Summary
Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.
Abstract
Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente son fundamentales para definir cómo los diferentes tipos de cáncer responden al tratamiento farmacológico en un sistema in vivo. Los modelos de ratón son el estándar en el campo, pero el pez cebra ha surgido como un modelo alternativo con varias ventajas, incluyendo la capacidad de detección de drogas de alto rendimiento y bajo costo. El pez cebra también permite la detección in vivo de fármacos con grandes números de réplica que antes solo se pueden obtener con sistemas in vitro. La capacidad de realizar rápidamente pantallas de medicamentos a gran escala puede abrir la posibilidad de medicina personalizada con una traducción rápida de los resultados a la clínica. Los modelos de xenoinjerto de pez cebra también podrían utilizarse para detectar rápidamente mutaciones procesables basadas en la respuesta tumoral a terapias dirigidas o para identificar nuevos compuestos contra el cáncer de grandes bibliotecas. La principal limitación actual en el campo ha sido cuantificar y automatizar el proceso para que las pantallas de drogas se puedan hacer a mayor escala y sean menos laboriosas. Hemos desarrollado un flujo de trabajo para las muestras de pacientes primarios de xenografting en larvas de peces cebra y la realización de pantallas de fármacos a gran escala utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Este método permite la estandarización y cuantificación del área tumoral injertada y la respuesta al tratamiento farmacológico a través de un gran número de larvas de pez cebra. En general, este método es ventajoso sobre la detección de drogas de cultivo celular tradicional, ya que permite el crecimiento de células tumorales en un entorno in vivo durante todo el tratamiento farmacológico, y es más práctico y rentable que los ratones para pantallas de fármacos in vivo a gran escala.
Introduction
La xenografting de cánceres de pacientes primarios o líneas celulares de cáncer humano en organismos modelo es una técnica ampliamente utilizada para estudiar la progresión y el comportamiento del tumor in vivo, la respuesta tumoral al tratamiento farmacológico y la interacción de las células cancerosas con el microambiente, entre otros. Tradicionalmente, las células se xenojeran en ratones inmunes, y esto sigue siendo el estándar en el campo. Sin embargo, este sistema modelo tiene varias limitaciones, tales como alto costo, números de réplica bajos, dificultades para cuantificar con precisión la carga tumoral in vivo, y el tiempo prolongado que tardan los tumores en injertar y pruebas de drogas para completarse. En los últimos años, el pez cebra ha surgido como un modelo de xenoinjerto alternativo, y el primero se ha informado en 2005, con líneas celulares de melanoma humano etiquetadas con proteínafluorescentes verdes (GFP) trasplantadas en embriones de fase de blastula1,,2. Más recientemente, se han utilizado como receptores de xenoinjerto 2 días larvas de pez cebra después de la fertilización (dpf) para permitir el control de la ubicación anatómica de la inyección y para su uso en alta resolución in vivo de la interacción tumoral con el microambiente circundante3,4.
Zebrafish ofrece muchas ventajas como modelo de xenoinjerto. En primer lugar, el pez cebra adulto puede ser alojado y criado rápidamente en grandes cantidades a un costo relativamente bajo. Cada par de peces cebra adultos puede producir cientos de peces laricos por semana. Debido a su pequeño tamaño, estos peces cebra larvales se pueden mantener en placas de 96 pocillos para el cribado de drogas de alto rendimiento. Las larvas no tienen que ser alimentadas durante el transcurso de un experimento típico de xenoinjerto, ya que su saco de yema proporciona los nutrientes para sostenerlas durante su primera semana de vida. Además, el pez cebra no tiene un sistema inmunitario completamente funcional hasta 7 dpf, lo que significa que no requieren irradiación o regímenes inmunosupresores antes de la inyección de xenoinjerto. Por último, las líneas ópticamente claras del pez cebra permiten imágenes de alta resolución de las interacciones tumor-microambiente.
