Summary
암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.
Abstract
암은 유전 불안정성, 돌연변이 및 환경 및 그밖 긴장 요인에 의해 시작된 세포의 통제되지 않는 증식 때문에 생깁니다. 복잡한, 다층 분자 신호 네트워크에서 이 취득한 이상은 비정상적인 세포 증식 및 생존, 세포외 매트릭스 분해 및 먼 기관에 전이를 유도합니다. 암 관련 죽음의 대략 90%는 전이성 보급의 직접 또는 간접적인 효력에 기인하기 위하여 추정됩니다. 따라서 유전 적 및 환경 적 조작에 따라 암 세포 행동을 특성화하는 매우 신뢰할 수있는 포괄적 인 시스템을 구축하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템은 암 전이의 분자 조절에 대한 명확한 이해와 계층화 되고 정확한 치료 전략의 성공적인 개발을위한 기회를 제공 할 수 있습니다. 그러므로, 유전자의 기능의 이득 또는 손실과 가진 이동 및 침략과 같은 암세포 행동의 정확한 측정은 암세포의 공격적인 본질의 평가를 허용합니다. 세포 임피던스를 기반으로 한 실시간 측정 시스템을 통해 연구원은 전체 실험 중에 지속적으로 데이터를 수집하여 다양한 실험 조건에서 결과를 즉시 비교및 정량화할 수 있습니다. 기존의 방법과 달리 이 방법은 마이그레이션하거나 침입하는 셀을 분석하기 위해 고정, 염색 및 샘플 처리를 필요로 하지 않습니다. 이 방법 논문은 교모 세포종 암세포의 이동 및 침입의 실시간 측정을위한 상세한 절차를 강조한다.
Introduction
암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 암 유전자형 및 표현형을 결정하는 것은 효과적인 치료 전략을 이해하고 설계하는 데 매우 중요합니다. 암 연구의 수십 년은 암 유전자형 및 표현형을 결정하기 위하여 다른 방법의 발달 그리고 적응으로 이끌어 냈습니다. 최신 기술 개발 중 하나는 세포 임피던스에 기초한 세포 이동 및 침입의 실시간 측정입니다. 기질 및 세포 세포 접촉에 대한 세포 접착은 세포 간 통신 및 조절, 개발 및 조직의 유지 보수에 중요한 역할을 합니다. 세포 접착의 이상은 세포 접촉의 손실로 이끌어 내고, 세포외 매트릭스 (ECM)의 저하, 세포에 의한 철새 및 침입 능력의 이득, 모두는 다른 기관에 암세포의 전이에기여1,,2. 세포 이동(상처 치유 및 보이든 챔버 분석)과 침략(Matrigel-Boyden 챔버 분석)3,,4,,5를결정하는 다양한 방법이 사용 가능하다. 이러한 종래의 방법은 세포 표현형을 측정하기 위해 실험 전후에 형광 염료 또는 기타 염료로 표지되어야 하기 때문에 반정적이다. 또한, 기계적 중단은 상처 부위로세포의 이동을 측정하기 위한 상처를 만들기 위한 경우에 필요하다. 또한 이러한 기존 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 한 번에 결과를 측정합니다. 또한, 이러한 방법은 실험절차6 동안 일관되지 않은 취급으로 인해 부정확한 측정을 하는 경향이 있다.
기존의 방법과 달리 실시간 세포 분석 시스템은 세포의 사전 또는 포스트 염색 및 기계적 손상없이 실시간으로 세포 임피던스를 측정합니다. 더 중요한 것은 생물학적 효과가 시간에 따라 결정될 수 있도록 실험 기간을 연장할 수 있다는 것입니다. 실험을 실행하는 것은 시간 효율적이며 노동 집약적이지 않습니다. 데이터 분석은 비교적 간단하고 정확합니다. 다른 방법에 비해,이 방법은 세포 이동 및 침입을측정하는 가장 좋은 실시간 측정 중 하나입니다6,7,,8,,9.
