Summary
Kræft er en dødelig sygdom på grund af dens evne til at metastasere til forskellige organer. Bestemmelse af kræftcellers evne til at migrere og invadere under forskellige behandlingsbetingelser er afgørende for at vurdere terapeutiske strategier. Denne protokol præsenterer en metode til at vurdere real-time metastatiske evner af en glioblastomkræft cellelinje.
Abstract
Kræft opstår på grund af ukontrolleret spredning af celler initieret af genetisk ustabilitet, mutationer, og miljømæssige og andre stressfaktorer. Disse erhvervede abnormiteter i komplekse, flerlagede molekylære signalnetværk fremkalde afvigende celleproliferation og overlevelse, ekstracellulær matrix nedbrydning, og metastase til fjerne organer. Ca. 90 % af de kræftrelaterede dødsfald skønnes at være forårsaget af de direkte eller indirekte virkninger af metastatisk formidling. Derfor er det vigtigt at etablere en meget pålidelig, omfattende system til at karakterisere kræft celle adfærd på genetiske og miljømæssige manipulationer. Et sådant system kan give en klar forståelse af den molekylære regulering af kræftmetastase og mulighed for en vellykket udvikling af lagdelte, præcise terapeutiske strategier. Derfor, nøjagtig bestemmelse af kræft celle adfærd såsom migration og invasion med gevinst eller tab af funktion af gen (r) giver mulighed for vurdering af den aggressive karakter af kræftceller. Realtidsmålesystemet baseret på celleimpedans gør det muligt for forskere løbende at hente data under et helt eksperiment og straks sammenligne og kvantificere resultaterne under forskellige eksperimentelle forhold. I modsætning til konventionelle metoder kræver denne metode ikke fiksering, farvning og prøvebehandling for at analysere celler, der migrerer eller invaderer. Denne metode papir understreger detaljerede procedurer for real-time bestemmelse af migration og invasion af glioblastoma kræftceller.
Introduction
Kræft er en dødelig sygdom på grund af dens evne til at metastasere til forskellige organer. Bestemmelse af kræft genotyper og fænotyper er afgørende for at forstå og designe effektive terapeutiske strategier. Årtiers kræftforskning har ført til udvikling og tilpasning af forskellige metoder til at bestemme kræft genotyper og fænotyper. En af de seneste tekniske udviklinger er real-time måling af celle migration og invasion baseret på celle impedans. Cellevedhæftning til substrater og cellecellekontakter spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation og regulering, udvikling og vedligeholdelse af væv. Abnormiteter i cellevedhæftning fører til tab af cellecellekontakt, nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) og gevinst af cellers vandrende og invaderende evner, som alle bidrager til metastase af kræftceller til forskellige organer1,2. Forskellige metoder er til rådighed til at bestemme cellemigration (sårheling og Boyden kammer analyser) og invasion (Matrigel-Boyden kammer assay)3,4,5. Disse konventionelle metoder er semikvantitative, fordi celler skal mærkes med et fluorescerende farvestof eller andre farvestoffer enten før eller efter forsøget for at måle cellefænotyper. Derudover er der i nogle tilfælde behov for mekaniske forstyrrelser for at skabe et sår til måling af cellernes migration til sårstedet. Desuden er disse eksisterende metoder tidskrævende, arbejdskrævende, og måle resultaterne på kun ét tidspunkt. Desuden er disse metoder tilbøjelige til at foretage unøjagtige målinger på grund af inkonsekvent håndtering under forsøgsproceduren6.
I modsætning til konventionelle metoder måler realtidscelleanalysesystemet celleimpedans i realtid uden at kræve præ- eller poststaining og mekanisk skade af celler. Endnu vigtigere er det, at et eksperiments varighed kan forlænges, så biologiske virkninger kan bestemmes på en tidsafhængig måde. Udførelse af eksperimentet er tidseffektivt og ikke arbejdskrævende. Det er relativt enkelt og præcist at analysere data. Sammenlignet med andre metoder er denne metode en af de bedste målinger i realtid til måling af cellemigration og invasion6,7,8,9.
