתן יהיה לבצע מסכי סמים בקנה מידה גדול יותר ולהיות פחות בעלי עבודה. פיתחנו זרימת עבודה עבור דגימות המטופל הראשי xהשתלה לתוך הזחלים דג זברה וביצוע מסכי סמים בקנה מידה גדול באמצעות מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה. שיטה זו מאפשרת סטנדרטיזציה וכימות של אזור גידול מנופה ותגובה לטיפול בסמים על פני מספר גדול של הזחלים דג זברה. בסך הכל, שיטה זו היא יתרון על ההקרנה המסורתית התרופה בתרבות התא כפי שהוא מאפשר צמיחה של תאים סרטניים בסביבה vivo במהלך טיפול בסמים, והוא מעשי יותר וחסכוני יותר עכברים בקנה מידה גדול במסכים vivo סמים.
Introduction
Xenografting שתלה של סרטן החולה הראשי או סרטן האדם קווי תאים לתוך אורגניזמים מודל היא טכניקה נפוצה בשימוש כדי ללמוד התקדמות הגידול והתנהגות vivo, התגובה הגידול לטיפול בסמים, ואינטראקציה תא סרטן עם מיקרוסביבה, בין היתר. באופן מסורתי, תאים מושתלים בתוך עכברים שנפגעו ממערכת החיסון, וזה נשאר התקן בשדה. עם זאת, מערכת זו מודל יש מגבלות מספר, כגון עלות גבוהה, נמוך לשכפל מספרים, קשיים באופן מדויק העומס הגידול בvivo, ואת הזמן המורחב שלוקח גידולים כדי לעבור בדיקות וסמים כדי להסתיים. בשנים האחרונות, דג זברה התפתחה כמו מודל חלופי מבע, עם הראשון שדווחו ב 2005, עם חלבון פלורסנט ירוק (gfp)-התווית מלנומה האדם קו תאים מושתלים1לתוך blastula-שלבהעוברים 1,2. לאחרונה, 2 יום לאחר הפריה (dpf) דג זברה הזחלים שימשו כנמענים מבע כדי לאפשר שליטה של מיקום אנטומיים של הזרקה ולשימוש ברזולוציה גבוהה vivo הדמיה של אינטראקציה הגידול עם מיקרוסביבה המקיפה3,4.
Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמודל השתל מבע ראשית, ניתן לאכסן דגי מבוגרים ולגדל במהירות בכמויות גדולות בעלות נמוכה יחסית. יכול לייצר מאות. דגי זחל בשבוע בשל גודלם הקטן, ניתן לתחזק את הזחל הזה ב-96-לוחיות הרישוי לצורך הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. הזחלים לא צריך להיות מוזן במהלך ניסוי טיפוסי מבע, כמו שק החלמון שלהם מספק את החומרים המזינים לקיים אותם בשבוע הראשון שלהם של החיים. יתר על כן, דג זברה אין מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין עד 7 dpf, כלומר הם לא דורשים הקרנה או מדכאים חיסוני משטרי לפני הזרקת מבע. בסופו של דבר, קווי דג זברה ברורים לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גידול מיקרואקולוגיה.
אולי היישום המבטיח ביותר של דג זברה כמו מודל מבע היא היכולת לבצע הקרנת סמים בתפוקה גבוהה על דגימות סרטן האדם באופן שאינו אפשרי באמצעות כל אורגניזם מודל אחר. הזחלים סופגים סמים מהמים דרך העור, ומשפרים את קלות מינהל התרופות5. מכיוון שבעלי חיים נשמרים ב-96-צלחות, בדרך כלל ב-100-300 μL של מים, המסכים דורשים כמויות קטנות יותר של סמים בהשוואה לעכברים. כיום, ישנן מספר שיטות שונות לסטנדרטיזציה וכימות ההשפעה של תרופות על נטל הגידול האנושי של דג zebrafish, כמה מהם הם מעשיים יותר מאשר אחרים עבור שדרוג בדיקות סמים יחיד להקרנה בתפוקה גבוהה. לדוגמה, קבוצות מסוימות מנתק דגים לתוך השעיה תא בודד, ו לכמת בצורה פלואורוסקופים או תאים סרטניים מוכתם על ידי הדמיה של טיפות בודדות של ההשעיה וכימות זריחה באמצעות ImageJ חצי אוטומטי מאקרו4. חצי אוטומטי למחצה הזחלים שיטת הדמיה פותחה בו דגי זחל תוקנו ב 96-היטב צלחות והדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה לפני היישור של תמונות מרוכבים וכימות של הגידול בתוך התאים6. שני הצדדים האלה הם למעשה שיטות תובעניות לעבודה עבור כימות, אשר עשה באמת התפוקה בקצב גבוהה הקרנת סמים ב-דג זברה מודלים מבע מעשי.