Giaever 및 Keese는전극(10)의표면에 대한 세포 집단의 임피던스 기반 측정을 최초로 기술했다. 실시간 셀 분석 시스템은 동일한 원리로 작동합니다. 각 마이크로 플레이트의 면적은 약 80%가 금 마이크로 전극으로 덮여 있습니다. 전극 표면적이 셀의 준수 또는 확산으로 인해 셀에 의해 점유되면 전기 임피던스가 변경됩니다. 이러한 임피던스는 전극 표면적을 덮는 세포에 정비례하는 세포 지수로서 표시되며, 이는 미세다공성 멤브레인을 관통한 후(이 멤브레인의 중간 기공 크기는 8 μm)11.
Crk 및 CrkL은 SH2 및 SH3 도메인을 포함하는 어댑터 단백질이며 세포골격 조절, 세포 변형, 증식, 접착, 상피-중간엽 전이, 이동, 침략 및 전이와 같은 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 하며 많은 신호 경로에서 단백질-단백질 상호작용을 많이 중재함으로써,,14,1,,,12,,14, 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14, 14 , 14 , 14 , 14 ,14,1614 18. 따라서, 암세포의 Crk/CrkL 의존적 철새 및 침습적 능력을 결정하는 것이 중요하다. 실시간 세포 분석은 Crk 및 CrkL의 유전자 녹다운 시 교모세포종 세포의 철새 및 침습 능력을 결정하기 위해 수행되었다.
이 방법 논문은 Crk- 및 CrkL 매개 이동 및 인간 교모세포종 세포의 침입의 상세한 측정을 설명합니다.
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Protocol
참고: 모든 세포 배양 물질은 멸균되어야 하며 전체 실험은 멸균 조건하에서 생물 안전 성 캐비닛에서 수행되어야합니다.
1. U-118MG 교모세포종 세포선의 배양 및 전기화
- U-118MG 세포주를 5% 태아 소 혈청(FBS)에서 배양하여 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)(배양 배지)를 함유하고 5%CO2 인큐베이터(culture conditions)를 함유하는 습한 분위기에서 37°C에서 유지한다.
- 전기 천공에 70- 80% 컨립 건강 세포를 사용하십시오.
- 수확 세포를 위해, 1x PBS로 배양 접시에서 성장하는 세포를 세척하고 0.05 % 트립신-EDTA의 2 mL을 추가합니다. 인큐베이터에 30 s를 놓고 트립신-EDTA를 제거합니다. 배양 배지에서 세포를 15 mL 튜브로 수집하였다.
- 핸드헬드 자동 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산하고, 100 x g에서 원심 분리 세포를 5 분 동안 계산하고, 상급을 폐기한다.
- 배양 배지에서 세포 펠릿을 중단하고 각 조건에 대해 600,000개의 세포를 미세원원지 튜브로 취합니다. 실험 설계 및 성장 속도에 따라 세포 수를 조정합니다.
- 세포 현탁액을 미세 원심 분리튜브로 옮기고 덜베코의 인산 완충식식염수(DPBS)를 800 μL추가합니다. 30s의 미니 원심 분리기를 사용하여 스핀 다운하고 상급을 버립니다.
- 60 μL의 재서스펜션 버퍼 R을 세포 펠릿에 추가하고 siRNAs(즉, 비표적화 siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA, 또는 CrkL siRNA 둘 다)를 각각의 미세원심분리튜브에 6 μM의 농도로 첨가한다. 두드리면 부드럽게 섞으세요.
- 전기포레이트 10 μL의 전기포레이트 세포는 1,350V에서 3개의 펄스로 10ms에 대해 배양 배지의 5 mL로 전기포기 세포를 전달한다. 각 조건에 대해 제조된 나머지 세포에 대해 전기 를 반복합니다.