Giaever og Keese var de første til at beskrive impedansbaseret måling af en cellepopulation på overfladen af elektroderne 10. Realtidscelleanalysesystemet fungerer efter samme princip. Arealet af hver mikroplade brønd er ca. 80% dækket med en række guld mikroelektroder. Når elektrodens overfladeareal er besat af celler på grund af vedhæftning eller spredning af cellerne, ændres den elektriske impedans. Denne impedans vises som celleindekset, som er direkte proportional med de celler, der dækker elektrodeoverfladeområdet, efter at de trænger ind i mikroporøs membranen (medianporestørrelsen af denne membran er 8 μm)11.
Crk og CrkL er adaptor proteiner, der indeholder SH2 og SH3 domæner og spiller vigtige roller i forskellige cellulære funktioner, såsom cytoskeleton regulering, celle transformation, spredning, vedhæftning, epitel-mesenkymale overgang, migration, invasion, og metastase ved at mægle protein-protein interaktioner i mange signalveje1,12,13, 14,,1515,16,1713, kr. Derfor er det vigtigt at bestemme crk/crkl-afhængige vandrende og invasive kapaciteter af kræftceller. Realtidscelleanalyse blev udført for at bestemme glioblastomcellers vandrende og invasive evner ved genknockdown af Crk og CrkL.
Denne metode papir beskriver detaljerede målinger af Crk- og CrkL-medieret migration og invasion af menneskelige glioblastomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle cellekulturmaterialer skal være sterile, og hele forsøget skal udføres i et biosikkerhedsskab under sterile forhold.
1. Kultur og elektroporation af U-118MG Glioblastoma Cell Line
- Kultur U-118MG cellelinje i 5% føtal kvæg serum (FBS), der indeholder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (kultur medium) og vedligeholde ved 37 °C i en fugtig atmosfære, der indeholder 5% CO2 inkubator (dyrkning betingelser).
- Brug 70- 80% confluent raske celler til elektroporation.
- Til høst af celler vaskes cellerne, der vokser i dyrkningsretter med 1x PBS, og der tilsættes 2 ml 0,05% trypsin-EDTA. Placer i kuvøsen i 30 s og fjern trypsin-EDTA. Saml celler i kulturmediet i et 15 ml rør.
- Tæl cellerne ved hjælp af en håndholdt automatiseret celletæller, centrifuger celler ved 100 x g i 5 min. og kassér supernatanten.
- Cellen stilres i dyrkningsmediet, og tag 600.000 celler for hver betingelse i et mikrocentrifugerør. Juster celletallet afhængigt af eksperimentelle design og vækstrater.
- Cellesuspensionen overføres til et mikrocentrifugerør, og der tilsættes 800 μL af Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS). Spin ned ved hjælp af en minicentrifuge i 30 s og kassér supernatanten.
- Der tilsættes 60 μL resuspensionsbuffer R til cellepelletsen, og siRNA'erne (dvs. ikke-målbaserede siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA eller både Crk og CrkL siRNAs) tilsættes med en koncentration på 6 μM til det pågældende mikrocentrifugerør. Bland dem forsigtigt ved at trykke.
- Elektroporate 10 μL celler med et elektroporationssystem ved 1.350 V i 10 ms med tre impulser og overføre elektroporated cellerne til 5 ml af dyrkningsmediet. Gentag elektroporationen for resten af cellerne forberedt til hver tilstand.
- Komplet alle respektive elektroporation. Elektropolerede celler overføres til to 35 mm retter pr. tilstand, og kulturbedem dyrkes under dyrkningsforhold i 3 dage.
- På den tredje dag behandles alle elektroporatede celler i 0,5% FBS, der indeholder DMEM (lavt serummedium) i 6 timer før den faktiske celleimpedansmåling.
2. Forberedelse af Real-time Cell Analysis System, Cell Invasion og Migration (CIM) Plader, og elektropoleret U-118MG Celler til plating
- Anbring realtidscelleanalysesystemet i2 en CO 2-inkubator under dyrkningsbetingelser 5-6 timer før forsøgets start for at stabilisere systemet til dyrkningsforholdene.
