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Cancer Research

बाधा आधारित वास्तविक समय कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण के माप

Published: April 2, 2020 doi: 10.3791/60997
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Children's Mercy Research Institute, Children's Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri Kansas City School of Medicine

Summary

कैंसर विभिन्न अंगों को मेटास्टेसाइज करने की क्षमता के कारण घातक बीमारी है। विभिन्न उपचार शर्तों के तहत माइग्रेट और आक्रमण करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता का निर्धारण चिकित्सकीय रणनीतियों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल ग्लियोब्लास्टोमा कैंसर सेल लाइन की वास्तविक समय की मेटास्टैटिक क्षमताओं का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

कैंसर आनुवंशिक अस्थिरता, उत्परिवर्तन, और पर्यावरण और अन्य तनाव कारकों द्वारा शुरू की कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार के कारण उत्पन्न होता है। जटिल, बहुस्तरीय आणविक सिग्नलिंग नेटवर्क में ये असामान्यताओं का अधिग्रहण करते हैं, जो दूर के अंगों के लिए अद्यतित कोशिका प्रसार और अस्तित्व, बाह्य मैट्रिक्स क्षरण और मेटास्टेसिस को प्रेरित करते हैं। कैंसर से होने वाली लगभग 90% मौतें मेटास्टैटिक प्रसार के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष प्रभावों के कारण होने का अनुमान है। इसलिए, आनुवंशिक और पर्यावरणीय जोड़तोड़ पर कैंसर सेल व्यवहार की विशेषता के लिए एक अत्यधिक विश्वसनीय, व्यापक प्रणाली स्थापित करना महत्वपूर्ण है। ऐसी प्रणाली कैंसर मेटास्तासिस के आणविक नियमन और स्तरीकृत, सटीक चिकित्सीय रणनीतियों के सफल विकास के अवसर की स्पष्ट समझ दे सकती है। इसलिए, कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार का सटीक निर्धारण जैसे कि जीन (एस) के लाभ या कार्य की हानि के साथ प्रवास और आक्रमण कैंसर कोशिकाओं की आक्रामक प्रकृति के आकलन की अनुमति देता है। सेल बाधा के आधार पर वास्तविक समय माप प्रणाली शोधकर्ताओं को लगातार एक पूरे प्रयोग के दौरान डेटा प्राप्त करने और तुरंत विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में परिणामों की तुलना और मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाती है। पारंपरिक तरीकों के विपरीत, इस विधि को माइग्रेट या आक्रमण करने वाली कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए निर्धारण, धुंधला और नमूना प्रसंस्करण की आवश्यकता नहीं होती है। यह विधि पत्र प्रवास और ग्लियोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण के वास्तविक समय निर्धारण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं पर जोर देता है।

Introduction

कैंसर विभिन्न अंगों को मेटास्टेसाइज करने की क्षमता के कारण घातक बीमारी है। कैंसर जीनोटाइप और फेनोटाइप का निर्धारण प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों को समझने और डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है। कैंसर अनुसंधान के दशकों के विकास और विभिन्न तरीकों के अनुकूलन के लिए कैंसर जीनोटाइप और फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए नेतृत्व किया है । नवीनतम तकनीकी विकास में से एक सेल बाधा के आधार पर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय माप है। सब्सट्रेट्स और सेल-सेल संपर्कों के लिए सेल आसंजन सेल-टू-सेल संचार और विनियमन, विकास और ऊतकों के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कोशिका आसंजन में असामान्यताएं कोशिका-कोशिका संपर्क, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के क्षरण और कोशिकाओं द्वारा प्रवासी और हमलावर क्षमताओं के लाभ का कारण बनती हैं, जिनमें से सभी विभिन्न अंगों1,,2में कैंसर कोशिकाओं के मेटास्टेसिस में योगदान देते हैं। सेल माइग्रेशन (घाव भरने और बॉयडन चैंबर परख) और आक्रमण (मैट्रीगेल-बॉयडेन चैंबर परख)3,4,4,5निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीके उपलब्ध हैं। ये पारंपरिक तरीके अर्धमात्रात्मक हैं क्योंकि कोशिकाओं को सेल फेनोटाइप को मापने के लिए प्रयोग से पहले या बाद में फ्लोरोसेंट रंगया अन्य रंगों के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, घाव साइट पर कोशिकाओं के प्रवास को मापने के लिए घाव बनाने के लिए कुछ मामलों में यांत्रिक अवरोधों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ये मौजूदा तरीके समय लेने वाली, श्रम-प्रधान हैं, और परिणामों को केवल एक समय बिंदु पर मापते हैं। इसके अलावा, इन तरीकों को प्रायोगिक प्रक्रिया6के दौरान असंगत हैंडलिंग के कारण गलत माप बनाने के लिए प्रवण हैं ।

