Summary
Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare la capacità delle cellule tumorali di migrare e invadere in varie condizioni di trattamento è fondamentale per valutare le strategie terapeutiche. Questo protocollo presenta un metodo per valutare le capacità metastatiche in tempo reale di una linea cellulare del cancro del glioblastoma.
Abstract
Il cancro nasce a causa della proliferazione incontrollata delle cellule iniziata dall'instabilità genetica, mutazioni e fattori ambientali e di altro tipo. Queste hanno acquisito anomalie in complesse reti di segnalazione molecolare a più livelli che inducono la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule aberranti, la degradazione della matrice extracellulare e la metastasi a organi distanti. Si stima che circa il 90% dei decessi correlati al cancro sia causato dagli effetti diretti o indiretti della diffusione metastatica. Pertanto, è importante stabilire un sistema altamente affidabile e completo per caratterizzare i comportamenti delle cellule tumorali sulle manipolazioni genetiche e ambientali. Tale sistema può dare una chiara comprensione della regolazione molecolare della metastasi del cancro e l'opportunità di sviluppare con successo strategie terapeutiche stratificate e precise. Pertanto, una determinazione accurata dei comportamenti delle cellule tumorali come la migrazione e l'invasione con guadagno o perdita di funzione dei geni consente di valutare la natura aggressiva delle cellule tumorali. Il sistema di misurazione in tempo reale basato sull'impedimento cellulare consente ai ricercatori di acquisire continuamente dati durante un intero esperimento e di confrontare e quantificare istantaneamente i risultati in varie condizioni sperimentali. A differenza dei metodi convenzionali, questo metodo non richiede fissazione, colorazione ed elaborazione del campione per analizzare le celle che migrano o invadono. Questo documento sul metodo enfatizza le procedure dettagliate per la determinazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del glioblastoma.
Introduction
Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare i genotipi e i fenotipi del cancro è fondamentale per comprendere e progettare strategie terapeutiche efficaci. Decenni di ricerca sul cancro hanno portato allo sviluppo e all'adattamento di diversi metodi per determinare i genotipi e i fenotipi del cancro. Uno degli ultimi sviluppi tecnici è la misurazione in tempo reale della migrazione cellulare e dell'invasione basata sull'impedimento cellulare. L'adesione cellulare ai substrati e ai contatti cellulare svolge un ruolo importante nella comunicazione e nella regolazione cellulare-cellulare, nello sviluppo e nella manutenzione dei tessuti. Le anomalie nell'adesione cellulare portano alla perdita del contatto cellulare, alla degradazione della matrice extracellulare (ECM), e al guadagno di capacità migratorie e invasive da parte delle cellule, che contribuiscono alla metastasi delle cellule tumorali a diversi organi1,2. Sono disponibili vari metodi per determinare la migrazione cellulare (guarigione delle ferite e saggi della camera di Boyden) e l'invasione (saggio della camera Matrigel-Boyden)3,4,5.5 Questi metodi convenzionali sono semiquantitativi perché le cellule devono essere etichettate con un colorante fluorescente o altri coloranti prima o dopo l'esperimento per misurare i fenotipi cellulari. Inoltre, sono necessari disturbi meccanici in alcuni casi per la creazione di una ferita per misurare la migrazione delle cellule al sito della ferita. Inoltre, questi metodi esistenti richiedono molto tempo, richiedono molto lavoro e misurano i risultati in un solo momento. Inoltre, questi metodi sono inclini a effettuare misurazioni imprecise a causa di una manipolazione incoerente durante la procedura sperimentale6.
A differenza dei metodi convenzionali, il sistema di analisi cellulare in tempo reale misura l'impedimento cellulare in tempo reale senza richiedere danni pre o post-staining e meccanici delle cellule. Ancora più importante, la durata di un esperimento può essere estesa in modo che gli effetti biologici possano essere determinati in modo dipendente dal tempo. L'esecuzione dell'esperimento è efficiente in termini di tempo e non richiede molto lavoro. L'analisi dei dati è relativamente semplice e accurata. Rispetto ad altri metodi, questo metodo è una delle migliori misurazioni in tempo reale per misurare la migrazione cellulare e l'invasione6,7,8,9.