- Til invasionsanalysen skal der være 50 μL DMEM (almindeligt medium), der indeholder ekstracellulær matrixgel (ECM) ved 0,1 μg/μL i hver brønd i CIM-pladens øverste kammer. For at undgå at få luftbobler skal du bruge den omvendte pipettingmetode. Fjern straks 30 μL ECM-gel, så der efterlades 20 μL i brønden.
- Efter ECM-gelbelægningen skal pladen opbevares i kuvøsen under dyrkningsforhold i 4 timer med låg på. Under ECM-gelbelægningen og -tørringen skal du træffe forebyggende foranstaltninger for at undgå direkte kontakt mellem elektroderne i2 pladernes øverste kammer med hænderne, overfladen af biosikkerhedsskabet eller CO 2-inkubatoren.
- Hvis du vil konfigurere impedansmålingsprogrammet, skal du dobbeltklikke på det tilknyttede softwareikon (se Materialetabel) for at åbne programmet systemsoftware (kontrolenhed). Hver holder har et individuelt vindue med forskellige faner til at indstille forsøgsbetingelserne, impedansmålingstidsintervallet og varigheden samt dataanalyse.
- Under fanen Layout skal du angive firdobler brønde for hver biologisk tilstand og angive totrinscelleimpedansmålinger under fanen Tidsplan. Det første trin er for en engangsbaselinemåling (en sweep med et interval på 1 minut), og det andet trin er at måle celleimpedansen i de enkelte individuelle holdere for et egentligt eksperiment. Til migrering skal du bruge 145 sweeps med et interval på 10 minutter, og til invasion, 577 fejer med et 10 min interval, individuelt indstillet) i de enkelte vugger.
- En h før starten af celleimpedansmålingen tilsættes 160 μL DMEM med 10% FBS som kemoattractant i brøndene i pladens nederste kammer. Der samles enten det øverste kammer, der indeholder de ecm-gelbelagte brønde, eller ubestrøget brønde med det nederste kammer for at måle henholdsvis invasion og migration.
- Fyld brøndene i det øverste kammer med 50 μL lavt serummedium og læg dem i systemets vugge. Kontroller, om alle brøndene genkendes af kontrolenheden ved at klikke på fanen Meddelelse. Hvis meddelelsen vises som OK, er pladen i holderen klar til eksperimentet.
- Preinkuber de helt pakkede plader i rugemaskinen under dyrkningsforhold i 1 time før målinger i realtidscelleanalysesystemets vugge, hvilket er afgørende for akklimatisering af en pakket plade til cellekulturforholdene.
- Til høst af celler behandlet med lavt serummedium skal cellerne trypsiniseres som i trin 1.3, indsamle dem i lavt serummedium og tælle cellerne som i trin 1.4.
- Efter tælling centrifuger cellerne ved 100 x g i 5 min og supernatanten kasseres.
- Resuspender 800.000 celler i 800 μL lav serummedium til migrations- og invasionsanalyser. Derudover resuspendere 300.000 celler i 2 ml dyrkningsmedium og frø i en 35 mm skål til western blot analyse for at bekræfte den regulerede knockdown af Crk og CrkL.
3. Baseline Reading, seeding af cellerne og celleimpedansmåling og -visualisering
- Mål den grundlæggende aflæsning ved at klikke på knappen Start på holderen. Baseline skal aflæses efter at have prækuberet pladerne i 1 time i realtidscelleanalysesystemets vugge under dyrkningsforhold i CO 2-inkubatoren og før såning af cellerne til de respektive brønde i det øverste kammer.
BEMÆRK: Når der klikkes på knappen Start på holderen, vil kontrolenheden spørge, om forsøgsfilen skal gemmes. Når filen er gemt, måler holderanalysatoren den oprindelige celleimpedans som angivet i programmet i første omgang og går i pausetilstand, indtil knappen Start af holderen klikkes igen for at måle celleimpedans en anden trin. - Tag begge plader ud til migration og invasion fra vuggerne efter baselinemålingen, og opbevar dem i biosikkerhedsskabet.