पारंपरिक तरीकों के विपरीत, वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली कोशिकाओं के पूर्व या पोस्टस्टेनिंग और यांत्रिक क्षति की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में सेल बाधा को मापता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि किसी प्रयोग की अवधि बढ़ाई जा सकती है ताकि जैविक प्रभावों का निर्धारण समय पर निर्भर तरीके से किया जा सके । प्रयोग को क्रियांवित करना समय कुशल है और श्रम-प्रधान नहीं है। डेटा का विश्लेषण अपेक्षाकृत सरल और सटीक है। अन्य तरीकों की तुलना में, यह विधि सेल माइग्रेशन और आक्रमण6,,7,,8,99को मापने के लिए सबसे अच्छा वास्तविक समय माप में से एक है।

गिएवर और कीज़ सबसे पहले इलेक्ट्रोड10की सतह पर एक सेल आबादी की बाधा आधारित माप का वर्णन करने वाले थे। वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली एक ही सिद्धांत पर काम करती है। प्रत्येक माइक्रोप्लेट का क्षेत्र लगभग 80% है जो सोने के माइक्रोइलेक्ट्रोड की एक सरणी से ढका हुआ है। जब इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र कोशिकाओं के पालन या प्रसार के कारण कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, तो विद्युत बाधा बदल जाती है। यह बाधा कोशिका सूचकांक के रूप में प्रदर्शित होती है, जो माइक्रोपोरस झिल्ली में प्रवेश करने के बाद इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र को कवर करने वाली कोशिकाओं के सीधे आनुपातिक होती है (इस झिल्ली का औसत ताकना आकार 8 माइक्रोन है)11।

Crk और CrkL SH2 और SH3 डोमेन युक्त अनुकूलक प्रोटीन हैं और साइटोस्केलेटन विनियमन, सेल परिवर्तन, प्रसार, आसंजन, विशेषण-मेसेन्हीमल संक्रमण, प्रवास, आक्रमण, और मेटास्तासिस जैसे विभिन्न सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, कई सिग्नलिंग रास्तों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में मध्यस्थता करके1,,12,,13,,14,,15,,16,17, 17, 17,, 18. इसलिए, कैंसर कोशिकाओं की सीआरके/सीआरकेएल-निर्भर प्रवासी और आक्रामक क्षमताओं का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है । सीआरसी और सीआरकेएल के जीन नॉकडाउन पर ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं की प्रवासी और आक्रामक क्षमताओं को निर्धारित करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषण किया गया था।

यह विधि पत्र Crk-और CrkL-मध्यस्थता प्रवास और मानव ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के आक्रमण के विस्तृत माप का वर्णन करता है ।

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Protocol

नोट: सभी सेल संस्कृति सामग्री बाँझ होने की जरूरत है और पूरे प्रयोग बाँझ परिस्थितियों में एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