בעיה זו טופלה על ידי התפתחות של בעלי חוליות הקרנה אוטומטית טכנולוגיה (המכריע) bioimager ו חלקיקים גדולים (LP) דוגם, מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי (איור 1 וטבלה של חומרים), שהיא שיטה אוטומטית באמת עבור תפוקה גבוהה הדמיה של הזחלים דג זברה7,8,9. עם יחידה זו, הדגים מורדם, שנדגמו באופן אוטומטי מצלחת 96-באר, ממוקם בקפילר ומסובבת לכיוון הגדרת מבוסס על העדפה משתמש מוגדרת מראש, התמונה, ולאחר מכן ממוקם בחזרה לתוך אותו טוב של הצלחת 96-באר חדש למחקרים נוספים או מושלך. שילוב זה טכנולוגיה הדמיה עם דג זברה xשתלי עשוי לאפשר את האפשרות של רפואה אישית המשתמשת הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של ספריות מתחם גדול סמים נגד גידולים החולה הפרט. זייברפיש xenografts גם להציע שיטה בקנה מידה גדול ובעלות נמוכה לבדיקת הן רעילות ויעילות של תרכובות הרומן ב vivo. Zebrafish יכול לשמש צעד הקרנה ראשונית לפני שתמשיך מודלים מבע העכבר.
פיתחנו זרימת עבודה יעילה עבור תאים מטופלים לוקמיה של החולה שתלה וביצוע מסכי סמים בתפוקה גבוהה עם הדמיה וכימות אוטומטי, אשר ניתן להחיל על כל התאים הראשוניים של החולה הראשי או קו התא של סרטן. זרימת עבודה זו מנוצל מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה יחידת דוגם אוטומטי כדי לשפר את התקינה הנוכחית שיטות כימות ומציעה חלופה אוטומטית הקודם, יותר העבודה אינטנסיבית שיטות של המסה הגידול לכמת ב vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על-ידי הוועדה המוסדית של אוניברסיטת קנטקי והשימוש בבעלי חיים (פרוטוקול 2015-2225). דגימות המטופל נאספו תחת הלוח המוסדי של אוניברסיטת קנטקי (פרוטוקול 44672). כל ניסויי החיות שבוצעו בעקבות פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית של המשתמש לטיפול בבעלי חיים.
1. מטופל ראשוני לוקמיה לימפובלסטית חריפה
- הפשרת החולה העיקרי דם היקפי תאים מוננונקה (PBMCs) ממלאי קפוא באמבט מים 37 ° c. מיד לאחר התאים הופלו, העברת תאים במדיה הקפאה שלהם (90% FBS + 10% diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) ל 15 מ"ל שפופרת חרוטי עם ליטוף איטי, הימנעות בועות אוויר. הוסף 10 מ ל של prewarmed 37 ° צ' מדיה התאגף (25% סרום של שור עוברי [FBS] ב Iscove שונה בינונית של המדיום [IMDM]) dropwise (כ 2-3 ל-mL) לתאים בתוך 15 מ"ל צינור חרוט.
הערה: PBMCs נאספו דגימות דם החולה בזמן האבחון. מעיל באפי הופרד על ידי צפיפות צנטריפוגה ותאים נשטפו 2x ב RPMI 1640 + 10% FBS. תאים נספרו ו 107 תאים היו קפואים לקריובקבוקון 1 מ ל של הקפאת מדיה, ואוחסנו ב-80 ° c. - בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 10 דקות ומין מדיה מתוך הגלולה התא. חזור על הוספת הפשרת מדיה, צנטריפוגה, ושאיפה נוספת להסרת DMSO שיורית.