- Frø 100 μL celler (100.000 celler) i firdobler for hver biologisk tilstand i det øverste kammer af CIM-pladen i de respektive brønde som programmeret i holderens styreenhed ved omvendt pipettering for at undgå luftbobler.
- Efter såning, holde pladen under en biosikkerhed kabinet i 30 min ved stuetemperatur at tillade celler til jævnt slå sig ned til bunden. Overfør pladen tilbage til den respektive holder, og klik på holdens startknap for at begynde at måle celleimpedans som programmeret i andet trin på 2.5.
- Efter den sidste gennemsøgning er eksperimentet færdigt, og resultaterne gemmes automatisk.
- Under fanen Dataanalyse kan du visualisere ændringerne i celleimpedans som celleindeks på en tidsafhængig måde under eller efter forsøgets afslutning. Hver af de respektive betingelser for firdobler kan visualiseres enten individuelt eller som gennemsnit og/eller standardafvigelser ved at klikke på indstillingsfelterne for gennemsnits- og standardafvigelse.
- Hvis du vil eksportere celleindeksdata til en regnearksfil, skal du åbne en tom regnearksfil, placere markøren midt i vinduet Dataanalyse og højreklikke. Vælg indstillingen Kopiér data i listeformat iden dialogboks, der vises , og indsæt dataene i det åbne regneark.
- Juster tiden i de rå data for at repræsentere det faktiske starttidspunkt for celleimpedansmålingen. Det andet trins starttidspunkt angives som nul.
BEMÆRK: Kontrolenheden har mulighed for at hente celleindekset med eller uden normalisering (dvs. normaliseret celleindeks) og visualisere resultaterne som en grafisk præsentation på en tidsafhængig måde. I dette eksempel eksporteres celleindeksdata uden normalisering til behandling og grafisk præsentation. - Slip eksperimentet ved at klikke på knappen Slip i hver holder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er blevet foreslået , at Crk og CrkL er vigtige for cellemigration og invasion i forskellige kræftcellelinjer13,17. Selv crk og CrkL proteiner er strukturelt og funktionelt ligner hinanden og spille væsentlige overlappende funktioner16,,19,,20,21, mange gen knockdown undersøgelser for Crk og CrkL har ikke klart behandlet, om knockdown er specifik for enten Crk, CrkL, eller begge dele. Derfor er det uklart, hvilken af de to proteiner bidrager til cellemigration og invasion. Som en proof-of-princip undersøgelse, brugte vi siRNAs specifikke for Crk eller CrkL og studerede deres virkninger på migration og invasion af U-118MG GBM celle linje. Knockdown af Crk faldt CrkII og CrkI protein niveauer med 85% og 86%, henholdsvis uden at reducere CrkL protein niveau. Knockdown af CrkL reduceret CrkL protein niveau med 85% (Figur 1). CrkL knockdown lidt reduceret CrkII og CrkI niveauer, også. Kombineret brug af siRNAs til Crk og CrkL reducerede CrkII-, CrkI- og CrkL-niveauerne med mere end 80 %(figur 1B). På den anden side påvirkede knockdown af Crk og CrkL ikke vinculin- og α-tubulinniveauerne (figur 1).
U-118MG cellerne migrerede til højt serum (10% FBS), og nåede det maksimale migrationsniveau ved 13 timer, som fungerede som eksperimentets interne kontrol (figur 2A). Med Crk knockdown blev cellemigration forsinket, og cellerne fortsatte med at migrere indtil 23 h. CrkL knockdown hæmmede betydeligt cellemigration. U-118MG celler mistede deres vandrende evne ved knockdown af både Crk og CrkL (Figur 2A), hvilket tyder på, at Crk og CrkL spille væsentlige overlappende roller i kræft celle migration. Denne konklusion er imidlertid ikke klart, hvis cellemigration en der undersøges på et bestemt tidspunkt. Når cellevandringer ved 6 eller 13 timer blev sammenlignet, hæmninger af Crk og CrkL knockdowns var indlysende (Figur 2B,C). I modsætning hertil havde Crk knockdown ikke en hæmmende virkning på cellemigration ved 18 timer (Figur 2D), hvilket førte til modstridende resultater afhængigt af det tidspunkt, der blev valgt til sammenligning. De hæmmende virkninger af CrkL knockdown og Crk / CrkL dobbelt knockdown var klart synlige på alle tre tidspunkter. Disse resultater viser klart, at cellemigration skal vurderes over hele perioden med cellemigration for præcist at analysere virkningerne ved genmanipulation eller narkotika.