Tal vez la aplicación más prometedora del pez cebra como modelo de xenoinjerto es la capacidad de realizar pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento en muestras de cáncer humano de una manera que no es posible utilizando ningún otro organismo modelo. Las larvas absorben los fármacos del agua a través de la piel, mejorando la facilidad de administración de fármacos5. Debido a que los animales se mantienen en placas de 96 pocillos, por lo general en 100 a 300 l de agua, las pantallas requieren cantidades de fármacos más pequeñas en comparación con los ratones. Actualmente, existen varios métodos diferentes para la estandarización y cuantificación del efecto de los medicamentos en la carga tumoral humana en el pez cebra, algunos de los cuales son más prácticos que otros para ampliar las pruebas de un solo fármaco a la detección de alto rendimiento. Por ejemplo, algunos grupos disocian los peces en suspensiones de una sola célula y cuantifican las células tumorales etiquetadas fluorescentes o teñidas mediante la toma de imágenes de gotas individuales de la suspensión y la cuantificación de la fluorescencia utilizando unamacro4 semiautomática de ImageJ. Se desarrolló un método de imagen semiautomática de larvas enteras en el que los peces larvales se fijaban en placas de 96 pocillos e imágenes utilizando un microscopio fluorescente invertido antes de la realineación de imágenes compuestas y la cuantificación de los focos de células tumorales6. Ambos ensayos son métodos bastante intensivos en mano de obra para la cuantificación, lo que ha hecho que el cribado de fármacos de alto rendimiento en modelos de xenoinjerto de pez cebra no sea práctico.
Este problema ha sido abordado por el desarrollo de la Tecnología de Detección Automatizada de Vertebrados (VAST) Bioimagen y Gran Partícula (LP) Sampler, una unidad de imagen equipada con microscopio de fluorescencia y unidad de toma de muestras automatizada(Figura 1 y Tabla de Materiales),que es un método verdaderamente automatizado para la toma de imágenes de alto rendimiento de larvas de pez cebra7,8,9. Con esta unidad, los peces son anestesiados, muestreados automáticamente desde una placa de 96 pocillos, colocados en un capilar y girados en la orientación del conjunto en función de una preferencia de usuario preestablecida, imágenes, y luego colocados de nuevo en el mismo pozo de una nueva placa de 96 pocillos para estudios posteriores o desechados. La combinación de esta tecnología de imágenes con xenoinjertos de pez cebra puede permitir la posibilidad de una medicina personalizada que utilice pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento de grandes bibliotecas de compuestos farmacológicos contra tumores de pacientes individuales. Los xenoinjertos de pez cebra también ofrecen un método a gran escala y de bajo costo para probar tanto la toxicidad como la eficacia de nuevos compuestos in vivo. Zebrafish se puede utilizar como paso de cribado preliminar antes de proceder a los modelos de xenoinjerto de ratón.
Hemos desarrollado un flujo de trabajo simplificado para las células de leucemia primaria del paciente de xenografting en el pez cebra y la realización de pantallas farmacológicas de alto rendimiento con imágenes y cuantificación automatizadas, que se pueden aplicar a cualquier otra célula tumoral de paciente primario o línea celular cancerosa. Este flujo de trabajo utilizó una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de tomadegador automatizada para mejorar los métodos actuales de estandarización y cuantificación y ofrece una alternativa automatizada a los métodos anteriores, más intensivos en mano de obra, de cuantificar la masa tumoral in vivo.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky (protocolo 2015-2225). Las muestras de pacientes fueron recogidas bajo la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Kentucky (protocolo 44672). Todos los experimentos con animales realizados siguiendo este protocolo deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del usuario.