- השהה תאים מחדש ב-5 מ ל של מלוחים באגירה מפוספז (PBS) והסר 10 μL לספירה על מונה תאים אוטומטי או הומוציטומטר. הוסף 10 μL של טרימטר כחול עד 10 μL של תאים שהוסרו לספירה. ספירת מספר התאים ל-mL ורשומה לחישוב מאוחר יותר של אמצעי האחסון להשהיה מחדש של תאים עבור השתלה של שתלה ראה שלב 2.5).
הערה: בדרך כלל, 500 תאים מושתלים. לדוגמה, 5 x 105 תאים נחוצים כדי להזריק 1,000 zebrafish. הכדאיות צריכה להיות > 85% לשימוש עבור השתלה של xenografting בניסוי זה, הכדאיות של התאים הייתה 96% לאחר היפיית, והעריכו על ידי טריפי כתמים כחולים.
2. בסיפוק תוויות תאים עם DiI
- צנטריפוגה את מספר התא הרצוי ב-5 מ ל של PBS ב 200 x g עבור 5 דקות ו-לאכול supernatant. כתם מינימום של 2 x 106 תאים במקרה של הסדר או בעיות טעינת המחט במהלך ההזרקה.
- לעשות 1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט (dii) צביעת פתרון (5 מ ל של PBS המכיל 4 μl לכל mL של הכתם dii, שולחן של חומרים) ולהשעות את הגלולה תא בתמיסה הצביעת.
הערה: צפיפות התא לא תעלה על 2 x 106 תאים/mL כאשר הושעה מחדש בפתרון הצביעת. - בתאי הדגירה ב 37 ° צ' מוגן מפני אור עבור 20 דקות, ומערבולת בעדינות, ואז לאחר מכן דגירה תאים על הקרח עבור 15 דקות מוגן מפני אור.
- בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ו-לאכול supernatant. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של PBS, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ו-שטפי דם supernatant. חזור על השטיפה, הצנטריפוגה והשאיפה פעם נוספת.
- השהה תאים מחדש ב-1 μL של PBS לכל 250,000 תאים חיים והעבר לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. לשמור על השעיית תאים מחדש על קרח בחושך ומיד להמשיך מיקרו זריקות.
הערה: זה מבטיח כי 500 תאים החולה מוזרק לתוך דג דג זברה כל משאבת הזרקת של 2 nL נפח.
3. הרימות מיקרוזרקת דגים
הערה: מיקרו זריקות צריך להסתיים בתוך 1-3 h של כתמים כדי לשפר את הכדאיות של תאים.
- לפני צביעת תאים והזרקת, להפוך לוחיות להזריק על ידי שפיכת 25 מ ל של 3% agarose ב-1x טריס/בוראט/EDTA (TBE) לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו לגבש. הצלחות בחנויות ב -4 ° c עד שבועיים.
- גם לפני צביעת תאים והזרקת, ביטול 2 dpf דג באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ מבתר. לקבלת משיכה ידנית, למשוך מקצוות מנוגדים של chorion מגן הדגים עם מלקחיים עד הדמעות chorion הדגים הופך להיות ללא עטוף10.
הערה: ניתן לבצע גם באמצעות טיפול אנזימטי באמצעות הפרואז, כפי שמתואר בעבר10. קספר (רועי-/-; היארי-/-) זייברפיש שימשו לניסויים אלה11. ניתן להשתמש בכל מאמץ זחל. להשתלת-השתלה אם פיגמנט מפריעה הדמיה או הדמיה, הטיפול מאפשר להשתמש כדי לחסום סינתזה המלנין אם זנים ברורים של ברור דג זברה אינם זמינים12. - מחטים prechill ב 4 ° צ' או על הקרח כדי למנוע החלקה של תאים במהלך מיקרו הזרקה. טען 5 μL של תאים ויטראז ' לתוך מחט זכוכית מקורר בורוזאמייסיליקט באמצעות מיקרוטוען מיקרו מעמיס טיפים.
הערה: שיטות ההתקנה של מיקרו מזרק ומחט פורסמו בעבר13. - לטעון את המחט לתוך הזרוע מיקרו מזרק. השקוע את קצה המחט באמצעות להב גילוח סטרילי. מדוד את גודל droplet בשמן מינרלי באמצעות מיקרומטר שלב, שמירה על נפח droplet בעקביות ב 2 nL (~ 0.15 מ"מ קוטר) ברחבי.