U-118MG celler invaderede høj serum, nå det maksimale niveau af invasion på 52 h, der tjente som forsøget interne kontrol (Figur 3A). Med Crk knockdown blev celleinvasionen forsinket, men den nåede et tilsvarende maksimumsniveau ved 60 timer. Med CrkL knockdown, U-118MG celler viste forsinket og reduceret invasion sammenlignet med kontrolceller. Kombineret knockdown af Crk og CrkL yderligere hæmmet celle invasion (Figur 3A). Sammenligning af celle invasion på 36 h, når kontrolcellerne var aktivt under invasion, klart demonstreret hæmning ved individuel knockdown af Crk og CrkL og en synergistisk hæmning af Crk / CrkL dobbelt knockdown (Figur 3B). Men en sammenligning af celle invasion på 52 eller 60 h udstillet en let eller ingen hæmmende virkning ved Crk knockdown (Figur 3C,D). Disse resultater understøtter klart forslaget om, at celleinvasion skal analyseres i hele eksperimentets periode.
Disse resultater viser, at både Crk og CrkL mægle celle migration og invasion, og at real-time celle analysesystem har en klar fordel i forhold til de traditionelle metoder til at forstå de forskellige kinetik af celle migration og invasion og specifikke virkninger på cellefænotyper på en tidsafhængig måde.
Figur 1: siRNA-medieret knockdown af CrkI, CrkII og CrkL i U-118MG celler. (A) I alt blev der fremstillet cellelysater 4 dage efter, at U-118MG-celler blev elektroporated med ikke-målretningskontrol siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA eller både Crk og CrkL siRNAs, og proteinniveauer blev bestemt af vestlige blot analyser som beskrevet tidligere1. (B) Signalintensiteterne for de respektive frekvensbånd blev kvantificeret ved hjælp af billedsystemet og beregnet som procentdele af NT. Deres gennemsnitlige ± SD-værdier er vist i grafen. Vinculin og a-tubulin fungerede som interne kontroller. Statistiske analyser af data blev udført ved hjælp af uparret to-tailed Student's t-test til sammenligning mellem de to eksperimentelle grupper. * p < 0,05 og ** p < 0,01, sammenlignet med NT. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Virkninger af Crk/CrkL-knockdown på U-118MG-cellemigration: (A) Tre dage efter, at U-118MG-celler blev elektroporated med ikke-målretningskontrol siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA eller både Crk og CrkL siRNAs, blev celler høstet, og cellemigration blev undersøgt ved hjælp af analysesystemet i realtid. Migration af U-118MG celler blev hæmmet med en enkelt knockdown af Crk eller CrkL i en tidsafhængig måde. Knockdown af både Crk og CrkL helt blokeret celle migration. Celleindeksværdier ved 6 (B), 13 (C) og 18 timer (D) vises for at sammenligne celleoverførsel på forskellige tidspunkter (pile). Ved 13-timers tid nåede kontrolcellerne (NT) den maksimale migration. På 18 h både kontrol og Crk knockdown celler viste lignende niveauer af celle migration. Statistiske analyser af data blev udført ved hjælp af uparret to-tailed Student's t-test til sammenligning mellem de to eksperimentelle grupper. **p < 0,01, sammenlignet med NT. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkninger af Crk/CrkL knockdown på U-118MG celle invasion: (A) Tre dage efter U-118MG celler blev elektroporated med ikke-målretning kontrol siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, eller både Crk og CrkL siRNAs, celler blev høstet og celle invasion blev undersøgt i 4 dage ved hjælp af real-time analysesystem. Invasionen af U-118MG celler blev hæmmet med en enkelt knockdown af Crk eller CrkL i en tidsafhængig måde. Knockdown af både Crk og CrkL i U-118MG cellelinje reduceret sin invasive kapacitet op til 48 timer i forhold til NT. Cell indeks værdier på 36 (B), 52 (C), og 60 h (D) præsenteres for at sammenligne celle invasion på forskellige tidspunkter (pile). Ved 52-timers tid nåede kontrolcellerne (NT) det første højdepunkt af invasionen. Ved 60 timer nåede Crk knockdown celler det første højdepunkt af invasionen. Statistiske analyser af data blev udført ved hjælp af uparret to-tailed Student's t-test til sammenligning mellem de to eksperimentelle grupper. * p < 0,05 og ** p < 0,01, sammenlignet med NT. