Summary
Kreft er en dødelig sykdom på grunn av sin evne til å metastasere til forskjellige organer. Å bestemme kreftcellenes evne til å migrere og invadere under ulike behandlingsforhold er avgjørende for å vurdere terapeutiske strategier. Denne protokollen presenterer en metode for å vurdere sanntids metastatiske evner av en glioblastom kreft cellelinje.
Abstract
Kreft oppstår på grunn av ukontrollert spredning av celler initiert av genetisk ustabilitet, mutasjoner og miljømessige og andre stressfaktorer. Disse ervervede abnormiteter i komplekse, flerlags molekylære signalnettverk indusereavvikende cellespredning og overlevelse, ekstracellulær matrisenedbrytning og metastase til fjerne organer. Omtrent 90 % av kreftrelaterte dødsfall anslås å være forårsaket av direkte eller indirekte effekter av metastatisk formidling. Derfor er det viktig å etablere et svært pålitelig, omfattende system for å karakterisere kreftcelleatferd på genetiske og miljømessige manipulasjoner. Et slikt system kan gi en klar forståelse av molekylær regulering av kreftmetastase og muligheten for vellykket utvikling av stratifiserte, presise terapeutiske strategier. Derfor tillater nøyaktig bestemmelse av kreftcelleatferd som migrasjon og invasjon med gevinst eller tap av funksjon av gen(er) vurdering av kreftcellenes aggressive natur. Sanntidsmålingssystemet basert på celleimpedans gjør det mulig for forskere å kontinuerlig skaffe data under et helt eksperiment og umiddelbart sammenligne og kvantifisere resultatene under ulike eksperimentelle forhold. I motsetning til konvensjonelle metoder krever denne metoden ikke fiksering, farging og prøvebehandling for å analysere celler som migrerer eller invaderer. Denne metoden papir understreker detaljerte prosedyrer for sanntid bestemmelse av migrasjon og invasjon av glioblastom kreftceller.
Introduction
Kreft er en dødelig sykdom på grunn av sin evne til å metastasere til forskjellige organer. Å bestemme kreftgenotyper og fenotyper er avgjørende for å forstå og utforme effektive terapeutiske strategier. Tiår med kreftforskning har ført til utvikling og tilpasning av ulike metoder for å bestemme kreftgenotyper og fenotyper. En av de nyeste tekniske utviklingene er sanntidsmåling av cellemigrasjon og invasjon basert på celleimpedans. Cellevedheft til underlag og cellecellekontakter spiller en viktig rolle i celle-til-celle-kommunikasjon og -regulering, utvikling og vedlikehold av vev. Abnormiteter i cellevedhesjon fører til tap av cellecellekontakt, nedbrytning av ekstracellulær matrise (ECM), og gevinst av trekk- og invaderende egenskaper av celler, som alle bidrar til metastase av kreftceller til forskjellige organer1,2. Ulike metoder er tilgjengelige for å bestemme cellemigrasjon (sårheling og Boyden kammeranalyser) og invasjon (Matrigel-Boyden kammeranalyse)3,4,5. Disse konvensjonelle metodene er semikvantitative fordi celler må merkes med en fluorescerende fargestoff eller andre fargestoffer enten før eller etter eksperimentet for å måle celle fenotyper. I tillegg er det nødvendig med mekaniske forstyrrelser i noen tilfeller for å skape et sår for å måle migrering av celler til sårstedet. Videre er disse eksisterende metodene tidkrevende, arbeidskrevende, og måler resultatene på bare ett tidspunkt. I tillegg er disse metodene utsatt for å gjøre unøyaktige målinger på grunn av inkonsekvent håndtering under eksperimentell prosedyre6.
I motsetning til konvensjonelle metoder måler sanntidscelleanalysesystemet celleimpedans i sanntid uten å kreve pre- eller poststaining og mekanisk skade av celler. Enda viktigere, varigheten av et eksperiment kan forlenges slik at biologiske effekter kan bestemmes på en tidsavhengig måte. Å utføre eksperimentet er tidseffektivt og ikke arbeidskrevende. Analyse av data er relativt enkelt og nøyaktig. Sammenlignet med andre metoder, er denne metoden en av de beste sanntidsmålingene for å måle cellemigrasjon og invasjon6,7,8,9.