- 모든 전기 를 완료합니다. 조건당 2개의 35 mm 접시로 전기 포지셔닝 된 세포를 옮기고 3 일 동안 배양 조건하에서 배양하십시오.
- 셋째 날에, 실제 세포 임피던스 측정 전에 6시간 동안 DMEM(low serum 배지)을 함유하는 0.5% FBS로 모든 전기 포이터세포를 치료한다.
2. 실시간 세포 분석 시스템, 세포 침입 및 이동 (CIM) 플레이트 및 도금용 전기 기재 U-118MG 셀 의 준비
- 실험 개시 전 5-6시간 의 배양 조건 하에서CO2 인큐베이터에 실시간 세포 분석 시스템을 배치하여 배양 조건에 시스템을 안정화한다.
- 침략 분석의 경우, CIM 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에서 0.1 μg/μL에서 세포외 매트릭스(ECM) 겔을 함유하는 DMEM(일반 배지)의 플레이트 50 μL. 기포가 발생하지 않도록 하려면 역피펫팅 방법을 사용하십시오. 즉시 ECM 젤 30 μL을 제거하고 20 μL을 우물에 남깁니다.
- ECM 겔 코팅 후, 뚜껑을 닫고 4시간 동안 배양 조건 하에서 인큐베이터에 플레이트를 보관한다. ECM 겔 코팅 및 건조 동안, 판의 상부 챔버의 전극이 손, 생체 안전 성 캐비닛의 표면 또는CO2 인큐베이터와 직접 접촉하지 않도록 예방 조치를 취하십시오.
- 임피던스 측정 프로그램을 설정하려면 연결된 소프트웨어 아이콘(재료 표참조)을 두 번 클릭하여 시스템 소프트웨어 응용 프로그램(제어 장치)을 엽니다. 각 크래들은 실험 조건, 임피던스 측정 시간 간격 및 기간 및 데이터 분석을 설정하는 서로 다른 탭이 있는 개별 창이 있습니다.
- 레이아웃 탭에서 각 생물학적 조건에 대해 유정을 4배로 설정하고 일정 탭 아래에 2단계 셀 임피던스 측정값을 설정합니다. 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 1회 스윕)을 위한 것이고, 두 번째 단계는 실제 실험을 위해 각각의 개별 크래들에서 세포 임피던스를 측정하는 것이다. 마이그레이션의 경우 10분 간격으로 145개의 스윕을 사용하고, 침공의 경우 각 개별 크래들에서 10분 간격으로 577개의 스윕을 개별적으로 설정합니다.
- 세포 임피던스 측정이 시작되기 전에 1h, 플레이트의 하부 챔버의 우물에서 화학력으로 10% FBS로 DMEM의 160 μL을 추가한다. ECM 겔 코팅 웰또는 코팅되지 않은 웰을 포함하는 상부 챔버를 하부 챔버와 함께 조립하여 각각 침략 및 이동을 측정합니다.
- 상부 챔버의 우물을 낮은 혈청 배지 50 μL로 채우고 시스템의 요람에 넣습니다. 메시지 탭을 클릭하여 제어 부에서 모든 웰을 인식하는지 확인합니다. 메시지가 확인됨으로표시되면 크래들의 플레이트가 실험에 사용할 준비가 된 것입니다.
- 세포 배양 조건에 포장된 플레이트의 적응에 필수적인 실시간 세포 분석 시스템 크래들에서 측정하기 전에 1시간 동안 배양 조건 하에서 완전히 포장된 플레이트를 배양조건하에서 사전 인큐베이터에 서있다.
- 낮은 혈청 배지로 처리된 수확 세포의 경우, 1.3단계에서와 같이 세포를 트립시니화하고, 낮은 혈청 배지에서 수집하고, 1.4단계에서와 같이 세포를 카운트한다.
- 세기 후, 원심분리세포를 100 x g에서 5분 동안 폐기하고 상한자를 버린다.