- השתמש ב-350 μL של 4 מ"ג/mL tricaine-S להרדמה ~ 30 ביטול 2 dpf דג בצלחת פטרי המכילה 25 מ ל של E3 מדיה. לאחר ~ 1 דקות העברת הזחלים מורדם לצלחת הזרקה שטוח (3% העלה בצלחת פטרי) ולהזריק הזחלים עם משאבה אחת של תאים ויטראז באתר ההזרקה הרצוי (למשל, חלמון או קרום הלב; ראה איור 2א, ב).
הערה: אתר ההזרקה צריך להיבחר על בסיס מטרת הניסוי. אתר ההזרקה השכיח ביותר הוא החלמון. כדי לקבל תאים במחזור הדם, קרום הלב, הצינור של Cuvier, מרחב perivitelline, או משטח רטרו מסלולית ניתן להשתמש כאתרי הזרקה. ניתן להשתמש גם באתרי הזרקה אורתוטופית, כגון המוח. - לשטוף את הזחלים את לוחית ההזרקה לתוך 10 ס מ2 צלחת פטרי (30 הזחלים לצלחת) המכיל E3 מדיה14 ללא מתילן כחול ו דגירה ב 28 ° צ' עבור 1 h תקופת ההחלמה. המשיכו להזריק עד שמספר הזחלים המבוקש הוזרק.
הערה: באופן אידיאלי, הכנס 2-2.5 לקפל את מספר הזחלים הדרושים לניסויים. יהיו כמה למות של הזחלים בשל לחץ מפני הזרקה ואת טמפרטורת הדגירה מוגברת. בדרך כלל, לאחר התרגול עם הטכניקה, ניתן להזריק 800 ש ח הזחלים מתוך 1 עד 3 כאשר תאים מוכתמים צריך להזריק. - להעביר צלחות של הזחלים מוזרק לאינקובטור 34 ° c. אין להניח את מנות פטרי של הזחלים ישירות על מדף מתכת בחממה כדי למנוע התחממות יתר של המים E3. לדוגמה, מניחים צלחת פטרי ריקה בין המדף לבין צלחת פטרי של הזחלים לפעול כחוצץ. הסרת מתים הזחלים המלח לאחר 24 ו 48 שעות לאחר הזרקת (hpi).
4. הגדרת מסך הסמים עם דגי מנובתרים
-
ב 48 hpi, המסך דג זברה הזחלים עבור מיפתח זריחה/גידול בריאות (איור 2C, D). הוציאו ממנו את הדגים המתים או הפגומים, ובחרו בציידג עם חרט דומה (איור 2ג, ד, 1-3 ו-1-3). הסירו ממנו את הדגים (איור 2C, D, 5 ו -5).
- עבור החלמון דגים מוזרק, להסיר דגים שבו גבולות החלמון לא ניתן לראות סביב מיסת התא מנופה (איור 2C, 4) כפי שהוא עושה קשה לכמת. עבור קרום הלב מוזרק דגים, להסיר דגים שם מוזרק תא המסה פולש לתוך שק החלמון (איור 2D, 4 ').
- . מוסיפים דג בצלחת 96 כדי לעשות זאת, לחתוך את הקצה של טיפ 200 μl הצינורות, רק גדול מספיק עבור 4 הדגים דג זברה להשתלב. מרוקן 150 μl של E3 מדיה עם אחד דג זברה מן הצלחת באמצעות P200, ולהוסיף לבאר ריקה של שטוח בתחתית 96-באר צלחת.
- לדלל את הסם כדי להיבדק בנפח הנדרש של E3 מדיה, ב 150 μL לכל טוב. הכן תרופה ב-2 מקפלים את הריכוז הרצוי. לדוגמה, הכינו 20 μM של תרופות ב-E3 אם הריכוז הסופי הרצוי הוא 10 μM, כיוון שמחצית הנפח הכולל בכל באר מורכבת מפתרון התרופה. עבור קבוצת הבקרה DMSO, הוסף DMSO באותו אמצעי אחסון כמו התרופה.