Giaever og Keese var de første som beskrev den impedansbaserte målingen av en cellepopulasjon på overflaten av elektroder10. Sanntidscelleanalysesystemet fungerer på samme prinsipp. Området for hver mikroplatebrønn er ca. 80 % dekket med en rekke gullmikroelektroder. Når elektrodenoverflaten er okkupert av celler på grunn av overholdelse eller spredning av cellene, endres den elektriske impedansen. Denne impedansen vises som celleindeksen, som er direkte proporsjonal med cellene som dekker elektrodens overflateområde etter at de trenger inn i mikroporøsmembranen (median porestørrelse på denne membranen er 8 μm)11.
Crk og CrkL er adapterproteiner som inneholder SH2- og SH3-domener og spiller viktige roller i ulike cellulære funksjoner, for eksempel cytoskjelettregulering, celletransformasjon, spredning, adhesjon, epitel-mesenchymal overgang, migrasjon, invasjon og metastase ved å formidle proteinproteininteraksjoner i mange signalveier1,,12,,13,,14,,15,16,17, 18. Derfor er det viktig å bestemme Crk / CrkL-avhengige trekk- og invasive evner av kreftceller. Sanntidscelleanalyse ble utført for å bestemme de migrerende og invasive evnene til glioblastomceller ved genknockdown av Crk og CrkL.
Denne metoden papir beskriver detaljerte målinger av Crk- og CrkL-mediert migrasjon og invasjon av menneskelige glioblastomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle cellekulturmaterialer må være sterile, og hele eksperimentet må utføres i et biosikkerhetsskap under sterile forhold.
1. Kultur og elektroporasjon av U-118MG Glioblastoma Cell Line
- Kultur U-118MG cellelinje i 5% føtal storfe serum (FBS) som inneholder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (kultur medium) og Vedlikehold ved 37 °C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO2 inkubator (kulturforhold).
- Bruk 70– 80% confluent friske celler for elektroporasjon.
- For høsting av celler, vask cellene vokser i kulturretter med 1x PBS og legg til 2 ml 0,05% trypsin-EDTA. Plasser i inkubatoren for 30-tallet og fjern trypsin-EDTA. Samle celler i kulturmediet i et 15 ml rør.
- Tell cellene ved hjelp av en håndholdt automatisert celleteller, sentrifugeceller ved 100 x g i 5 min, og kast supernatanten.
- Suspender cellepelleti kulturmediet og ta 600.000 celler for hver tilstand i et mikrocentrifugerør. Juster celletallet avhengig av eksperimentelldesign og vekstrater.
- Overfør cellesuspensjonen til et mikrocentrifugerør og tilsett 800 μL av Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS). Snurr ned med en minicentrifuge i 30-tallet og kast supernatanten.
- Tilsett 60 μL resuspensjonsbuffer R i cellepelleten og tilsett siRNAs (dvs. ikke-målretting siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA eller både Crk og CrkL siRNAs) i en konsentrasjon på 6 μM til det respektive mikrocentrifugerøret. Bland dem forsiktig ved å trykke på.
- Elektroporate 10 μL celler med et elektroporasjonssystem ved 1350 V for 10 ms med tre pulser og overføre elektropoerte celler til 5 ml av kulturmediet. Gjenta elektroporasjonen for resten av cellene som er forberedt for hver tilstand.
- Fullfør all respektive elektroporasjon. Overfør elektropoerte celler til to 35 mm retter per tilstand og kultur dem under kulturforhold i 3 dager.
- På den tredje dagen, behandle alle elektroporated celler i 0,5% FBS som inneholder DMEM (lavt serummedium) for 6 timer før selve celleimpedansmålingen.