- 이동 및 침입 세포에 대한 낮은 혈청 배지의 800 μL에서 800,000 개의 세포를 다시 중단시. 또한, 300,000 개의 세포를 배양 배지와 종자 에서 35 mm 접시에 재중단하여 서양 얼룩 분석을 통해 Crk 및 CrkL의 조절 된 녹다운을 확인합니다.
3. 기준선 판독, 셀 파종 및 세포 임피던스 측정 및 시각화
- 크래들 시작 버튼을 클릭하여 기준선 판독값을 측정합니다. 기준선은CO2 인큐베이터에서 배양 조건 하에서 실시간 세포 분석 시스템의 요람에서 1시간 동안 플레이트를 사전 인큐베이팅한 후, 상부 챔버내의 각각의 웰에 세포를 파종하기 전에 판독되어야 한다.
참고: 크래들 시작 버튼을 클릭하면 제어 장치가 실험 파일을 저장할지 여부를 묻습니다. 파일을 저장한 후 크래들 분석기는 프로그램에 설정된 대로 기준 셀 임피던스를 측정하고 크래들 시작 버튼을 다시 클릭하여 두 번째 단계에서 셀 임피던스를 측정할 때까지 일시 중지 모드로 들어갑니다. - 베이스라인 측정 후 요람에서 이동 및 침입을 위해 두 플레이트를 모두 꺼내 생체 안전 캐비닛에 보관하십시오.
- 종자 100 μL의 세포(100,000 세포)는 기포를 피하기 위해 역피펫팅에 의해 크래들의 제어부에 프로그래밍된 바와 같이 각각의 웰즈에 있는 CIM 플레이트의 상부 챔버내의 각 생물학적 상태에 대해 4배로 증가한다.
- 파종 후, 세포가 바닥까지 고르게 정착할 수 있도록 플레이트를 실온에서 30분 동안 생체 안전 성 캐비닛 아래에 보관하십시오. 플레이트를 각 크래들로 다시 전송하고 크래들 시작 버튼을 클릭하여 2.5의 두 번째 단계에서 프로그래밍된 대로 셀 임피던스 측정을 시작합니다.
- 마지막 스윕 이 끝나면 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.
- 데이터 분석 탭에서 실험 을 완료하는 동안 또는 완료 후 시간에 따라 셀 인덱스로 셀 임피던스의 변화를 시각화합니다. 각 쿼드런플리케이트 조건은 평균 및 표준 편차에 대한 옵션 상자를 클릭하여 개별적으로 또는 평균 및/또는 표준 편차로 시각화할 수 있습니다.
- 셀 인덱스 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내려면 빈 스프레드시트 파일을 열고 데이터 분석 창 중간에 커서를 배치하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다. 표시되는 대화 상자에서 데이터 복사 옵션을 목록 형식으로 복사하고데이터를 열린 스프레드시트에 붙여넣습니다.
- 원시 데이터의 시간을 조정하여 셀 임피던스 측정의 실제 시작 시간을 나타냅니다. 두 번째 단계 시작 시간은 0으로 설정됩니다.
참고: 제어 부는 정규화 유무에 관계없이 셀 인덱스를 가져오고 시간 의존적 방식으로 결과를 그래픽 프리젠테이션으로 시각화할 수 있는 옵션을 갖습니다. 이 예제에서는 처리 및 그래픽 프레젠테이션을 위해 정규화 없이 셀 인덱스 데이터를 내보내게 됩니다. - 각 크래들에서 릴리즈 버튼을 클릭하여 실험을 해제합니다.