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtidsmålingen af cellemigrering og invasion ved hjælp af realtidscelleanalysesystemet er en enkel, hurtig og kontinuerlig overvågningsproces med flere, betydelige fordele i forhold til de traditionelle metoder, der leverer data på et enkelt tidspunkt. Som med de traditionelle metoder skal forsøgsbetingelserne optimeres for hver cellelinje til realtidscelleanalysesystemet, fordi hver cellelinje kan være forskellig med hensyn til dets vedhæftning til substratet, vækst, celle-til-celle kontakter og træk- og invasive evner. På grund af disse forskelle kan hver cellelinje vise forskellige cellulære kinetik og celleimpedanser. Impedans er stærkt påvirket af antallet af celler, der er seedet i en brønd, tiden for cellevedhæfte, forsinkelsestiden, før cellerne begynder at migrere eller invadere, og koncentrationen af ECM-gel på CIM-plader. For det første gør celleanalyse i realtid optimeringen lettere, fordi den giver resultater i realtid over en bestemt tidsperiode, hvilket gør det muligt for forskere at identificere det tidspunkt, hvor kontrolcellerne viser aktiv cellemigration og invasion, og når kontrolelementet celler når de maksimale niveauer af migration og invasion. For det andet kan ektopiske genoverekspression eller gen knockdown undersøgelser brug for yderligere optimeringer, fordi cellerne nødt til at vedtage fænotyper fra de modificerede genotypiske ændringer. Desuden kan effektive lægemiddelkoncentrationer og effekten af lægemidler bestemmes i kombination med normale eller modificerede genetiske tilstande ved hjælp af realtidscelleanalysesystemet.
Traditionelle metoder såsom sårheling, blød agar, Boyden kammer migration, eller invasion analyser er blevet brugt til at fastslå, at knockdown af enten Crk eller CrkL fører til reduceret migration og invasion i forskellige kræft cellelinjer13,17. I denne undersøgelse, vi induceret enkelt eller dobbelt knockdown af Crk og CrkL i U-118MG celle linje og undersøgt celle migration og invasion. Real-time måling af celle impedans over hele eksperimentet forudsat dybdegående oplysninger om kinetik af celle migration og invasion, giver os mulighed for at identificere to forskellige former for hæmning. Mens Crk knockdown forsinket migration og invasion, CrkL knockdown hæmmet migration og invasion i hele perioden. Desuden, den dobbelte knockdown af både Crk og CrkL helt blokeret celle migration og væsentligt hæmmet celle invasion.
Denne undersøgelse giver en proof-of-concept, der kombinerer den systematiske knockdown tilgang til at fremkalde enkelt og dobbelt knockdown af Crk og CrkL med real-time analyser af celle migration og invasion i hele perioden af forsøgene er nødvendig for at omfattende analyser af Crk- og CrkL-medieret funktioner i kræftceller. De data, der præsenteres i denne undersøgelse tyder på, at denne metode også kan bruges til at teste kandidat lægemidler for deres hæmmende virkninger på Crk og CrkL. Samlet set real-time celle analysesystem er nyttig tiiii realtid, dybdegående og omfattende analyser muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Olivia Funk for hendes tekniske hjælp med data fra realtidscelleanalysesystemet. Vi takker også Medical Writing Center på Children's Mercy Kansas City for at redigere dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Tom Keaveny Begavet Fond for Pædiatrisk Cancer Research (til TP) og af Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board finansiering (til TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