1. Descongelar células de leucemia linfoblástica aguda del paciente primario
- Descongelar las células mononucleares de sangre periférica del paciente primario (PPBCD) del stock congelado en un baño de agua de 37 oC. Inmediatamente después de que las células se hayan descongelado, transfiera las células en sus medios de congelación (90% FBS + 10% dimetil sulfóxido [DMSO]) a un tubo cónico de 15 ml con pipeteo lento, evitando burbujas de aire. Añadir 10 ml de medios de descongelación precalentados de 37 oC (25% de suero bovino fetal [FBS] en el medio modificado de Dulbecco de Iscove [IMDM]) con gota (aproximadamente 2 x 3 s por ml) a las células del tubo cónico de 15 ml.
NOTA: Los PBL se recogieron de las muestras de sangre del paciente en el momento del diagnóstico. La capa buffy fue separada por centrifugación de densidad y las células fueron lavadas 2 veces en RPMI 1640 + 10% FBS. Se contaron las células y se congelaron 107 células por criovial en 1 ml de medio de congelación, y se almacenaban a -80 oC. - Células centrífugas a 100 x g durante 10 min y aspirar medios del pellet celular. Repita la adición de medios de descongelación, centrifugación y aspiración una vez adicional para eliminar cualquier DMSO residual.
- Resuspenda las células en 5 ml de solución salina con fosfato (PBS) y retire 10 ml para contar con un contador de células automatizado o hemocitómetro. Añadir 10 sl de trippan azul a 10 s de celdas eliminadas para contar. Cuente el número de celdas por ml y registre para calcular posteriormente el volumen para resuspender celdas en xenografting (consulte el paso 2.5).
NOTA: Típicamente, 500 células son xenoinjeradas por pez cebra larval. Por ejemplo, se necesitan 5 x 105 células para inyectar 1.000 peces cebra. La viabilidad debe ser >85% para usar para xenografting. En este experimento, la viabilidad celular fue del 96% después de la descongelación, evaluada por la tinción azul de trypan.
2. Celdas fluorescentes de etiquetado con DiI
- Centrifugar el número de celda deseado en 5 ml de PBS a 200 x g durante 5 min y aspirar sobrenadante. Mancha un mínimo de 2 x 106 células en caso de aglomeración o problemas para cargar la aguja durante la inyección.
- Hacer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocyanine solución de tinción (DiI) (5 ml de PBS que contiene 4 l por ml de mancha DiI, tabla de materiales) y resuspender el pellet celular en la solución de tinción.
NOTA: La densidad celular no debe exceder 2 x 106 células/ml cuando se resuspende en la solución de tinción. - Incubar las células a 37 oC protegidas de la luz durante 20 minutos, vórtice suavemente, luego incubar las células sobre hielo durante 15 minutos protegidas de la luz.
- Células centrífugas a 200 x g durante 5 min y sobrenadante aspirado. Lavar las células con 5 ml de PBS, centrifugar a 200 x g durante 5 min y aspirar sobrenadante. Repita el lavado, la centrifugación y la aspiración una vez más.
- Resuspenda las células en 1 l de PBS por cada 250.000 células vivas y transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga las células resuspendidas sobre hielo en la oscuridad y continúe inmediatamente con las microinyecciones.
NOTA: Esto garantiza que se inyecten 500 células de paciente en el pez cebra con cada bomba de inyección de 2 nL de volumen.
3. Larvas de pez cebra microinyectars
NOTA: Las microinyecciones deben completarse dentro de 1 x 3 h de la tinción para mejorar la viabilidad de las células.
- Antes de manchar las células y inyectar, haga placas de agarosa para inyectar vertiendo 25 ml de agarosa del 3% en 1x Tris/borate/EDTA (TBE) en una placa Petri y deje que se solidifique. Conservar las placas a 4oC durante un máximo de 2 semanas.
- También antes de la tinción de las células y la inyección, decorionada 2 dpf pez cebra usando fórceps bajo un microscopio de disección. Para la desboquenación manual, tire de los extremos opuestos del coro protector del pez cebra con fórceps hasta que las lágrimas de coro y el pez cebra se vuelvan sin envolver10.