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Representative Results
Crk 및 CrkL은 상이한 암 세포주13,,17에서세포 이동 및 침입에 중요하다고 제안되었다. Crk 및 CrkL 단백질은 구조적으로 그리고 기능적으로 서로 유사하고 필수적인 중첩함수16,,19,,20,,21을재생하지만, Crk 및 CrkL에 대한 많은 유전자 녹다운 연구는 Crk, CrkL 또는 둘 다에 특이적인지 명확하게 다루지 않았다. 따라서, 두 단백질 중 어느 것이 세포 이동 및 침입에 기여하는지는 불분명하다. 원리 증명 연구로, 우리는 Crk 또는 CrkL에 특정 siRNAs를 사용하고 U-118MG GBM 세포주의 이동 및 침략에 대한 그들의 효력을 공부했습니다. Crk의 녹다운은 CrkL 단백질 수준을 감소시키지 않고 각각 85%와 86%의 CrkII 및 CrkI 단백질 수준을 감소시켰습니다. CrkL의 녹다운은 CrkL 단백질 수준을 85% 감소시켰습니다(그림1). CrkL 넉다운도 CrkII와 CrkI 레벨을 약간 감소시켰습니다. Crk및 CrkL에 대한 siRNAs의 결합 사용은 CrkII, CrkI 및 CrkL 수준을 80% 이상 감소시냈습니다(그림1B). 한편, Crk 및 CrkL의 녹다운은 빈쿨린 및 α-tubulin 수준에 영향을 미치지않았다(도 1).
U-118MG 세포는 높은 혈청(10% FBS)으로 이동하여, 13시간에서 최대 이동 수준에 도달하였는데, 이는 실험내부대조군(도2A)으로작용하였다. Crk 녹다운으로, 세포 이동이 연기되고, 세포는 23 h까지 이동을 계속했습니다. U-118MG 세포는 Crk와 CrkL(그림 2A)의녹다운시 그들의 이동 능력을 잃었습니다, Crk와 CrkL이 암세포 이동에 있는 필수적인 중첩 역할을 한다는 것을 건의합니다. 그러나 고정된 시점에서 셀 마이그레이션을 검사하는 경우 이러한 결론은 명확히 드러나지 않습니다. 6 또는 13 h에서 세포 이동을 비교했을 때, Crk 및 CrkL 녹다운에 의한 억제는 명백하였다(도 2B,C). 대조적으로, Crk 녹다운은 18시간(그림2D)에서세포 이동에 대한 억제 효과가 없었고, 비교를 위해 선택된 시간에 따라 상반되는 결과를 초래한다. CrkL 녹다운과 Crk/CrkL 더블 넉다운의 억제 효과는 세 번의 시점에서 명확하게 볼 수 있었습니다. 이 결과는 세포 이동이 정확하게 유전 조작 또는 약에 의하여 효력을 분석하기 위하여 세포 이동의 전체 기간 에 걸쳐 평가되어야 한다는 것을 명확하게 보여줍니다.
U-118MG 세포는 높은 혈청을 침범하여 52시간에서 최대 침략 수준에 도달하였는데, 이는 실험내부대조군(도3A)으로작용하였다. Crk 의 넉다운으로 세포 침공이 지연되었지만 60시간에서 비슷한 최대 레벨에 도달했습니다. CrkL 녹다운으로, U-118MG 세포는 대조군 세포에 비해 지연및 감소된 침략을 보였다. Crk및 CrkL의 결합된 녹다운은 세포 침각을 더욱 억제하였다(도3A). 36시간에서 세포 침입을 비교한 결과, 대조군 세포가 활발하게 침략을 겪고 있을 때, Crk 및 CrkL의 개별 적인 녹다운에 의한 억제와 Crk/CrkL 이중 녹다운에 의한 상승억제를 명확하게 입증하였다(도3B). 그러나, 52 또는 60 h에서의 세포 침각의 비교는 Crk 녹다운에 의한 약간의 또는 전혀 억제 효과를 나타내었다(도3C,D). 이러한 결과는 세포 침입이 실험의 전체 기간 동안 분석되어야 한다는 제안을 명확하게 뒷받침한다.