1. U-118MG ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन की संस्कृति और इलेक्ट्रोपोशन

  1. संस्कृति 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में यू-118MG सेल लाइन जिसमें डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) (संस्कृति माध्यम) होते हैं और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर (संस्कृति की स्थिति) वाले आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  2. इलेक्ट्रोपॉरेशन के लिए 70- 80% कन्फ्लोरेंट हेल्दी सेल्स का इस्तेमाल करें।
  3. कोशिकाओं की कटाई के लिए, 1x पीबीएस के साथ संस्कृति व्यंजनों में बढ़ रही कोशिकाओं को धोएं और 0.05% ट्राइप्सिन-ईटीए के 2 मिलील जोड़ें। 30 एस के लिए इनक्यूबेटर में रखें और ट्राइप्सिन-EDTA को हटा दें। संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को 15 मिलीएल ट्यूब में एकत्र करें।
  4. एक हैंडहेल्ड स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें, 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, और supernatant त्यागें।
  5. संस्कृति माध्यम में सेल पैलेट को निलंबित करें और प्रत्येक स्थिति के लिए 600,000 कोशिकाओं को माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में लें। प्रयोगात्मक डिजाइनों और विकास दरों के आधार पर सेल संख्या समायोजित करें।
  6. सेल निलंबन को माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और डुल्बेकको के फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (डीपीबीएस) के 800 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए एक minicentrifuge का उपयोग कर नीचे स्पिन और अतिशयोक्ति त्यागें ।
  7. सेल पैलेट में रिस्पेंशन बफर आर के 60 माइक्रोन जोड़ें और संबंधित माइक्रोसेन्ड्रिफ्यूज ट्यूब में 6 माइक्रोमीटर की एकाग्रता पर सिनास (यानी, नॉन-टारगेटिंग सिना, सीआरके सिना, सीआरकेएल सिआरएनए, या दोनों सीआरके और सीआरकेएल सिआरएनए) जोड़ें। इन्हें धीरे-धीरे टैप करके मिलाएं।
  8. इलेक्ट्रोपोरेट 10 माइक्रोन कोशिकाओं के 10 माइक्रोन सिस्टम के साथ 1,350 वी पर 10 एमएस के लिए तीन दालों के साथ और इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम के 5 मिलील में स्थानांतरित करें। प्रत्येक स्थिति के लिए तैयार कोशिकाओं के बाकी के लिए इलेक्ट्रोपोशन दोहराएं।
  9. सभी संबंधित इलेक्ट्रोपोशन पूरा करें। प्रति स्थिति दो 35 मिमी व्यंजनों में इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और उन्हें 3 दिनों के लिए संस्कृति की स्थिति में संस्कृति करें।
  10. तीसरे दिन, वास्तविक सेल बाधा माप से पहले 6 घंटे के लिए डीएमईएम (कम सीरम माध्यम) वाले 0.5% एफबीएस में सभी इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं का इलाज करें।

2. रियल-टाइम सेल एनालिसिस सिस्टम, सेल आक्रमण और माइग्रेशन (सीआईएम) प्लेट्स, और चढ़ाना के लिए इलेक्ट्रोपोरेटेड यू-118MG कोशिकाओं की तैयारी

  1. संस्कृति की स्थिति के तहत एक सीओ2 इनक्यूबेटर में वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली रखें 5-6 एच संस्कृति की स्थिति के लिए प्रणाली को स्थिर करने के लिए प्रयोग की शुरुआत से पहले ।
  2. आक्रमण परख के लिए, सिम प्लेट के ऊपरी कक्ष के प्रत्येक कुएं में 0.1 μg/μL पर एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) जेल युक्त डीएमईएम (सादे माध्यम) की प्लेट 50 माइक्रोन। किसी भी हवा के बुलबुले होने से बचने के लिए, रिवर्स पाइपिंग विधि का उपयोग करें। तुरंत ईसीएम जेल के 30 μL को हटा दें, जिससे 20 माइक्रोन कुएं में छोड़ दें।
  3. ईसीएम जेल कोटिंग के बाद, प्लेट को अपने ढक्कन के साथ 4 घंटे के लिए संस्कृति की स्थिति के तहत इनक्यूबेटर में रखें। ईसीएम जेल कोटिंग और सुखाने के दौरान, हाथों से प्लेटों के ऊपरी कक्ष के इलेक्ट्रोड के सीधे संपर्क से बचने के लिए निवारक उपाय करें, बायोसेफ्टी कैबिनेट की सतहें, या सीओ2 इनक्यूबेटर।
  4. बाधा माप कार्यक्रम स्थापित करने के लिए, सिस्टम सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन (नियंत्रण इकाई) खोलने के लिए संबद्ध सॉफ्टवेयर आइकन (सामग्री की तालिकादेखें) को दोगुना क्लिक करें। प्रत्येक पालना में प्रयोगात्मक स्थितियों, समय अंतराल और अवधि को मापने में बाधा, और डेटा विश्लेषण निर्धारित करने के लिए विभिन्न टैब के साथ एक व्यक्तिगत खिड़की होती है।
  5. लेआउट टैब के तहत, प्रत्येक जैविक स्थिति के लिए चौगुनी कुओं को सेट करें और शेड्यूल टैब के तहत दो-चरण सेल बाधा माप निर्धारित करें। पहला कदम एक बार बेसलाइन माप (1 मिन अंतराल के साथ एक झाडू) के लिए है, और दूसरा कदम वास्तविक प्रयोग के लिए संबंधित व्यक्तिगत पालना में सेल बाधा को मापने के लिए है। प्रवास के लिए, 10 मिन अंतराल के साथ 145 स्वीप का उपयोग करें, और आक्रमण के लिए, संबंधित व्यक्तिगत पालना में व्यक्तिगत रूप से सेट, 10 मिन अंतराल के साथ 577 स्वीप्स।
  6. सेल बाधा माप की शुरुआत से पहले एक एच, प्लेट के निचले कक्ष के कुओं में एक कीमोआकर्षितेंट के रूप में 10% एफबीएस के साथ DMEM के 160 μL जोड़ें। आक्रमण और प्रवास को मापने के लिए निचले कक्ष के साथ ईसीएम जेल-लेपित कुओं या अनकोटेड कुओं वाले ऊपरी कक्ष को क्रमशः इकट्ठा करें।
  7. ऊपरी कक्ष में कुओं को 50 माइक्रोन कम सीरम माध्यम से भरें और उन्हें सिस्टम के पालने में रखें। चेक करें कि सभी कुओं को कंट्रोल यूनिट द्वारा मैसेज टैब पर क्लिक करके पहचाना जाता है या नहीं। यदि संदेश ठीकहै के रूप में प्रदर्शित करता है, पालने में थाली प्रयोग के लिए तैयार है ।
  8. वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली पालना में माप से पहले 1 एच के लिए संस्कृति की स्थिति के तहत इनक्यूबेटर में पूरी तरह से पैक प्लेटों को प्रीइनक्यूबेट करें, जो सेल संस्कृति की स्थितियों के लिए एक पैक प्लेट के अनुकूलन के लिए आवश्यक है।
  9. कम सीरम माध्यम के साथ इलाज कोशिकाओं की कटाई के लिए, चरण 1.3 के रूप में कोशिकाओं को ट्रिपिन करें, उन्हें कम सीरम माध्यम में एकत्र करें, और कोशिकाओं को चरण 1.4 में गिनें।
  10. गिनती के बाद, 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और supernatant त्यागें।
  11. प्रवास और आक्रमण परखों के लिए कम सीरम माध्यम के 800 माइक्रोन में 800,000 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इसके अतिरिक्त, सीआरके और सीआरकेएल के विनियमित नॉकडाउन की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए 35 मिमी पकवान में संस्कृति माध्यम और बीज के 2 एमएल में 300,000 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।