NOTA: La decorionación también se puede realizar mediante el tratamiento enzimático con pronasa, como se describió anteriormente10. Casper (roy-/-;nacre-/-) se utilizaron peces cebra para estos experimentos11. Cualquier cepa larvario de pez cebra se puede utilizar para la xenografting. Si el pigmento interfiere con la imagen o la visualización, se puede utilizar el tratamiento con propiltiouracilo (PTU) para bloquear la síntesis de melanina si no se dispone de cepas de pez cebra ópticamente claras12. - Prechill agujas a 4 oC o sobre hielo para evitar aglutinar las células durante la microinyección. Cargue 5 l de células manchadas en una aguja de vidrio de borosilicato no filamentoso refrigerada con puntas de pipeta de microcargador.
NOTA: Los métodos de configuración de microinyectores y agujas se han publicado previamente13. - Cargue la aguja en el brazo del microinyector. Bisele la punta de la aguja con una cuchilla de afeitar estéril. Mida el tamaño de las gotas en aceite mineral utilizando un micrómetro de etapa, manteniendo el volumen de las gotas de forma consistente en 2 nL (0,15 mm de diámetro) en todo el momento.
- Utilice 350 ml de 4 mg/ml de tricaína-S para anestesiar el pez cebra de s3 desconforionizado de 2 dpf en una placa de Petri que contenga 25 ml de medios E3. Después de 1 minuto de transferencia de larvas anestesiadas a una placa de inyección de superficie plana (3% agarosa en una placa de Petri) e inyectar larvas con una bomba de células manchadas en el lugar de inyección deseado (por ejemplo, la yema o el pericardio; ver Figura 2A,B).
NOTA: El lugar de inyección debe elegirse en función del objetivo del experimento. El lugar de inyección más común es la yema. Para obtener células que circulan en el torrente sanguíneo, el pericardio, el conducto de Cuvier, el espacio periviellina o el espacio retro-orbital se pueden utilizar como sitios de inyección. También se pueden utilizar sitios de inyección ortotópica, como el cerebro. - Lave las larvas de la placa de inyección en una placa de 10 cm2 Petri (30 larvas por placa) que contenga E3 media14 sin azul de metileno e incubar a 28 oC durante un período de recuperación de 1 h. Continúe inyectando hasta que se haya inyectado un número deseado de larvas.
NOTA: Idealmente, inyectar 2 x 2,5 veces el número de larvas necesarias para los experimentos. Habrá alguna sesión de muerte de larvas debido al estrés de la inyección y el aumento de la temperatura de incubación. Típicamente, después de la práctica con la técnica, 800-1.500 larvas de pez cebra pueden ser inyectadas por una sola persona dentro de la 1 a 3 h cuando se deben inyectar células manchadas. - Mover las placas de las larvas inyectadas a una incubadora de 34oC. No coloque los platos Petri de larvas directamente sobre una plataforma metálica en la incubadora para evitar el sobrecalentamiento del agua E3. Por ejemplo, coloque un plato petri vacío entre el estante y el plato Petri de larvas para actuar como un tampón. Retire las larvas de pez cebra muertas después de 24 y 48 horas después de la inyección (hpi).
4. Configuración de la pantalla de drogas con peces cebra xenoinjerados
-
A 48 hpi, examina las larvas de peces cebra para detectar fluorescencia/injerto tumoral y salud(Figura 2C,D). Retire cualquier pez cebra muerto o malformado y seleccione el pez cebra con injerto similar(Figura 2C,D, 1-3 y 1'-3'). Retire el pez cebra sin injertar(Figura 2C,D, 5 y 5').
- En el caso de los peces inyectados en yema, retire los peces donde no se puedan ver los bordes de la yema alrededor de la masa celular injertada(Figura 2C, 4) ya que dificulta la cuantificación. En el caso del pericardio inyectado, retire el pescado en el que la masa celular inyectada invada el saco de yema(Figura 2D,4').