이러한 결과는 Crk 및 CrkL이 세포 이동 및 침입을 모두 중재하고, 실시간 세포 분석 시스템이 세포 이동 및 침입의 상이한 역학을 이해하는 전통적인 방법에 비해 명확한 이점을 가지고 있음을 입증하고 세포 표현형에 대한 특정 효과는 시간에 따라 달라지는 방식으로 발생합니다.
그림 1: U-118MG 세포에서 CrkI, CrkII 및 CrkL의 siRNA 매개 녹다운. (a)U-118MG 세포가 비표적대조군 siRNA(NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, 또는 Crkl 및 CrkL siRNA 둘 다로 전기포질된 후 4일 후에 총 세포 용해액을 제조하였고, 단백질 수준은 앞서1에기재된 바와 같이 서양 블롯 분석에 의해 결정되었다. (b)각 대역의 신호 강도를 이미징 시스템을 사용하여 정량화하고 NT의 백분율로 계산하였다. 평균 ± SD 값은 그래프에 표시됩니다. 빈쿨린과 부통은 내부 통제 역할을 했습니다. 데이터의 통계 분석은 두 실험 그룹 간의 비교를 위해 짝이 없는 두 꼬리 학생의 t 검정을 사용하여 수행하였다. *p< 0.05 및 **p&0.01, NT에 비해.
도 2: U-118MG 세포 이동에 대한 Crk/CrkL 녹다운의 효과: (A)U-118MG 세포가 비표적화 대조군 siRNA(NT), Crk siRNA, Crk siRNA, 또는 Crk 및 CrkL siRNA 둘 다로 전기공에 박힌 후 3일 후, 세포를 수확하고 세포 이동을 실시간 분석 시스템을 사용하여 조사하였다. U-118MG 세포의 이동은 시간에 의존하는 방식으로 Crk 또는 CrkL의 단일 녹다운으로 억제되었다. Crk와 CrkL의 녹다운은 세포 마이그레이션을 완전히 차단했습니다. 6(B),13(C)및 18h(D)의 셀 인덱스 값은 서로 다른 시점(화살표)에서 셀 이동을 비교하기 위해 제시된다.D 13 시간에서 대조군 세포 (NT)는 최대 마이그레이션에 도달했습니다. 18 시간에서 제어 및 Crk 녹다운 세포는 유사한 수준의 세포 이동을 보였다. 데이터의 통계 분석은 두 실험 그룹 간의 비교를 위해 짝이 없는 두 꼬리 학생의 t 검정을 사용하여 수행하였다. **p < 0.01, NT에 비해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: U-118MG 세포 침공에 대한 Crk/CrkL 녹다운의 효과: (A)U-118MG 세포가 비표적화 대조군 siRNA(NT), Crk siRNA, Crk siRNA, 또는 Crk 및 CrkL siRNA 둘 다로 전기공에 박힌 후 3일 후, 세포를 수확하고 세포 침공을 실시간 분석 시스템을 사용하여 4일 동안 조사하였다. U-118MG 세포의 침입은 시간에 의존하는 방식으로 Crk 또는 CrkL의 단일 녹다운으로 억제되었다. U-118MG 세포주에서 Crk와 CrkL 모두의 녹다운은 NT. 세포 지수 값에 비해 최대 48시간까지 침략적 용량을 감소시켰으며,36(B),52(C), 및 60h(D)는 상이한 시점(arrows)에서 세포 침입을 비교하기 위해 제시된다.CD 52 시간에서, 대조군 세포 (NT)는 침략의 초기 피크에 도달했습니다. 60 시간에서, Crk 녹다운 세포는 침략의 초기 피크에 도달했다. 데이터의 통계 분석은 두 실험 그룹 간의 비교를 위해 짝이 없는 두 꼬리 학생의 t 검정을 사용하여 수행하였다. *p< 0.05 및 **p&0.01, NT에 비해.