2. Utarbeidelse av sanntids celleanalysesystem, celleinvasjon og migrasjon (CIM) plater og galvaniserede U-118MG-celler for plating
- Plasser sanntidscelleanalysesystemet i en2 CO 2-inkubator under kulturforhold 5-6 timer før eksperimentstart for å stabilisere systemet til kulturforholdene.
- For invasjonsanalysen, plate 50 μL dmem (vanlig medium) som inneholder ekstracellulær matrise (ECM) gel på 0,1 μg/μL i hver brønn i det øvre kammeret på CIM-platen. For å unngå luftbobler, bruk omvendt pipetteringsmetode. Fjern umiddelbart 30 μL ECM gel, og la 20 μL være i brønnen.
- Etter ECM gelbelegg, hold platen i inkubatoren under kulturforhold i 4 timer med lokket på. Under ECM gel belegg og tørking, ta forebyggende tiltak for å unngå direkte kontakt av elektrodene i det øvre kammeret av platene med hendene, overflatene av biosafety kabinett, eller CO2 inkubator.
- Hvis du vil konfigurere programmet for impedansmåling, dobbeltklikker du det tilknyttede programvareikonet (se Materialtabellen) for å åpne programmet for systemprogrammet (kontrollenhet). Hver vugge har et individuelt vindu med forskjellige faner for å angi eksperimentelle forhold, impedansmålingstidsintervall og varighet og dataanalyse.
- Under Oppsett-fanen angir du quadruplicate brønner for hver biologiske tilstand og angir totrinns celleimpedansmålinger under kategorien Tidsplan. Det første trinnet er for en engangs måling ved baseline (ett sveip med et intervall på 1 min), og det andre trinnet er å måle celleimpedansen i respektive individuelle vugger for et faktisk eksperiment. For migrasjon, bruk 145 feier med et 10 min intervall, og for invasjon, 577 feier med et 10 min intervall, individuelt satt) i respektive individuelle vugger.
- En time før starten av celleimpedansmålingen, tilsett 160 μL DMEM med 10% FBS som kjemoattractant i brønnene i det nedre kammeret på platen. Monter enten det øvre kammeret som inneholder ECM gelbelagte brønner eller ubelagte brønner med det nedre kammeret for å måle henholdsvis invasjon og migrasjon.
- Fyll brønnene i det øvre kammeret med 50 μL lavt serummedium og legg dem i systemets vugge. Kontroller om alle brønnene gjenkjennes av kontrollenheten ved å klikke kategorien Melding. Hvis meldingen vises som OK, er platen i holderen klar for eksperimentet.
- Preinkuber de fullstendig pakkede platene i inkubatoren under kulturforhold i 1 time før målinger i sanntidscelleanalysesystemvugge, som er avgjørende for akklimatisering av en pakket plate til cellekulturforholdene.
- For høsting av celler behandlet med lavt serummedium, trypsinize cellene som i trinn 1.3, samle dem i lavt serummedium, og telle cellene som i trinn 1.4.
- Etter telling, sentrifugeceller på 100 x g i 5 min og kast supernatanten.
- Resuspender 800 000 celler i 800 μL med lavt serummedium for migrering og invasjonsanalyser. I tillegg resuspendere 300.000 celler i 2 ml kultur medium og frø i en 35 mm tallerken for vestlig blot analyse for å bekrefte regulert knockdown av Crk og CrkL.
3. Grunnlinjelesing, seeding av cellene og celleimpedansmåling og visualisering
- Mål grunnlinjeavlesningen ved å klikke på startknappen for holderen. Grunnlinjen bør leses etter preinkubering platene for 1 h i vuggen av sanntids celleanalysesystem under kulturforhold i CO2 inkubator og før seeding cellene til de respektive brønnene i det øvre kammeret.
MERK: Når startknappen for vugge er klikket, vil kontrollenheten spørre om du vil lagre den eksperimentelle filen. Når filen er lagret, måler vuggeanalysatoren grunnlinjecelleimpedansen som angitt i programmet i utgangspunktet, og går inn i en pausemodus til startknappen for vugge klikkes på nytt for å måle celleimpedans i det andre trinnet. - Ta ut begge platene for migrasjon og invasjon fra vuggene etter baseline måling og holde dem i biosafety kabinettet.