- הוסף 150 μl של הפתרון התרופתי מדולל 2x לכל טוב המכיל את הזחלים דג זברה ב 150 μl של E3, עבור נפח הסופי של 300 μl עם פתרון התרופה 1x לכל טוב.
- מודקת את הצלחת ב 34 ° c. . תבדקי אם יש דג מת מדי יום לאחר יומיים, אם תרצה, לרענן את הסם על ידי הסרת 200 μL של נוזל מכל טוב של הצלחת 96-באר והחלפת עם 200 μL של 1 x מדלל פתרון תרופה או DMSO ב-E3 מדיה.
הערה: התוצאות הטובות ביותר נמצאו לאחר 3 ימים של טיפול תרופתי לניסוי זה; עם זאת, אורך הטיפול בסמים יכול להשתנות בין 2 ל -4 ימים, וייתכן שיהיה צורך למטב את השימוש בניסוי שנעשה או שימוש בסמים.
5. הדמיה Xenografted דגים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד יחידת דימות ויחידת סמפלר אוטומטית
- להכין 1 L של טרי 4 מ"ג/mL tricaine ו 1.5 L של E3 מדיה. מילוי בקבוק מדיה 1 עם E3 מדיה בקבוק מדיה 2 עם tricaine.
- הסר את כל ערוצי הפלורסנט הלא רצויים בתוכנת הדימות והוסף את הערוץ הרצוי (DiI לניסוי זה). בדוק את ערוץ הפלורסנט הרצוי כתמונה רק עבור הערוצים עם סימן ביקורת. כמו כן, בחר כיצד התמונות יילקחו (z-ערימות, אוטומציה, לולאות בסדרה, וכו ').
הערה: עבור ניסוי זה, המוקד הוגדר באופן ידני עבור כל התמונות דגים כדי להשיג את המספר הגבוה ביותר של דימויים עם מיקוד אופטימלי. - התמונה של דג הבקרה DMSO לפני הדג שטופלו בסמים, כך שניתן יהיה להגדיר את זמן החשיפה המתאים בתוכנת הדימות. לאחר הגדרת החשיפה, אל תשנה את זמן החשיפה למשך הניסוי.
הערה: המוקד יכול להיות מותאם באופן ידני עבור כל דג בכדי להבטיח שאין מתוך תמונות מיקוד, או עבור הדמיה אוטומטית לחלוטין, את המוקד אותו ניתן להשתמש בין דגים עם מתוך מיקוד תמונות להיות מושלך או דגים מחדש לפני ביצוע ניתוח. יתר על כן, ניסוי זה יכול להתבצע על ידי שימוש בכל אננגר פלורסנט ואחריו כימות הניאון באמצעות התוכנה ImageJ.
6. כימות הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות ImageJ
- פתח את תוכנת ImageJ.
-
עבור לקובץ | פתח ובחר בקובץ. czi הרצוי. התוכנה תביא חלון אפשרויות ייבוא.
- להצגת מחסנית בחירת היפרערימות, בדוק את האפשרות פתח קבצים בנפרד, בדוק את קנה מידה אוטומטיובדוק ערוצים מפוצלים. לאפשרות ' צבע ' בחר ' צביעת'.
- לחץ על תוספים | פקודות מאקרו | רשומה.
- לחץ על תמונה | כוונן | הסף. בחר סוג תמונה כאדום בתפריט הנפתח שבצידו השמאלי של חלון הסף. התאימו את הסף המינימלי עד שהתוכנה רק ממירה אזורים בעלי קרינה פלואורסצנטית (איור 3A) ולחצו על ' החל '. התוכנה תמיר את התמונה לשחור-לבן, עם האזור שנבחר בשחור.
הערה: השתמש באותו סף עבור כל תמונה במסך התרופה כדי לשמור על תוצאות סטנדרטיות ודומות. - לחץ על נתח | . תמדודאת זה התוכנה תמשוך חלון תוצאות המכיל את אזור הפלורסנט עבור תמונה זו.
- לחץ על יצירה בחלון מקליט המאקרו . פעולה זו תפתח חלון חדש עם הקוד עבור המאקרו. סמן את כל התמונות הרצויות לניתוח ופתח כמו בשלב 6.2.
- בחר באפשרות הפעלה בחלון עם המאקרו. חלון התוצאות יכיל כעת את האזור עבור כל תמונה.