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Discussion
실시간 셀 분석 시스템을 사용하여 세포 이동 및 침입의 실시간 측정은 단일 시점에서 데이터를 제공하는 기존의 방법에 비해 여러 가지 중요한 장점을 가진 간단하고 빠르며 지속적인 모니터링 프로세스입니다. 기존의 방법과 마찬가지로, 각 세포주들은 기질, 성장, 세포 간 접촉, 및 철새에 대한 접착측면에서 다를 수 있기 때문에 실시간 세포 분석 시스템을 위한 각 세포주마다 실험 조건을 최적화해야 하며, 침략적 능력. 이러한 차이로 인해, 각 세포주들은 상이한 세포 역학 및 세포 임피던스를 나타낼 수 있다. 임피던스는 우물에서 시드된 세포의 수, 세포 접착 시간, 세포가 이동또는 침입하기 시작하기 전의 지연 시간, CIM 플레이트에서의 ECM 겔 농도에 의해 크게 영향을 받습니다. 첫째, 실시간 세포 분석은 특정 기간에 걸쳐 실시간으로 결과를 제공하기 때문에 최적화를 쉽게 만들어, 연구원은 제어 세포가 활성 세포 이동 및 침입을 표시할 때 및 제어 할 때 시간을 식별 할 수 있습니다 세포는 이주와 침략의 최대 수준에 도달합니다. 둘째, 세포가 변형된 유전형 변화로부터 표현형을 채택할 필요가 있기 때문에 자궁외 유전자 과발현 또는 유전자 녹다운 연구는 추가적인 최적화가 필요할 수 있다. 또한, 효과적인 약물 농도 및 약물의 효능은 실시간 세포 분석 시스템을 사용하여 정상 또는 변형 된 유전 조건과 조합하여 결정될 수 있다.
상처 치유, 연한천, 보이든 챔버 이동, 또는 침략 과 같은 전통적인 방법은 Crk 또는 CrkL중 하나의 녹다운이 상이한 암 세포주에서 감소된 이동 및 침략으로 이어진다는 것을 결정하기 위해 사용되어 왔다13,,17. 본 연구에서, 우리는 U-118MG 세포주에서 Crk 및 CrkL의 단일 또는 이중 녹다운을 유도하고 세포 이동 및 침입을 조사하였다. 전체 실험에 걸쳐 세포 임피던스의 실시간 측정은 세포 이동 및 침입의 역학에 대한 심층적 인 정보를 제공, 우리가 억제의 두 가지 모드를 식별 할 수 있도록. 크락 넉다운은 이주와 침략을 지연시켰지만, CrkL 넉다운은 전체 기간 동안 이주와 침략을 억제했다. 더욱이, Crk와 CrkL 둘 다의 이중 녹다운은 세포 이동을 완전히 막고 실질적으로 세포 침략을 억제했습니다.
본 연구는 Crk와 CrkL의 단일 및 이중 녹다운을 유도하기 위한 체계적인 녹다운 접근법을 실험의 전체 기간 동안 세포 이동 및 침입에 대한 실시간 분석과 결합하는 개념 증명을 제공합니다. 암세포에서 Crk 및 CrkL 매개 기능의 포괄적 인 분석. 본 연구에 제시된 데이터는 이 방법이 Crk 및 CrkL에 대한 억제 효과에 대한 후보 약물을 테스트하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. 실시간, 심층적이고 포괄적인 분석이 가능합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 실시간 세포 분석 시스템 데이터에 대한 그녀의 기술 지원에 대한 올리비아 펑크 에게 감사드립니다. 우리는 또한이 원고를 편집 어린이 자비 캔자스 시티의 의료 쓰기 센터에 감사드립니다. 이 작품은 소아암 연구를위한 톰 Keaveny 부여 기금에 의해 지원되었다 (TP에) 어린이 자비 병원 중서부 암 얼라이언스 파트너 자문 위원회 자금 (TP에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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