Giaever e Keese sono stati i primi a descrivere la misurazione basata sull'impedanza di una popolazione cellulare sulla superficie degli elettrodi10. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale funziona sullo stesso principio. L'area di ogni pozzo di micropiastra è circa l'80% coperto da una serie di microelettrodi d'oro. Quando la superficie dell'elettrodo è occupata dalle cellule a causa dell'aderenza o della diffusione delle cellule, l'impedimento elettrico cambia. Questo impedimento viene visualizzato come indice cellulare, che è direttamente proporzionale alle cellule che coprono la superficie dell'elettrodo dopo che penetrano la membrana microporosa (la dimensione mediana dei pori di questa membrana è di 8 m)11.
Crk e CrkL sono proteine adattatori e contenenti domini SH2 e SH3 e svolgono ruoli importanti in varie funzioni cellulari, come la regolazione del citoscheletro, la trasformazione cellulare, la proliferazione, l'adesione, la transizione epiteliale-mesenchy, la migrazione, l'invasione e la metastasi mediando le interazioni proteina-proteina in molte vie di segnalazione1,12,13,14,15,16,1717. 18. Pertanto, è importante determinare le capacità migratorie e invasive dipendenti da Crk/CrkL delle cellule tumorali. L'analisi cellulare in tempo reale è stata eseguita per determinare le capacità migratorie e invasive delle cellule glioblastoma al knockdown genico di Crk e CrkL.
Questo documento di metodo descrive misurazioni dettagliate della migrazione mediata da Crk- e CrkL e l'invasione delle cellule glioblastoma umane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tutti i materiali di coltura cellulare devono essere sterili e l'intero esperimento deve essere eseguito in un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.
1. Cultura ed elettroporazione della linea cellulare Glioblastoma U-118MG
- Cultura la linea cellulare U-118MG nel siero bovino fetale 5% (FBS) contenente Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (mezzo di coltura) e Mantenere a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umida contenente il 5% di incubatore di CO2 (condizioni di coltura).
- Utilizzare 70– 80% cellule sane confluenti per l'elettroporazione.
- Per le cellule di raccolta, lavare le cellule che crescono in piatti di coltura con 1x PBS e aggiungere 2 mL di 0.05% trypsin-EDTA. Mettere nell'incubatrice per 30 s e rimuovere la trypsin-EDTA. Raccogliere le cellule nel mezzo di coltura in un tubo da 15 mL.
- Contare le cellule usando un contatore cellulare automatizzato portatile, centrifugare le cellule a 100 x g per 5 min, e scartare il supernatale.
- Sospendere il pellet cellulare nel mezzo di coltura e prendere 600.000 cellule per ogni condizione in un tubo di microcentrismo. Regolare il numero di cella in base ai progetti sperimentali e ai tassi di crescita.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrismo e aggiungere 800 l of Dulbecco's fosfated-buffered salina (DPBS). Girare verso il basso con una minicentrifuga per 30 s e scartare il supernatante.
- Aggiungere al pellet cellulare 60 ll di buffer di sospensione e aggiungere i siRNA (ad esempio siRNA non targeting, siRNA Crk, siRNA CrkL o entrambi siRNA Crk e CrkL) ad una concentrazione di 6 m al rispettivo tubo di microfusione. Mescolare delicatamente toccando.
- Elettroporate 10 -L di cellule con un sistema di elettroporazione a 1.350 V per 10 ms con tre impulsi e trasferire le cellule elettropolrate in 5 mL del mezzo di coltura. Ripetere l'elettroporazione per il resto delle cellule preparate per ogni condizione.
- Completare tutta l'elettroporazione. Trasferire le cellule elettroporate in due piatti da 35 mm per condizione e colture in condizioni di coltura per 3 giorni.
- Il terzo giorno, trattare tutte le cellule elettroporate in 0,5% FBS contenenti DMEM (medio siero basso) per 6 h prima della misurazione effettiva dell'impendenza cellulare.
2. Preparazione del sistema di analisi cellulare in tempo reale, delle piastre CIM (Cell Invasion and Migration) e delle celle U-118MG elettroporate per la placcatura
- Collocare il sistema di analisi cellulare in tempo reale in un incubatore di CO2 in condizioni di coltura 5–6 h prima dell'inizio dell'esperimento per stabilizzare il sistema alle condizioni di coltura.