- Frø 100 μL celler (100 000 celler) i quadruplicates for hver biologiske tilstand i det øvre kammeret av CIM-platen i de respektive brønnene som programmert i styreenheten av holderen ved omvendt pipettering for å unngå luftbobler.
- Etter seeding, hold platen under et biosikkerhetsskap i 30 minutter ved romtemperatur for å tillate celler å jevnt slå seg ned til bunnen. Overfør platen tilbake til den respektive holderen og klikk på vuggestartknappen for å begynne å måle celleimpedans som programmert i det andre trinnet på 2,5.
- Etter det siste sveipet er eksperimentet ferdig, og resultatene lagres automatisk.
- Visualiser endringene i celleimpedans som celleindeks på en tidsavhengig måte under eller etter at eksperimentet er fullført. Data Analysis Hver av de respektive betingelsene for quadruplicates kan visualiseres enten individuelt eller Option som gjennomsnitt og/eller standardavvik ved å klikke på Alternativ-boksene for gjennomsnitts- og standardavvik.
- Hvis du vil eksportere celleindeksdata til en regnearkfil, åpner du en tom regnearkfil, plasserer markøren midt i dataanalysevinduet og høyreklikker. Velg alternativet Kopier data i listeformati dialogboksen som vises, og lim inn dataene i det åpne regnearket.
- Juster tiden i rådataene for å representere den faktiske starttiden for celleimpedansmålingen. Det andre trinnets starttid er satt som null.
MERK: Kontrollenheten har muligheten til å få celleindeksen med eller uten normalisering (dvs. normalisert celleindeks) og visualisere resultatene som en grafisk presentasjon på en tidsavhengig måte. I dette eksemplet eksporteres celleindeksdata uten normalisering for behandling og grafisk presentasjon. - Slipp eksperimentet ved å klikke på Slipp-knappen i hver holder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det har blitt foreslått at Crk og CrkL er viktige for cellemigrasjon og invasjon i forskjellige kreftcellelinjer13,17. Selv om Crk og CrkL proteiner er strukturelt og funksjonelt lik hverandre og spille essensielle overlappende funksjoner16,19,20,21, mange gen knockdown studier for Crk og CrkL har ikke klart adressert om knockdown er spesifikk for enten Crk, CrkL, eller begge deler. Derfor er det uklart hvilke av de to proteinene som bidrar til cellemigrasjon og invasjon. Som en proof-of-principle studie, brukte vi siRNAs spesifikke for Crk eller CrkL og studerte deres effekter på migrasjon og invasjon av U-118MG GBM cellelinje. Knockdown av Crk reduserte CrkII og CrkI proteinnivåer med henholdsvis 85% og 86%, uten å redusere CrkL proteinnivå. Knockdown av CrkL reduserte CrkL proteinnivået med 85% (Figur 1). CrkL knockdown noe redusert CrkII og CrkI nivåer, også. Kombinert bruk av siRNAs for Crk og CrkL reduserte CrkII-, CrkI- og CrkL-nivåer med mer enn 80 % (figur 1B). På den annen side påvirket ikke nedslåing av Crk og CrkL vinculin- og α-tubulinnivåene (figur 1).