3. बेसलाइन रीडिंग, कोशिकाओं की सीडिंग, और सेल बाधा माप और दृश्य

  1. पालना स्टार्ट बटन पर क्लिक करके बेसलाइन रीडिंग को मापें। बेसलाइन को सीओ2 इनक्यूबेटर में संस्कृति की स्थिति के तहत वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली के पालने में 1 घंटे के लिए प्लेटों को प्रीइनक्यूबेटिंग करने के बाद और ऊपरी कक्ष में संबंधित कुओं को कोशिकाओं को बोने से पहले पढ़ा जाना चाहिए।
    नोट: एक बार पालना स्टार्ट बटन क्लिक करने के बाद, नियंत्रण इकाई पूछेगी कि प्रायोगिक फ़ाइल को सहेजना है या नहीं। फ़ाइल के सहेजे जाने के बाद, पालना एनालाइजर शुरू में कार्यक्रम में सेट के रूप में बेसलाइन सेल बाधा को मापता है और दूसरे चरण में सेल बाधा को मापने के लिए पालना स्टार्ट बटन को फिर से क्लिक करने तक एक ठहराव मोड में प्रवेश करता है।
  2. बेसलाइन माप के बाद पालने से माइग्रेशन और आक्रमण के लिए दोनों प्लेटों को बाहर निकालें और उन्हें बायोसेफ्टी कैबिनेट में रखें।
  3. संबंधित कुओं में सीआईएम प्लेट के ऊपरी कक्ष में प्रत्येक जैविक स्थिति के लिए चौगुनी कोशिकाओं में कोशिकाओं के बीज 100 माइक्रोन (100,000 कोशिकाएं) हवा के बुलबुले से बचने के लिए रिवर्स पाइपटिंग द्वारा पालना की नियंत्रण इकाई में प्रोग्राम किए गए हैं।
  4. सीडिंग के बाद, कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत प्लेट रखें ताकि कोशिकाओं को समान रूप से नीचे बसने की अनुमति दी जा सके। प्लेट को संबंधित पालने में वापस स्थानांतरित करें और 2.5 के दूसरे चरण में प्रोग्राम किए गए सेल बाधा को मापने के लिए पालना प्रारंभ बटन पर क्लिक करें।
  5. आखिरी स्वीप के बाद, प्रयोग समाप्त हो जाता है, और परिणाम स्वचालित रूप से सहेजे जाते हैं।
  6. डेटा विश्लेषण टैब के तहत, प्रयोग के पूरा होने के दौरान या उसके पूरा होने के दौरान या उसके बाद समय-निर्भर तरीके से सेल इंडेक्स के रूप में सेल बाधा में परिवर्तन की कल्पना करें। चौगुनी परिस्थितियों में से प्रत्येक को औसत और मानक विचलन के लिए विकल्प बक्से पर क्लिक करके व्यक्तिगत रूप से या औसत और/या मानक विचलन के रूप में कल्पना की जा सकती है ।
  7. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए सेल इंडेक्स डेटा निर्यात करने के लिए, एक खाली स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें, कर्सर को डेटा विश्लेषण विंडो के बीच में रखें, और सही क्लिक करें। दिखाई देने वाले संवाद बॉक्स में,विकल्प कॉपी डेटा को सूची प्रारूप में चुनें, और डेटा को खुली स्प्रेडशीट में चिपका दें।
  8. सेल बाधा माप के वास्तविक शुरुआत समय का प्रतिनिधित्व करने के लिए कच्चे डेटा में समय समायोजित करें। दूसरा चरण प्रारंभ समय शून्य के रूप में निर्धारित किया गया है।
    नोट: नियंत्रण इकाई के पास सामान्यीकरण (यानी, सामान्यीकृत सेल इंडेक्स) के साथ या बिना सेल इंडेक्स प्राप्त करने और परिणामों को समय-निर्भर तरीके से ग्राफिकल प्रस्तुति के रूप में कल्पना करने का विकल्प है। इस उदाहरण में, सेल इंडेक्स डेटा प्रसंस्करण और चित्रमय प्रस्तुति के लिए सामान्यीकरण के बिना निर्यात किया जाता है।
  9. प्रत्येक पालना में रिलीज बटन पर क्लिक करके प्रयोग जारी करें।