הערה: ניתן לבצע את ניתוח התמונה בנפרד מבלי להקליט ולהפעיל מאקרו, כמו גם על-ידי חזרה על השלבים שלעיל עבור כל תמונה. - העתק את הנתונים שנמדדו לתוך גיליון אלקטרוני. ממוצע הקרינה הפלואורסצנטית הכוללת של כל שליטה (DMSO) דגימות. חשב את ההפרש באחוזים באמצעות הנוסחה הבאה: – [(אזור DMSO ממוצע – אזור ניסיוני)/ממוצע DMSO אזור] x 100% (איור 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, דג דג זברה היו מושתלים בחלמון ואת קרום הלב עם pbmcs החולה הראשי שהיו מבודדים במקור לוקמיה לימפובלסטית חריפה בתאי t (t-ALL) מטופל באבחון הפקדה כמדגם בר קיימא, קפוא. ב 48 hpi, דגים x, מושתלים הוקרן עבור פלואורוסקופים בעלי תווית תאים סרטניים (איור 2ג, ד) ומטופלים עם כימותרפיה (dexamethasone או VINCRISTINE) או dmso. הדגים התמונות היו על 7 dpi, לאחר 3 ימים על טיפול בסמים באמצעות מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה (איור 3A).
אזור הפלורסנט/נטל הגידול נמדד עבור כל דג התמונה באמצעות ImageJ ולעומת הקבוצות השונות לטיפול בסמים ו DMSO (איור 3B). באופן כללי, דגים מושתלים מטופלים עם פינקריסטין הראה את הירידה הגדולה והעקבית ביותר במסת התא xenografted לעומת הדגים התייחסו dmso. Dexamethasone התייחס דג הראה כמחצית הפחתת באזור הגידול לעומת vincristine, אבל עדיין הראה ירידה באזור הגידול לעומת DMSO (איור 3). זה מחקה את מה שנראה אצל המטופל, כמו לוקמיה שלהם הגיבו במהירות לטיפול עם שילוב של דקאמתאספא וינקריסטין. תוצאות אלה מדגימים את היכולת של מודלים דג זברה מבע להיות קלה הקרנת סמים והדמיה אוטומטית וכימות, מתן פלטפורמה לבדיקת דגימות המטופל שונים או קווי תאים עם סמים שונים או שילובים תרופות.
איור 1: מסך הסמים של Xenograft וזרימת התמונות. סכימטי של זרימת העבודה של השתלה של xenozefish הזחלים וביצוע מסך הסמים, כולל הדמיה על מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אתר ההזרקה ותמונות מייצגות של הקרנת דגים מהזרקות. תמונות של מחט מיקרוהזרקה בזמן ההזרקה לתוך החלמון (א) או קרום הלב (ב) של 2 הזחלים של הרימות. תמונות מייצגות של הקרנת הסרט ב -2 dpi מתארים את מבחר הזברפיש לשימוש במסך התרופות (C, D). יש לבחור באפשרות "דגי ברכה" (1-3 ו-1-3) לבחירה, הסרת הדגים המסומנים (5 ו-5). עבור החלמון דגים מוזרק, להסיר דגים שבו גבולות החלמון לא ניתן לראות סביב המסה תא מנופה (4) כפי שהוא עושה קשה לכמת. עבור קרום הלב מוזרק דגים, להסיר דגים שם מוזרק תא המסה פולש לתוך שק החלמון (4 '). סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טיפול בסמים יכול להפחית את אזור הגידול הvivo. תמונות מייצגות של דג דג זברה הזריקו בתוך קרום הלב או חלמון לאחר 3 ימים של טיפול עם dmso או סמים, או פינקריסטין או דקאמתאסאחד. שטח של מסת הגידול מנופה היה כולו על ידי הגדרת סף הזריחה באמצעות ImageJ, בחירת כל הפיקסלים מעל הסף להגדיר, ומדידת האזור מתכוון זריחה של האזורים שנבחרו. פיקסלים מעל לסף שנבחר מופיעים בשחור, בעוד שפיקסלים מתחת לסף מופיעים בצבע לבן. פיקסלים נמדדו הן בחלמון והן בקרום הלב הזריקו תמונות (א). הטיפול בויקריסטינה הוביל לירידה באזור גידול מנופה לעומת DMSO שליטה עם n = 4 דגים שטופלו לכל קבוצה (ב). SD = סטיית תקן. סרגל בקנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, הדגמנו שיטה סטנדרטית להחדרה והזרקה של תאי לוקמיה של המטופל העיקרי לתוך דג דג זברה כמודל מבע. כמו כן הקמנו פרוטוקול עבור הקרנת התרופה בתפוקה גבוהה של דגי מכסימום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי. בעבר, שתלי xenografts עם קווי התאים האנושיים, וכימות של גידולים xenografts באופן תפוקה גבוהה היתה אתגר בתחום. שיטה זו משמשת כבסיס למחקרים כדי לנצל מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה כדרך להפוך את ההדמיה של הדמיה של x, עם המטרה האולטימטיבית של ביצוע מסכי סמים בתפוקה גבוהה כדי לנבא אילו תרופות סרטן החולה הספציפי עשוי להגיב, פתיחת האפשרות לרפואה אישית יותר.