- Agregue el pez cebra a un plato de 96 pocillos. Para ello, corte la punta de una punta de pipeta de 200 ml, lo suficientemente grande como para que un pez cebra de 4 dpf se ajuste. Aspirar 150 l de medios E3 con un pez cebra de la placa usando una pipeta P200, y añadir a un pozo vacío de una placa de fondo plano de 96 pocillos.
- Diluir el medicamento a probar en el volumen requerido de medios E3, a 150 l por pocido. Preparar el medicamento a 2 veces la concentración deseada. Por ejemplo, prepare 20 m de fármaco en E3 si la concentración final deseada es de 10 m, ya que la mitad del volumen total en cada pozo se compone de la solución del medicamento. Para el grupo de control DMSO, agregue DMSO al mismo volumen que el medicamento.
- Añadir 150 l de solución de fármaco diluido a cada pocal que contenga larvas de pez cebra en 150 l de E3, para un volumen final de 300 l con 1 solución de fármaco por poca.
- Incubar la placa a 34oC. Compruebe si hay peces cebra muertos todos los días. Después de 2 días, si se desea, refrescar el medicamento mediante la eliminación de 200 l de líquido de cada pozo de la placa de 96 pocillos y reemplazar con 200 l de 1x solución de fármaco diluido o DMSO en medios E3.
NOTA: Los mejores resultados se encontraron después de 3 días de tratamiento farmacológico para este experimento; sin embargo, la duración del tratamiento farmacológico puede variar entre 2 y 4 días y puede ser necesario optimizar en función del experimento que se está haciendo o drogas que se utilizan.
5. Imágenes de peces cebra xenoinjerados mediante una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de muestreador automatizada
- Preparar 1 L de triaína fresca de 4 mg/ml y 1,5 L de medios E3. Llene la botella de medios 1 con e3 media y media bottle 2 con tricaína.
- Elimine todos los canales fluorescentes no deseados en el software de imágenes y agregue el canal deseado (DiI para este experimento). Compruebe el canal fluorescente deseado, ya que solo se tomará una imagen para los canales con una marca de verificación. Además, seleccione cómo se tomarán las imágenes (pilas z, automatización, bucles en serie, etc.).
NOTA: Para este experimento, el enfoque se estableció manualmente para cada pez de la imagen para obtener el mayor número de imágenes con un enfoque óptimo. - Imagen del pez de control DMSO antes de los peces tratados con drogas para que se pueda establecer el tiempo de exposición adecuado en el software de imágenes. Una vez establecida la exposición, no cambie el tiempo de exposición durante la duración del experimento.
NOTA: El enfoque se puede ajustar manualmente para cada pez cebra para asegurarse de que no hay imágenes fuera de foco, o para imágenes totalmente automatizadas, el mismo enfoque se puede utilizar entre peces con imágenes fuera de foco que se descartan o peces reimaged antes de realizar el análisis. Además, este experimento podría llevarse a cabo utilizando cualquier imagen fluorescente seguida de cuantificación de la fluorescencia utilizando el software ImageJ.
6. Cuantificación de la fluorescencia con ImageJ
- Abra el software ImageJ.
-
Ir a Archivo ? Abra y seleccione el archivo .czi deseado. El software mostrará una ventana de opciones de importación.
- Para la visualización de la pila, seleccione Hyperstacks, seleccione Abrir archivos individualmente, seleccione Escalado automáticoy seleccione Dividir canales. Para la opción de color, seleccione Colorizado.
- Haga clic en Plugins (Plugins) Macros de la página de macros de la Grabar.
- Haga clic en Imagen ( Image) Ajustar ? Umbral. Seleccione el tipo de imagen como rojo en el menú desplegable en el lado derecho de la ventana de umbral. Ajuste el umbral mínimo hasta que el software solo resalte áreas con fluorescencia(Figura 3A)y haga clic en Aplicar. El software convertirá la foto a blanco y negro, con el área seleccionada en negro.