- Per il test di invasione, piatto 50 -L di DMEM (mezzo semplice) contenente gel a matrice extracellulare (ECM) a 0,1 g/l in ogni pozzetto della camera superiore della piastra CIM. Per evitare di avere bolle d'aria, utilizzare il metodo di pipettatura inversa. Rimuovere immediatamente 30 l di gel ECM, lasciando 20 .L nel pozzo.
- Dopo il rivestimento in gel ECM, tenere la piastra nell'incubatrice in condizioni di coltura per 4 ore con il coperchio. Durante il rivestimento e l'essiccazione in gel ECM, adottare misure preventive per evitare il contatto diretto degli elettrodi della camera superiore delle piastre con le mani, le superfici dell'armadio di biosicurezza o l'incubatrice di CO2.
- Per impostare il programma di misurazione dell'imputazione, fare doppio clic sull'icona del software associato (vedere Tabella dei materiali) per aprire l'applicazione software di sistema (unità di controllo). Ogni culla ha una singola finestra con schede diverse per impostare le condizioni sperimentali, l'impedimento dell'intervallo di tempo di misurazione e della durata e l'analisi dei dati.
- Nella scheda Layout, impostare i pozze di quadruplicazione per ogni condizione biologica e impostare le misurazioni di impedimento delle celle in due fasi nella scheda Pianificazione. Il primo passo è per una misurazione una tantando della linea di base (uno sweep con un intervallo di 1 min), e il secondo passo è quello di misurare l'impedimento cellulare nelle rispettive culle individuali per un esperimento vero e proprio. Per la migrazione, utilizzare 145 sweep con un intervallo di 10 min, e per l'invasione, 577 spazza con un intervallo di 10 min, impostato singolarmente) nelle rispettive culle individuali.
- Una h prima dell'inizio della misurazione dell'impedibile cellulare, aggiungere 160 L di DMEM con 10% FBS come chemioattraente nei pozzi della camera inferiore della piastra. Assemblare la camera superiore contenente i pozzi rivestiti in gel ECM o i pozzi non rivestiti con la camera inferiore per misurare rispettivamente l'invasione e la migrazione.
- Riempire i pozze nella camera superiore con 50 gradi l di medio siero basso e metterli nella culla del sistema. Verificare se tutti i pozzi vengono riconosciuti dall'unità di controllo facendo clic sulla scheda Messaggio. Se il messaggio viene visualizzato come OK, la targa nella culla è pronta per l'esperimento.
- Preincubare le piastre completamente imballate nell'incubatrice in condizioni di coltura per 1 h prima delle misurazioni nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale, che è essenziale per l'acclimatamento di una piastra imballata alle condizioni di coltura cellulare.
- Per le cellule di raccolta trattate con un mezzo di siero basso, provare le cellule come al punto 1.3, raccoglierle in un mezzo di siero basso e contare le cellule come nel punto 1.4.
- Dopo il conteggio, centrifugare le cellule a 100 x g per 5 min e scartare il super-natante.
- Risolvi 800.000 cellule in 800 - L di medio siero basso per i saggi di migrazione e invasione. Inoltre, risospendere 300.000 cellule in 2 mL di mezzo di coltura e semi in una parabola da 35 mm per l'analisi delle macchie occidentali per confermare l'abbattimento regolamentato di Crk e CrkL.
3. Lettura di base, semina delle cellule e misurazione e visualizzazione dell'impotenza cellulare
- Misurare la lettura della linea di base facendo clic sul pulsante Start della culla. La linea di base deve essere letta dopo aver preincubato le piastre per 1 h nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale in condizioni di coltura nell'incubatrice di CO2 e prima di semine delle cellule ai rispettivi pozzi nella camera superiore.
NOT: Una volta fatto clic sul pulsante Start della culla, l'unità di controllo chiederà se salvare il file sperimentale. Dopo aver salvato il file, l'analizzatore culla misura l'impedibile della cella di base come impostato nel programma inizialmente ed entra in modalità pausa fino a quando non viene fatto di nuovo clic sul pulsante Start della culla per misurare l'impedito cellulare nel secondo passaggio. - Estrarre entrambe le piastre per la migrazione e l'invasione dalle culle dopo la misurazione di base e tenerle nell'armadietto della biosicurezza.
- Seme 100 L di cellule (100,000 cellule) in quadruplicati per ogni condizione biologica nella camera superiore della piastra CIM nei rispettivi pozzi, come programmato nell'unità di controllo della culla invertendo pipetting per evitare bolle d'aria.