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Representative Results

यह सुझाव दिया गया है कि सीआरके और सीआरकेएल13,17विभिन्न कैंसर कोशिका रेखाओं में सेल माइग्रेशन और आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं । हालांकि Crk और CrkL प्रोटीन संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से एक दूसरे के समान है और आवश्यक अतिव्यापी कार्य16,,19,,20,,21खेलते हैं, Crk और CrkL के लिए कई जीन नॉकडाउन अध्ययन स्पष्ट रूप से संबोधित नहीं किया है कि नॉकडाउन या तो Crk, CrkL, या दोनों के लिए विशिष्ट है । इसलिए, यह स्पष्ट नहीं है कि दो प्रोटीन में से कौन सा सेल माइग्रेशन और आक्रमण में योगदान देता है। एक सबूत के सिद्धांत अध्ययन के रूप में, हम Crk या CrkL के लिए विशिष्ट siRNAs इस्तेमाल किया और प्रवास और U-118MG GBM सेल लाइन के आक्रमण पर उनके प्रभाव का अध्ययन किया । सीआरके के नॉकडाउन ने सीआरकेएल प्रोटीन के स्तर को कम किए बिना क्रमशः सीआरकेआई और सीआरकेआई प्रोटीन के स्तर में ८५% और ८६% की कमी की । सीआरकेएल के नॉकडाउन ने सीआरकेएल प्रोटीन के स्तर को 85%(चित्रा 1)तक कम कर दिया। CrkL नॉकडाउन थोड़ा CrkII और CrkI के स्तर को कम भी । सीआरके और सीआरकेएल के लिए सिनास के संयुक्त उपयोग ने सीआरकेआई, सीआरकेआई और सीआरकेएल के स्तर को 80% से अधिक कम कर दिया(चित्रा 1 B)। दूसरी ओर, Crk और CrkL के नॉकडाउन ने विनकुलिन और α-ट्यूबलिन के स्तर(चित्रा 1)को प्रभावित नहीं किया।