למרות היכולת להפוך את החלק הגדול של פרוטוקול זה, ישנם עדיין אתגרים טכניים רבים שאין להתעלם מהם. ראשון, זה קריטי כי התאים מוזרק לתוך דגים במהירות האפשרית לאחר הצביעת כדי למנוע מהפייפת תאים ומוות תאים. הזחלים יצטרכו להיות מורחוקים לפני ביצוע הפרוטוקול הצביעת התאים. בנוסף, יש לשמור על קור מחטים מזכוכית לפני טעינת המחט כדי להפחית את סתימת המחט. בנוסף, שימוש בעוברים המיוצרים על ידי מבוגר בריא דג זברה בגיל 6 חודשים עד 1 השנה היא קריטית כדי להבטיח את הכדאיות הטובה ביותר של הזחלים המוגמניים. בסופו של דבר, דגים מושתלים צריך להיות מוקרן בקפידה עבור הגידול הגידולים, ורק אלה עם אמצעי הגידול דומים צריך לשמש בהקרנה סמים כדי להפחית את השונות בתוצאות הסופיות.
למרות שאנחנו השתמשנו החולה העיקרי לוקמיה PBMCs עבור ניסויים שלנו, פרוטוקול זה ניתן לבצע עם כל סוג של גידול או תא הסרטן קו. עבור קווי תאים בתרבות, תאים מחסיד צריך להיות טריסינטזציה ולאחר מכן שטף ב-PBS לפני שתמשיך עם הפרוטוקול מכתים. כמו כן, חשוב לציין כי שיעורי התיאום יכולים להשתנות ממדגם אחד למשנהו ובין סוגי המדגם15. לדוגמה, במדגם שלנו PBMC, > 90% של מחזורי PBMCs היו תקיעות לוקמיה, אבל מספר זה יכול להשתנות באופן משמעותי ממטופל אחד למשנהו, אשר עשוי להשפיע על שיעור בתיאום. מכיוון שהתוצאות מושוות לפקד DMSO באותו סוג דגימה, יש שליטה פנימית לשיעור הניתן לעיון, אך וריאציה זו צריכה להילקח בחשבון כאשר מחליטים כמה תאים להזריק לכל דג. מצאנו הצלחה בעת שימוש ב-250-1000 תאים שהוזרקו לכל בעל חיים, כאשר 500 מיטבי ללימודים. בעוד הניסויים שלנו סיכם כאשר הזחלים היו 7 dpf, אנחנו לא מצפים xenografts תלים לשרוד בעלי חיים עבור נקודות זמן ארוכות יותר, כמו מערכת החיסון מתחיל להתפתח בשלב זה, והוא עלול לגרום דחייה של תאים אנושיים. שורות החיסון החיסונית נפרץ שנוצרו, עם prkdc-/-il2rga-/- דג זברה מסוגל לאחד תאים סרטניים האדם16,17, אשר עשוי להיות שימושי לטווח ארוך יותר xenografts אוהערכתהישנות הגידול לאחר טיפול בסמים. עם זאת, אלה הקווים החיסוני חייב להישמר כמו הטרוזיטים, כך הזחלים חייב להיות גנוזה לפני השימוש. Homozygous דג חייב גם להיות מטופלים עם תרופות כדי לרוקן מקרופאגים כדי לאפשר חרט מהימן של תאים אנושיים, אשר עשוי לסבך את תוצאות סינון התרופה. כיום, קווים אלה הם לא מעשיים ולא נחוצים הקרנת סמים בקנה מידה גדול על הזחלים, אשר ניתן להשלים לפני המערכת החיסונית היא תפקודית לחלוטין ב 7 dpf18.