- Dopo la semina, tenere la piastra sotto un armadietto di biosicurezza per 30 min a temperatura ambiente per consentire alle cellule di stabilirsi uniformemente sul fondo. Trasferire la piastra sulla rispettiva culla e fare clic sul pulsante di avvio della culla per iniziare a misurare l'impedimento cellulare come programmato nel secondo passaggio di 2.5.
- Al termine dell'ultima sweep, l'esperimento viene completato e i risultati vengono salvati automaticamente.
- Nella scheda Analisi dati, visualizzate le modifiche nell'impedimento delle celle come indice delle celle in modo dipendente dal tempo durante o dopo il completamento dell'esperimento. Ognuna delle rispettive condizioni dei quadruplicati può essere visualizzata singolarmente o come medie e/o deviazioni standard facendo clic sulle caselle Opzione per la media e la deviazione standard.
- Per esportare i dati dell'indice di cella in un file di foglio di calcolo, aprire un file di foglio di calcolo vuoto, posizionare il cursore al centro della finestra Analisi dati e fare clic con il pulsante destro del mouse. Nella finestra di dialogo visualizzata scegliere l'opzione Copia dati in Formato elencoe incollare i dati nel foglio di calcolo aperto.
- Regolare l'ora nei dati grezzi per rappresentare l'ora di inizio effettiva della misurazione dell'impendenza della cella. L'ora di inizio del secondo passaggio è impostata su zero.
NOT: L'unità di controllo ha la possibilità di ottenere l'indice della cella con o senza normalizzazione (cioè indice di cella normalizzato) e visualizzare i risultati come presentazione grafica in modo dipendente dal tempo. In questo esempio, i dati dell'indice di cella vengono esportati senza normalizzazione per l'elaborazione e la presentazione grafica. - Rilasciare l'esperimento facendo clic sul pulsante Rilascia in ogni culla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
È stato suggerito che Crk e CrkL sono importanti per la migrazione cellulare e l'invasione in diverse linee cellulari tumorali13,17. Anche se le proteine Crk e CrkL sono strutturalmente e funzionalmente simili tra loro e svolgono funzioni sovrapposte essenziali16,19,20,21, molti studi di abbattimento genico per Crk e CrkL non hanno chiaramente affrontato se il knockdown è specifico di Crk, CrkL, o entrambi.21 Pertanto, non è chiaro quale delle due proteine contribuisca alla migrazione e all'invasione delle cellule. Come studio proof-of-principle, abbiamo usato siRNA specifici per Crk o CrkL e studiato i loro effetti sulla migrazione e l'invasione della linea cellulare U-118MG GBM. L'abbattimento della Crk ha diminuito i livelli di proteine CrkII e CrkI rispettivamente dell'85% e dell'86%, senza ridurre il livello delle proteine CrkL. Il knockdown di CrkL ha ridotto il livello delle proteine CrkL dell'85%(Figura 1). CrkL ha leggermente ridotto i livelli di CrkII e CrkI, troppo. L'uso combinato di siRNA per Crk e CrkL ha ridotto i livelli di CrkII, CrkI e CrkL di oltre l'80% (Figura 1B). D'altra parte, l'abbattimento di Crk e CrkL non ha influenzato i livelli di vinculin e di z-tubulina (Figura 1).
Le cellule U-118MG migrarono ad alto siero (10% FBS), raggiungendo il livello massimo di migrazione a 13 h, che serviva come controllo interno dell'esperimento (Figura 2A). Con il knockdown di Crk, la migrazione cellulare fu ritardata e le cellule continuarono a migrare fino a 23 h. CrkL knockdown inibire sostanzialmente la migrazione cellulare. Le cellule U-118MG hanno perso la loro capacità migratoria al momento dell'abbattimento di Crk e CrkL (Figura 2A), suggerendo che Crk e CrkL svolgono ruoli essenziali sovrapposti nella migrazione delle cellule tumorali. Tuttavia, questa conclusione non è chiaramente evidente se la migrazione cellulare viene esaminata in un momento fisso. Quando sono state confrontate le migrazioni di cellule a 6 o 13 h, le inibizioni dei knockdown Crk e CrkL erano ovvie (Figura 2B,C). Al contrario, il knockdown di Crk non ha avuto un effetto inibitorio sulla migrazione cellulare a 18 h (Figura 2D), portando a risultati contrastanti a seconda del momento selezionato per il confronto. Gli effetti inibitori del knockdown CrkL e del doppio knockdown Crk/CrkL erano chiaramente visibili in tutti e tre i punti temporali. Questi risultati dimostrano chiaramente che la migrazione cellulare deve essere valutata per l'intero periodo di migrazione cellulare per analizzare con precisione gli effetti delle manipolazioni genetiche o dei farmaci.