NOTA: Utilice el mismo umbral para cada imagen en la pantalla de drogas para mantener los resultados estandarizados y comparables. - Haga clic en Analizar (Analizar) Medir. El software abrirá una ventana de resultados que contiene el área fluorescente para esa imagen.
- Haga clic en Crear en la ventana Grabadora de macros. Esto abrirá una nueva ventana con el código de la macro. Resalte todas las imágenes deseadas para el análisis y ábralas como en el paso 6.2.
- Seleccione Ejecutar en la ventana con la macro. La ventana de resultados ahora contendrá el área de cada imagen.
NOTA: El análisis de imagen se puede realizar individualmente sin grabar y ejecutar una macro, así como repitiendo los pasos anteriores para cada imagen. - Copie los datos medidos en una hoja de cálculo. Promedio de la fluorescencia total de todas las muestras de control (DMSO). Calcule la diferencia porcentual utilizando la siguiente fórmula: –[(área media DMSO – área experimental)/área DMSO promedio] x 100%(Figura 3B).
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Representative Results
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, el pez cebra fue xenointizado en la yema y el pericardio con PBL de pacientes primarios que originalmente se aislaron de un paciente con leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) en el diagnóstico y depositados como una muestra viable y congelada. A 48 hpi, los peces xenoinjerados fueron examinados en busca de células tumorales etiquetadas fluorescentesmente(Figura 2C,D)y tratados con quimioterapia (dexametasona o vincristina) o DMSO. Los peces fueron observados a 7 dpi, después de 3 días de tratamiento farmacológico utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada(Figura 3A).
La carga de área fluorescente/tumor se midió para cada pez que se imaginó utilizando ImageJ y se comparó entre los diferentes grupos de tratamiento farmacológico y DMSO(Figura 3B). En general, los peces xenoinjerados tratados con vincristina mostraron la disminución más grande y consistente de la masa celular xenointizada en comparación con los peces tratados con DMSO. Los peces tratados con dexametasona mostraron aproximadamente la mitad de la reducción en la zona tumoral en comparación con la vincristina, pero todavía mostraron una reducción en el área del tumor en comparación con DMSO(Figura 3). Esto imitaba lo que se vio en el paciente, ya que su leucemia respondió rápidamente a la terapia con una combinación de dexametasona y vincristina. Estos resultados demuestran la capacidad de los modelos de xenoinjerto de pez cebra para ser susceptibles a la detección de fármacos y la creación de imágenes y cuantificación automatizadas, proporcionando una plataforma para analizar varias muestras de pacientes o líneas celulares con diferentes combinaciones de fármacos o fármacos.
Figura 1: Pantalla de fármaco sin xenoinjerto y flujo de trabajo de imágenes. Esquema del flujo de trabajo de las larvas de pez cebra de xenografting y la realización de la pantalla de fármacos, incluida la toma de imágenes en una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Lugar de inyección e imágenes representativas de los peces xenoinjerados de cribado. Imágenes de la aguja del microinyector en el momento de la inyección en la yema (A) o pericardio (B) de 2 larvas de pez cebra dpf. Imágenes representativas de cribado a 2 dpi representan la selección de pez cebra para la pantalla de drogas (C,D). Se debe seleccionar el pez cebra con injerto similar (1-3 y 1'-3'), se debe eliminar el pez cebra sin injertar (5 y 5'). En el caso de los peces inyectados en yema, retire los peces donde no se puedan ver los bordes de la yema alrededor de la masa celular injertada (4), ya que dificulta la cuantificación. En el caso del pericardio inyectado, retire el pescado donde la masa celular inyectada invada en el saco de yema (4'). Barra de escala de 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El tratamiento farmacológico puede reducir in vivo el área tumoral xenointizada. Imágenes representativas del pez cebra inyectado en el pericardio o yema después de 3 días de tratamiento con DMSO o medicamentos, ya sea vincristina o dexametasona. El área de masa tumoral injertada se cuantificó estableciendo un umbral de fluorescencia utilizando ImageJ, seleccionando todos los píxeles por encima del umbral establecido y midiendo el área y la fluorescencia media de las regiones seleccionadas. Los píxeles situados por encima del umbral seleccionado aparecen en