תוצאות הנציג שלנו מתמקדים בהזרקה של תאים לתוך קרום הלב וחלמון לנוחות ומהירות ההזרקה ויכולת הכדאיות המוגברת; עם זאת, תאים סרטניים ניתן להזריק למקומות רבים אחרים אנטומיים והיה לנו הצלחה באמצעות זרימת עבודה זו באתרים אחרים, כולל צינור של cuvier, המוח, רטרו מסלולית, ואת שק perivitelline. בנוסף, קשה להעריך את הכמות של כל אחד מהסמים שדגי הזחל סופגים; אם מספר תרופות משמשות, באופן אידיאלי מסך רעילות במגוון של מינונים (בדרך כלל 0.1 עד 25 μM) יבוצעו לפני בקנה מידה גדול כדי לקבוע את המינון המקסימלי נסבל (MTD). בחרנו להשתמש mtd עבור כל תרופה עבור הצורך שלנו, עם זאת, 10 μm של התרופה משמשת בדרך כלל בשדה דג זברה כריכוז התחלתי של הקרנת סמים בתפוקה גבוהה בדרך כלל נסבל היטב. ניתן להשתמש בשילובים של תרופות בבריכות גם כמסך התחלתי, כדי להגביר את היעילות של ההקרנה באמצעות ספריה גדולה בעלת נפח גדול19.
למרות שגישה זו היא יותר אוטומטית ויעילה יותר מזרימות עבודה שדווחו קודם לכן, זהו עדיין פרוטוקול עתיר עבודה ומאתגר מבחינה טכנית עבור כל אדם ללא ניסיון מפני הזרקת דג מיקרו. הקרנת הסמים ב-דג זברה xשתלי לא סביר אי פעם להגיע הקלות והיעילות של הקרנת חוץ גופית של ספריות מורכבות חסר יתרונות של מודלים xenografts העכבר. לדוגמה, מגבלה אחת גדולה עם שתלי xenografts היא כי תאים סרטניים לא ניתן לאחזר בקלות מן הדגים לאחר השתלה של xenografts מספרים שימושיים עבור בנקאות תא או ביותר במורד ניסויים. גם אם זה אפשרי, תאים סרטניים אנושיים היה גדל במשך כמה ימים בטמפרטורות שאינן פיזיולוגיים וסביבות ולא יהיה מעשי לשימוש ביישומים מאוחרים יותר. ההשפעות של מעט נמוך יותר מאשר טמפרטורה פיזיולוגית על קינטיקה סמים ותגובת תאים הגידול הוא גם לא ידוע, והוא עשוי לייצר תוצאות מייסדים. למרות האזהרות הללו, דג זברה xenografts למלא ריק להיות שיטה מעשית יותר וחסכונית לביצוע בקנה מידה גדול יותר במסכי vivo סמים מאשר אפשרי במודלים xenografts העכבר. בנוסף, דג זברה xenografts דורשים תאים הרבה פחות עבור הזרקה מאשר מודלים העכבר, כך כמות קטנה של דגימת החולה ניתן להפיץ בין מאות אלפי דגים, המאפשר מסכי סמים עם מספרים גדולים לדוגמה. עם תיוג פלורסנט, התאים הסרטניים יכולים להיות מנוטרים מרגע שהם מושתלים ל זחל הדגים, מתן כמה סטנדרטיזציה בין בעלי החיים המשמשים מסכי הסמים. שילוב היתרונות הללו של דג זברה xenografts תלי עם אפשרות של דימות אוטומטי וכימות של תאים מנופה נפתח אפשרויות רבות להפיכת התפוקה גבוהה בתפוקת הסמים של גידולים החולה עבור רפואה אישית מציאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי פרס V המלומד הקרן v ו NIH מענקים DP2CA228043, R01CA227656 (ל ס בלקברן) ו NIH הדרכה מענק T32CA165990 (כדי מ Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