Le cellule U-118MG invasero siero alto, raggiungendo il massimo livello di invasione a 52 h, che serviva come controllo interno dell'esperimento (Figura 3A). Con il knockdown di Crk, l'invasione delle cellule fu ritardata, ma raggiunse un livello massimo simile a 60 h. Con il knockdown CrkL, le cellule U-118MG mostrarono un'invasione ritardata e ridotta rispetto alle celle di controllo. L'abbattizione combinata di Crk e CrkL ha ulteriormente inibito l'invasione cellulare (Figura 3A). Confronto dell'invasione cellulare a 36 h, quando le cellule di controllo erano attivamente in fase di invasione, ha chiaramente dimostrato l'inibizione per knockdown individuale di Crk e CrkL e un'inibizione sinergica da Crk / CrkL doppio knockdown (Figura 3B). Tuttavia, un confronto di invasione cellulare a 52 o 60 h ha mostrato un leggero o nessun effetto inibitorio da Crk knockdown (Figura 3C,D). Questi risultati supportano chiaramente il suggerimento che l'invasione cellulare dovrebbe essere analizzata per l'intero periodo dell'esperimento.
Questi risultati dimostrano che sia Crk che CrkL mediano la migrazione e l'invasione delle cellule, e che il sistema di analisi cellulare in tempo reale ha un chiaro vantaggio rispetto ai metodi tradizionali nella comprensione delle diverse cinedi della migrazione e dell'invasione delle cellule e effetti specifici sui fenotipi cellulari in modo dipendente dal tempo.
Figura 1: knockdown mediato da siRNA di CrkI, CrkII e CrkL nelle cellule U-118MG. (A) Le listi celle totali sono state preparate 4 giorni dopo l'elettroporate delle cellule U-118MG con siRNA (NT), Crk siRNA, siRNA CrkL o siRNA CrkL e CrkL, e i livelli di proteine sono stati determinati dalle analisi occidentali delle macchie come descritto in precedenza1. (B) L'intensità del segnale delle rispettive bande è stata quantificata utilizzando il sistema di imaging e calcolata come percentuali di NT. I relativi valori medi: SD sono mostrati nel grafico. Vinculin e a-tubulina servirono come controlli interni. Le analisi statistiche dei dati sono state eseguite utilizzando il test t di Student a due code non accoppiato per il confronto tra i due gruppi sperimentali. e p , rispetto a NT.
Figura 2: Gli effetti del knockdown Crk/CrkL sulla migrazione delle cellule U-118MG: (A) Tre giorni dopo che le cellule U-118MG sono state elettroporate con siRNA di controllo non targeting (NT), siRNA di Crk, siRNA CrkL o siRNA CrkL e CrkL, le cellule sono state raccolte e la migrazione delle cellule è stata esaminata utilizzando il sistema di analisi in tempo reale. La migrazione delle cellule U-118MG è stata inibita con un singolo knockdown di Crk o CrkL in modo dipendente dal tempo. Il knockdown di Crk e CrkL ha completamente bloccato la migrazione delle cellule. I valori di indice delle celle in corrispondenza di 6 (B), 13 (C) e 18 h (D) vengono presentati per confrontare la migrazione delle celle in punti temporali (frecce) diversi. A 13 h le celle di controllo (NT) hanno raggiunto la migrazione massima. A 18 h sia il controllo che le cellule knockdown Crk hanno mostrato livelli simili di migrazione cellulare. Le analisi statistiche dei dati sono state eseguite utilizzando il test t di Student a due code non accoppiato per il confronto tra i due gruppi sperimentali. < 0,01, rispetto a NT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: Effetti del knockdown Crk/CrkL sull'invasione delle cellule U-118MG: (A) Tre giorni dopo che le cellule U-118MG sono state elettroporate con siRNA di controllo non targeting (NT), siRNA di Crk, siRNA CrkL, o entrambi siRNA Crk e CrkL, le cellule sono state raccolte e l'invasione cellulare è stata esaminata per 4 giorni utilizzando il sistema di analisi in tempo reale. L'invasione delle cellule U-118MG è stata inibita con un singolo knockdown di Crk o CrkL in modo dipendente dal tempo. Il knockdown di Crk e CrkL nella linea cellulare U-118MG ha ridotto la sua capacità invasiva fino a 48 h rispetto ai valori dell'indice delle celle NT a 36 (B), 52 (C) e 60 h (D) sono presentati per confrontare l'invasione cellulare in diversi punti temporali (frecce). A 52 h, le celle di controllo (NT) raggiunsero il picco iniziale di