यू-118MG कोशिकाएं उच्च सीरम (10% एफबीएस) में चली गईं, जो 13 घंटे में माइग्रेशन के अधिकतम स्तर तक पहुंच गईं, जो प्रयोग आंतरिक नियंत्रण(चित्रा 2ए)के रूप में कार्य करती हैं। Crk नॉकडाउन के साथ, सेल माइग्रेशन में देरी हुई, और कोशिकाओं को 23 घंटे CrkL नॉकडाउन काफी हद तक सेल प्रवास बाधित जब तक प्रवास जारी रखा । U-118MG कोशिकाओं दोनों Crk और CrkL(चित्रा 2A)के नॉकडाउन पर अपनी प्रवासी क्षमता खो दिया है, सुझाव है कि Crk और CrkL कैंसर सेल प्रवास में आवश्यक अतिव्यापी भूमिकाएं निभाते हैं । हालांकि, यह निष्कर्ष स्पष्ट नहीं है अगर सेल माइग्रेशन की जांच एक निश्चित समय बिंदु पर की जाती है। जब 6 या 13 घंटे में सेल माइग्रेशन की तुलना की गई, तो Crk और CrkL नॉकडाउन द्वारा संकोच स्पष्ट थे(चित्रा 2B,सी)। इसके विपरीत, Crk नॉकडाउन 18 घंटे(चित्रा 2D)में सेल माइग्रेशन पर एक निरोधात्मक प्रभाव नहीं था, तुलना के लिए चयनित समय बिंदु के आधार पर परस्पर विरोधी परिणाम के लिए अग्रणी । सीआरकेएल नॉकडाउन और सीआरके/सीआरकेएल डबल नॉकडाउन के निरोधात्मक प्रभाव सभी तीन समय बिंदुओं पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे । इन परिणामों को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करता है कि सेल प्रवास की पूरी अवधि में आनुवंशिक जोड़तोड़ या दवाओं द्वारा प्रभाव का सही विश्लेषण करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

U-118MG कोशिकाओं उच्च सीरम पर हमला किया, ५२ घंटे है, जो प्रयोग आंतरिक नियंत्रण(चित्रा 3A)के रूप में कार्य पर आक्रमण के अधिकतम स्तर तक पहुंचने । Crk नॉकडाउन के साथ, सेल आक्रमण में देरी हुई, लेकिन यह ६० घंटे पर एक समान अधिकतम स्तर पर पहुंच गया । CrkL नॉकडाउन के साथ, U-118MG कोशिकाओं को नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना में देरी और कम आक्रमण दिखाया । Crk और CrkL के संयुक्त नॉकआउट आगे सेल आक्रमण(चित्रा 3A)हिचकते हैं । 36 एच में सेल आक्रमण की तुलना, जब नियंत्रण कोशिकाओं को सक्रिय रूप से आक्रमण के दौर से गुजर रहे थे, स्पष्ट रूप से CrkFigure 3Bऔर CrkL के व्यक्तिगत नॉकडाउन और Crkkद्वारा एक सहक्रियात्मक अवरोध द्वारा अवरोध का प्रदर्शन/ हालांकि, 52 या 60 घंटे में सेल आक्रमण की तुलना ने Crk नॉकडाउन(चित्रा 3C,डी)द्वारा मामूली या कोई निरोधात्मक प्रभाव प्रदर्शित किया। ये परिणाम स्पष्ट रूप से सुझाव का समर्थन करते हैं कि प्रयोग की पूरी अवधि में सेल आक्रमण का विश्लेषण किया जाना चाहिए।

इन परिणामों से पता चलता है कि दोनों Crk और CrkL मध्यस्थता सेल प्रवास और आक्रमण, और है कि वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली सेल प्रवास और आक्रमण और आक्रमण के विभिंन काइनेटिक्स को समझने में पारंपरिक तरीकों पर एक स्पष्ट लाभ है समय-निर्भर तरीके से सेल फेनोटाइप पर विशिष्ट प्रभाव।