negro, mientras que los píxeles por debajo del umbral aparecen en blanco. Los píxeles se midieron tanto en las imágenes de pez cebra inyectadas en la yema como en el pericardio (A). El tratamiento con vincristina condujo a una disminución en el área del tumor injertado en comparación con el control de DMSO con n a 4 peces tratados por grupo (B). SD - desviación estándar. Barra de escala de 250 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, demostramos un método estandarizado para la descongelación y la inyección de células de leucemia de pacientes primarios en el pez cebra como modelo de xenoinjerto. También establecimos un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento de peces cebra xenoinjerados utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Anteriormente, se han notificado xenoinjertos con líneas celulares humanas, y la cuantificación de tumores xenoinjerados de una manera de alto rendimiento ha sido un desafío en el campo. Este método sirve como base para que los estudios utilicen una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada como una forma de automatizar la toma de imágenes de peces cebra xenoinjerados, con el objetivo final de realizar pantallas de fármacos de alto rendimiento para predecir a qué medicamentos puede responder el cáncer de un paciente específico, abriendo la posibilidad de una medicina más personalizada.
A pesar de la capacidad de automatizar gran parte de este protocolo, todavía hay muchos desafíos técnicos que no deben pasarse por alto. En primer lugar, es fundamental que las células se inyecten en el pez cebra lo antes posible después de la tinción para evitar el aglutinamiento celular y la muerte celular. Las larvas tendrán que ser desconfiónizadas antes de realizar el protocolo de tinción celular. Las agujas de filamento de vidrio también deben mantenerse frías antes de cargar la aguja para reducir la obstrucción de la aguja. Además, el uso de embriones producidos por peces cebra adultos sanos de 6 meses a 1 año es fundamental para garantizar la mejor viabilidad de las larvas xenoinjeradas. Por último, los peces xenoinjerados deben ser cuidadosamente examinados para detectar el injerto tumoral, y sólo aquellos con volúmenes tumorales similares deben utilizarse en la detección de fármacos para reducir la variabilidad en los resultados finales.
Aunque utilizamos PCO de leucemia de pacientes primarios para nuestros experimentos, este protocolo se puede realizar con cualquier tipo de tumor o línea celular de cáncer. Para las líneas celulares en cultivo, las células adherentes deben ser trippsinizadas y luego lavadas en PBS antes de continuar con el protocolo de tinción. También es importante tener en cuenta que las tasas de injerto pueden variar de una muestra a la siguiente y entre los tipos de muestra15. Por ejemplo, en nuestra muestra de PBMC, >90% de los PBMC circulantes eran explosiones leucémicas, pero este número puede variar significativamente de un paciente a otro, lo que puede afectar la tasa de injerto. Debido a que los resultados se comparan con un control DMSO dentro del mismo tipo de muestra, hay un control interno para la tasa de injerto, sin embargo, esta variación debe tenerse en cuenta al decidir cuántas células inyectar por pez cebra. Hemos encontrado éxito cuando se utilizan 250 a 1.000 células inyectadas por animal, siendo 500 óptimas para nuestros estudios. Si bien nuestros experimentos concluyeron cuando las larvas eran de 7 dpf, no esperaríamos que los xenoinjertos sobrevivieran en los animales durante más tiempo, ya que el sistema inmunitario comienza a desarrollarse en este punto, y probablemente causaría rechazo de las células humanas. Se han creado líneas de pez cebra inmune comprometidas, con prkdc-/-;il2rga-/- pez cebra capaz de injertar células cancerosas humanas16,17, que pueden ser útiles para xenoinjertos a largo plazo o evaluar la recurrencia del tumor después del tratamiento farmacológico. Sin embargo, estas líneas inmunodeficientes deben mantenerse como heterocigotes, por lo que las larvas deben ser genotipadas antes de su uso. Los peces homocigotos también deben tratarse con medicamentos para agotar los macrófagos para permitir un injerto fiable de células humanas, lo que puede complicar los resultados de la detección de fármacos. Actualmente, estas líneas no son prácticas ni necesarias para el cribado de fármacos a gran escala en larvas, que se pueden completar antes de que el sistema inmunitario sea completamente funcional a 7 dpf18.