invasione. A 60 h, le cellule abbattute di Crk raggiunsero il picco iniziale di invasione. Le analisi statistiche dei dati sono state eseguite utilizzando il test t di Student a due code non accoppiato per il confronto tra i due gruppi sperimentali. e p , rispetto a NT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La misurazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale è un processo di monitoraggio semplice, rapido e continuo con molteplici e significativi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali che forniscono dati in un singolo momento. Come per i metodi tradizionali, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate per ogni linea cellulare per il sistema di analisi cellulare in tempo reale, perché ogni linea cellulare può essere diversa in termini di adesione al substrato, crescita, contatti da cellula a cella e capacità invasive. A causa di queste differenze, ogni linea cellulare può mostrare diverse cinetica cellulare e impedimenti cellulari. L'impedimento è fortemente influenzato dal numero di cellule semiate in un pozzo, il tempo per l'adesione cellulare, il tempo di ritardo prima che le cellule inizino a migrare o invadere, e la concentrazione di gel ECM su piastre CIM. In primo luogo, l'analisi delle celle in tempo reale rende l'ottimizzazione più facile perché fornisce risultati in tempo reale in un periodo di tempo specifico, consentendo ai ricercatori di identificare il punto di tempo in cui le celle di controllo mostrano la migrazione e l'invasione delle cellule attive e quando il controllo le cellule raggiungono i livelli massimi di migrazione e invasione. In secondo luogo, la sovraespressione genica ectopica o gli studi di abbattimento genico potrebbero aver bisogno di ulteriori ottimizzazioni, perché le cellule devono adottare i fenotipi dai cambiamenti genotici modificati. Inoltre, concentrazioni efficaci di farmaci e l'efficacia dei farmaci possono essere determinati in combinazione con condizioni genetiche normali o modificate utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale.
Metodi tradizionali come la guarigione delle ferite, l'agar morbido, la migrazione della camera di Boyden o i saggi di invasione sono stati utilizzati per determinare che il knockdown di Crk o CrkL porta a una migrazione e un'invasione ridotte in diverse linee cellulari tumorali13,17. In questo studio, abbiamo indotto un singolo o un doppio knockdown di Crk e CrkL nella linea cellulare U-118MG e abbiamo studiato la migrazione e l'invasione delle cellule. La misurazione in tempo reale degli impedimenti cellulari sull'intero esperimento ha fornito informazioni approfondite sulla cinetica della migrazione e dell'invasione cellulare, permettendoci di identificare due diversi modi di inibizione. Mentre Crk knockdown ritardato la migrazione e l'invasione, CrkL knockdown inibito la migrazione e l'invasione per tutto il periodo di tempo. Inoltre, il doppio knockdown di Crk e CrkL bloccò completamente la migrazione cellulare e inibiva sostanzialmente l'invasione cellulare.
Questo studio fornisce un proof-of-concept che combinando l'approccio sistematico knockdown per indurre il singolo e doppio knockdown di Crk e CrkL con analisi in tempo reale della migrazione cellulare e dell'invasione per l'intero periodo degli esperimenti è necessario per analisi complete delle funzioni mediate da Crk- e CrkL nelle cellule tumorali. I dati presentati in questo studio suggeriscono che questo metodo può essere utilizzato anche per testare i farmaci candidati per i loro effetti inibitori su Crk e CrkL. Nel complesso, il sistema di analisi cellulare in tempo reale è utile nella creazione di esperimenti per la migrazione cellulare o l'invasione cellulare e fa analisi possibili in tempo reale, approfondite e complete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Olivia Funk per la sua assistenza tecnica con i dati del sistema di analisi cellulare in tempo reale. Ringraziamo anche il Medical Writing Center di Children's Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) e dal finanziamento del Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (a TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