Figure 1
चित्रा 1: यू-118MG कोशिकाओं में सीआरकेआई, सीआरकेआई और सीआरकेएल के siRNA-मध्यस्थता नॉकडाउन। (क)यू-118MG कोशिकाओं को गैर-लक्षित नियंत्रण सिआरएनए (एनटी), सीआरके सिआरएनए, सीआरकेएल सिआरएनए, या सीआरके और सीआरकेएल दोनों siRNAs के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किए जाने के 4 दिन बाद कुल सेल लाइसेट्स तैयार किए गए थे, और प्रोटीन का स्तर पश्चिमी दाग विश्लेषणों द्वारा निर्धारित किया गया था जैसा कि पहले1वर्णित है । (ख)इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके संबंधित बैंडों की संकेत तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी और एनटी के प्रतिशत के रूप में गणना की गई थी । उनके मतलब ± एसडी मूल्यों ग्राफ में दिखाया गया है। विंकुलिन और ए-ट्यूबलिन ने आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। दो प्रायोगिक समूहों के बीच तुलना के लिए अनपेयर टू-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे । * एनटी की तुलना में पी एंड एलटी; 0.05 और **पी एंड एलटी; 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: यू-118MG सेल माइग्रेशन पर Crk/CrkL नॉकडाउन के प्रभाव:(ए)यू-118MG कोशिकाओं को गैर-लक्षित नियंत्रण siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, या दोनों Crk L siRNAs के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया, कोशिकाओं को काटा गया और सेल माइग्रेशन वास्तविक समय विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर के जांच की गई । यू-118MG कोशिकाओं का प्रवास समय-निर्भर तरीके से Crk या CrkL के एक नॉकडाउन के साथ बाधित था । Crk और CrkL दोनों के नॉकडाउन पूरी तरह से सेल माइग्रेशन अवरुद्ध । सेल इंडेक्स मान 6(बी),13(सी)और 18 घंटे(डी)पर अलग-अलग समय बिंदुओं (तीर) पर सेल माइग्रेशन की तुलना करने के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं। 13 घंटे में नियंत्रण कोशिकाओं (NT) अधिकतम प्रवास तक पहुंच गया । 18 एच में दोनों नियंत्रण और Crk नॉकडाउन कोशिकाओं सेल प्रवास के समान स्तर दिखाया । दो प्रायोगिक समूहों के बीच तुलना के लिए अनपेयर टू-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे । एनटी की तुलना में 0.01 पी एंड एलटी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: यू-118MG सेल आक्रमण पर Crk/CrkL नॉकडाउन के प्रभाव:(ए)यू-118MG कोशिकाओं के तीन दिन बाद गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, या दोनों Crk और CrkL siRNAs, कोशिकाओं काटा गया था और सेल आक्रमण 4 दिनों के लिए जांच की गई थी वास्तविक समय विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर । यू-118MG कोशिकाओं पर आक्रमण को समय-निर्भर तरीके से Crk या CrkL के एक नॉकडाउन के साथ बाधित किया गया था। यू-118MG सेल लाइन में सीआरसी और सीआरकेएल दोनों के नॉकडाउन ने एनटी की तुलना में अपनी आक्रामक क्षमता को ४८ घंटे तक कम कर दिया । सेल सूचकांक मूल्यों पर ३६(बी),५२(सी),और ६० घंटे(डी)अलग समय बिंदुओं (तीर) पर सेल आक्रमण की तुलना करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । 52 घंटे में, नियंत्रण कोशिकाओं (NT) आक्रमण के प्रारंभिक शिखर पर पहुंच गया। ६० घंटे में, Crk नॉकडाउन कोशिकाओं आक्रमण के प्रारंभिक शिखर पर पहुंच गया । दो प्रायोगिक समूहों के बीच तुलना के लिए अनपेयर टू-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे । * एनटी की तुलना में पी एंड एलटी; 0.05 और **पी एंड एलटी; 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय माप एक सरल, त्वरित और निरंतर निगरानी प्रक्रिया है जिसमें पारंपरिक तरीकों पर कई, महत्वपूर्ण लाभ हैं जो एक ही समय बिंदु पर डेटा प्रदान करते हैं। पारंपरिक तरीकों के साथ, वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली के लिए प्रत्येक सेल लाइन के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित किया जाना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक सेल लाइन सब्सट्रेट, विकास, सेल-टू-सेल संपर्कों और प्रवासी के लिए अपने आसंजन के संदर्भ में अलग हो सकती है और आक्रामक क्षमताओं। इन मतभेदों के कारण, प्रत्येक सेल लाइन अलग-अलग सेलुलर काइनेटिक्स और सेल बाधाओं को दिखा सकती है। बाधा एक कुएं में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या, सेल आसंजन के लिए समय, कोशिकाओं के प्रवास या आक्रमण शुरू करने से पहले अंतराल समय, और सीआईएम प्लेटों पर ईसीएम जेल की एकाग्रता से बहुत प्रभावित होती है। सबसे पहले, वास्तविक समय सेल विश्लेषण अनुकूलन को आसान बनाता है क्योंकि यह एक विशिष्ट समय अवधि में वास्तविक समय में परिणाम प्रदान करता है, शोधकर्ताओं को समय बिंदु की पहचान करने में सक्षम बनाता है जब नियंत्रण कोशिकाएं सक्रिय सेल माइग्रेशन और आक्रमण दिखाती हैं और जब नियंत्रण कोशिकाएं प्रवास और आक्रमण के अधिकतम स्तर तक पहुंचती हैं। दूसरा, एक्टोपिक जीन ओवरएक्सप्रेशन या जीन नॉकआउट अध्ययनों के लिए अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि कोशिकाओं को संशोधित जीनोटिपिक परिवर्तनों से फेनोटाइप को अपनाने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रभावी दवा सांद्रता और दवाओं की प्रभावकारिता वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर सामान्य या संशोधित आनुवंशिक स्थितियों के संयोजन में निर्धारित किया जा सकता है।