Nuestros resultados representativos se centran en la inyección de células en el pericardio y la yema para la facilidad y la velocidad de la inyección y mayor viabilidad; sin embargo, las células cancerosas se pueden inyectar en muchos otros lugares anatómicos y hemos tenido éxito usando este flujo de trabajo en otros sitios, incluyendo el conducto de Cuvier, cerebro, retro-orbital, y el saco periviellina. Además, es difícil estimar la cantidad de cada medicamento que absorben los peces larvarios; si se utilizan pocos fármacos, idealmente se realizará una pantalla de toxicidad en una serie de dosis (generalmente de 0,1 a 25 m) antes del ensayo a gran escala para determinar la dosis máxima tolerada (MTD). Elegimos utilizar el MTD para cada medicamento para nuestro ensayo, sin embargo, 10 m de droga se utiliza comúnmente en el campo de peces cebra como una concentración inicial para el cribado de drogas de alto rendimiento y es generalmente bien tolerado. Combinaciones de medicamentos en piscinas se pueden utilizar como una pantalla inicial, así, para aumentar la eficiencia de la detección a través de una biblioteca compuesta de gran volumen19.
Aunque este enfoque es más automatizado y eficiente que los flujos de trabajo notificados anteriormente, este sigue siendo un protocolo que requiere mucha mano de obra y técnicamente desafiante para cualquier persona sin experiencia previa en la microinyección de peces cebra. Es poco probable que el cribado farmacológico en xenoinjertos de peces cebra alcance la facilidad y eficacia del cribado in vitro de bibliotecas compuestas y carezca de algunas ventajas de los modelos de xenoinjertos de ratón. Por ejemplo, una limitación importante con los xenoinjertos de peces cebra es que las células cancerosas no se pueden recuperar fácilmente de los peces después de xenografting en números útiles para la banca celular o la mayoría de los experimentos posteriores. Incluso si esto fuera posible, las células cancerosas humanas habrían estado creciendo durante varios días en temperaturas y entornos no fisiológicos y no serían prácticos para su uso en aplicaciones posteriores. También se conocen los efectos de una temperatura ligeramente inferior a la fisiológica en la cinética de los fármacos y la respuesta de las células tumorales, y pueden producir resultados de confunción. A pesar de estas advertencias, los xenoinjertos de pez cebra llenan un vacío al ser un método más práctico y rentable para realizar pantallas de fármacos in vivo a mayor escala de lo que es posible en los modelos de xenoinjertos de ratón. Además, los xenoinjertos de pez cebra requieren muchas menos células inyectables que los modelos de ratón, por lo que una pequeña cantidad de muestra de paciente se puede distribuir entre cientos a miles de peces cebra, lo que permite pantallas de fármacos con grandes números de muestra. Con el etiquetado fluorescente, las células tumorales pueden ser monitoreadas desde el momento en que son xenoinjeradas en el pez cebra larval, proporcionando cierta estandarización entre los animales utilizados en las pantallas de drogas. La combinación de estos beneficios de los xenoinjertos de pez cebra con la posibilidad de imágenes automatizadas y cuantificación de células injertadas abre muchas posibilidades para hacer realidad la detección de fármacos de alto rendimiento de tumores de pacientes para la medicina personalizada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por un V Foundation V Scholar Award y NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (a J.S. Blackburn) y NIH Training Grant T32CA165990 (a M.G. Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
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