घाव भरने, नरम आगर, बॉयडन चैंबर माइग्रेशन, या आक्रमण परख जैसे पारंपरिक तरीकों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया है कि सीआरसी या सीआरकेएल के नॉकडाउन से विभिन्न कैंसर सेल लाइनों13,,17में माइग्रेशन और आक्रमण कम हो जाता है। इस अध्ययन में, हमने यू-118MG सेल लाइन में Crk और CrkL के एकल या डबल नॉकडाउन को प्रेरित किया और सेल माइग्रेशन और आक्रमण की जांच की। सेल माइग्रेशन और आक्रमण के काइनेटिक्स के बारे में गहन जानकारी प्रदान किए गए पूरे प्रयोग पर सेल बाधाओं का वास्तविक समय मापन, जिससे हमें अवरोध के दो अलग-अलग तरीकों की पहचान करने की अनुमति मिल जाती है। जबकि Crk नॉकडाउन प्रवास और आक्रमण में देरी, CrkL नॉकडाउन पूरे समय अवधि में प्रवास और आक्रमण हिचकते । इसके अलावा, Crk और CrkL दोनों के डबल नॉकडाउन पूरी तरह से सेल माइग्रेशन अवरुद्ध और काफी हद तक सेल आक्रमण को बाधित करता है।

यह अध्ययन एक प्रमाण-अवधारणा प्रदान करता है जो प्रयोगों की पूरी अवधि में सेल माइग्रेशन और आक्रमण के वास्तविक समय के विश्लेषण के साथ Crk और CrkL के एकल और डबल नॉकडाउन को प्रेरित करने के लिए व्यवस्थित नॉकडाउन दृष्टिकोण का संयोजन करता है। कैंसर कोशिकाओं में सीआरके और सीआरकेएल-मध्यस्थता कार्यों का व्यापक विश्लेषण। इस अध्ययन में प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि इस विधि का उपयोग Crk और CrkL पर अपने निरोधात्मक प्रभावों के लिए उम्मीदवार दवाओं का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है । कुल मिलाकर, वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली सेल माइग्रेशन या सेल आक्रमण के लिए प्रयोगों की स्थापना में उपयोगी है और बनाता है वास्तविक समय, गहराई से, और व्यापक विश्लेषण संभव है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली डेटा के साथ उसकी तकनीकी सहायता के लिए ओलिविया दुर्गंध का शुक्रिया अदा करते हैं । हम इस पांडुलिपि को संपादित करने के लिए बच्चों की दया कंसास सिटी में चिकित्सा लेखन केंद्र का भी शुक्रिया अदा करते हैं। इस काम को टॉम Keaveny बाल चिकित्सा कैंसर अनुसंधान के लिए कोष संपन्न कोष द्वारा समर्थित था (टीपी के लिए) और बच्चों की दया अस्पताल मिडवेस्ट कैंसर एलायंस पार्टनर सलाहकार बोर्ड धन (टीपी के लिए) द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet ThermoFisher Scientific 1300 Series Class II, Type A2
CIM plates Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc 5665825001 Cell invasion and migration plates
Crk siRNA Dharmacon J-010503-10
CrkL siRNA Ambion ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) ATCC 302002 Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21-031-CV DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator ThermoFisher Scientific 51030285 CO2 incubator
Matrigel BD Bioscience 354234 Extracellular matrix gel
Neon electroporation system ThermoFisher Scientific MPK5000 Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit ThermoFisher Scientific MPK1025 Electroporation kit
Non-targeting siRNA Dharmacon D-001810-01 siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system) LI-COR Biosciences Western blot imaging system
RTCA software Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc Instrument used for experiment
Scepter Millipore C85360 Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
U-118MG ATCC ATCC HTB15 Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc 380601050 Instrument used for experiment

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १५८ कैंसर प्रवास आक्रमण बाधा आधारित वास्तविक समय माप ग्लियोब्लास्टोमा Crk
बाधा आधारित वास्तविक समय कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण के माप
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Mudduluru, G., Large, N., Park, T.… More

Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (158), e60997, doi:10.3791/60997 (2020).

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