U-118MG-cellene migrerte til høyt serum (10 % FBS), og nådde det maksimale migrasjonsnivået ved 13 timer, som fungerte som eksperimentintern kontroll (figur 2A). Med Crk knockdown ble cellemigrasjonen forsinket, og cellene fortsatte å migrere til 23 h. CrkL knockdown betydelig hemmet cellemigrasjon. U-118MG celler mistet sin trekkevne ved knockdown av både Crk og CrkL (Figur 2A), noe som tyder på at Crk og CrkL spiller viktige overlappende roller i kreftcellemigrasjon. Denne konklusjonen er imidlertid ikke tydelig om celleoverføring undersøkes på et fast tidspunkt. Når celleoverføringer på 6 eller 13 timer ble sammenlignet, var inhiberinger av Crk og CrkL knockdowns åpenbare (Figur 2B,C). Crk knockdown hadde derimot ingen hemmende effekt på cellemigrasjon ved 18 timer (Figur 2D), noe som førte til motstridende resultater avhengig av tidspunktet som er valgt for sammenligning. De hemmende effektene av CrkL knockdown og Crk/CrkL dobbel knockdown var tydelig synlige på alle tre tidspunktene. Disse resultatene viser tydelig at cellemigrasjon må vurderes over hele cellemigrasjonens periode for å analysere effekter nøyaktig ved genetiske manipulasjoner eller narkotika.
U-118MG cellene invaderte høyt serum, og nådde det maksimale nivået av invasjon på 52 timer, som fungerte som eksperimentets interne kontroll (Figur 3A). Med Crk knockdown ble celleinvasjonen forsinket, men den nådde et lignende maksimumsnivå på 60 timer. Med CrkL knockdown viste U-118MG-celler forsinket og redusert invasjon sammenlignet med kontrollcellene. Kombinert knockdown av Crk og CrkL ytterligere hemmet celle invasjon (Figur 3A). Sammenligning av celleinvasjon ved 36 timer, da kontrollcellene aktivt gjennomgikk invasjon, demonstrerte tydelig hemming av individuell knockdown av Crk og CrkL og en synergistisk hemming av Crk/CrkL dobbel knockdown (Figur 3B). Imidlertid viste en sammenligning av celleinvasjon på 52 eller 60 h en liten eller ingen hemmende effekt av Crk knockdown (Figur 3C,D). Disse resultatene støtter tydelig forslaget om at celleinvasjon bør analyseres over hele perioden av eksperimentet.
Disse resultatene viser at både Crk og CrkL megle cellemigrasjon og invasjon, og at sanntidscelleanalysesystemet har en klar fordel over de tradisjonelle metodene for å forstå de forskjellige kinetikkene til cellemigrasjon og invasjon og spesifikke effekter på cellefenotyper på en tidsavhengig måte.
Figur 1: siRNA-mediert knockdown av CrkI, CrkII og CrkL i U-118MG celler. (A) Totalt cellelysater ble utarbeidet 4 dager etter at U-118MG-celler ble galvaniserert med ikke-målrettingskontroll siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA eller både Crk og CrkL siRNAs, og proteinnivåer ble bestemt av vestlige blotanalyser som beskrevet tidligere1. (B) Signalintensiteten til respektive bånd ble kvantifisert ved hjelp av bildesystemet og beregnet som prosentandeler av NT. Deres gjennomsnittlige ± SD-verdier er vist i grafen. Vinculin og a-tubulin fungerte som interne kontroller. Statistiske analyser av data ble utført ved hjelp av unpaired to-tailed Student t-test for sammenligning mellom de to eksperimentelle gruppene. *p < 0,05 og **p < 0,01, sammenlignet med NT. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Effekter av Crk/CrkL-nedslåing på U-118MG celleoverføring: (A) Tre dager etter at U-118MG-celler ble elektrokert med ikke-målrettingskontroll siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA eller både Crk og CrkL siRNAs, celler ble høstet og cellemigrasjon ble undersøkt ved hjelp av sanntidsanalysesystemet. Migrering av U-118MG-celler ble hemmet med en enkelt knockdown av Crk eller CrkL på en tidsavhengig måte. Knockdown av både Crk og CrkL helt blokkert cellemigrasjon. Celleindeksverdier ved 6 (B), 13 (C)og 18 timer (D) presenteres for å sammenligne celleoverføring på forskjellige tidspunkter (piler). Ved 13 timer nådde kontrollcellene (NT) maksimal migrering. Ved 18 timer både kontroll og Crk knockdown celler viste lignende nivåer av cellemigrasjon. Statistiske analyser av data ble utført ved hjelp av unpaired to-tailed Student t-test for sammenligning mellom de to eksperimentelle gruppene. **p < 0,01, sammenlignet med NT. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Effekter av Crk/CrkL knockdown på U-118MG celleinvasjon: (A) Tre dager etter at U-118MG-celler ble elektroporated med ikke-målretting kontroll siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, eller både Crk og CrkL siRNAs, celler ble høstet og celleinvasjon ble undersøkt i 4 dager ved hjelp av sanntidsanalysesystem. Invasjonen av U-118MG celler ble hemmet med en enkelt knockdown av Crk eller CrkL på en tidsavhengig måte. Knockdown av både Crk og CrkL i U-118MG cellelinjen redusert sin invasive kapasitet opp til 48 h sammenlignet med NT. Cell indeksverdier på 36 (B), 52 (C), og 60 h (D) presenteres for å sammenligne celle invasjon på forskjellige tidspunkter (piler). Ved 52 timer nådde kontrollcellene (NT) den første toppen av invasjonen. På 60 h nådde Crk knockdown celler den første toppen av invasjonen. Statistiske analyser av data ble utført ved hjelp av unpaired to-tailed Student t-test for sammenligning mellom de to eksperimentelle gruppene. *p < 0,05 og **p < 0,01, sammenlignet med NT. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sanntidsmåling av celleoverføring og invasjon ved hjelp av sanntidscelleanalysesystemet er en enkel, rask og kontinuerlig overvåkingsprosess med flere, betydelige fordeler over de tradisjonelle metodene som gir data på et enkelt tidspunkt. Som med de tradisjonelle metodene, må eksperimentelle forhold optimaliseres for hver cellelinje for sanntidscelleanalysesystemet, fordi hver cellelinje kan være forskjellig når det gjelder adhesjon til substratet, veksten, celle-til-celle-kontaktene og trekk- og invasive evner. På grunn av disse forskjellene kan hver cellelinje vise forskjellige cellulære kinetikk og celleimpedanser. Impedans er sterkt påvirket av antall celler som er sett i en brønn, tiden for cellevedhesheasjon, forsinkelsestiden før cellene begynner å migrere eller invadere, og konsentrasjonen av ECM gel på CIM-plater. For det første gjør sanntidscelleanalyse optimaliseringen enklere fordi den gir resultater i sanntid over en bestemt tidsperiode, slik at forskere kan identifisere tidspunktet når kontrollcellene viser aktiv cellemigrasjon og invasjon, og når kontrollen cellene når de maksimale nivåene av migrasjon og invasjon. For det andre kan ektopisk genoveruttrykk eller genknockdown-studier trenge ytterligere optimaliseringer, fordi cellene må vedta fenotypene fra de modifiserte genotypiske endringene. I tillegg kan effektive legemiddelkonsentrasjoner og effekten av legemidler bestemmes i kombinasjon med normale eller modifiserte genetiske forhold ved hjelp av sanntidscelleanalysesystemet.
Tradisjonelle metoder som sårheling, myk agar, Boyden kammermigrasjon, eller invasjonsanalyser har blitt brukt til å fastslå at nedslåing av enten Crk eller CrkL fører til redusert migrasjon og invasjon i forskjellige kreftcellelinjer13,17. I denne studien induserte vi enkelt eller dobbel knockdown av Crk og CrkL i U-118MG cellelinjen og undersøkte cellemigrasjon og invasjon. Sanntidsmåling av celleimpedanser over hele eksperimentet ga grundig informasjon om kinetikken til cellemigrasjon og invasjon, slik at vi kan identifisere to forskjellige hemmeresformer. Mens Crk knockdown forsinket migrasjon og invasjon, crkl knockdown hemmet migrasjon og invasjon over hele tidsperioden. Videre, dobbel knockdown av både Crk og CrkL helt blokkert cellemigrasjon og vesentlig hemmet celle invasjon.
Denne studien gir et konseptbevis som kombinerer den systematiske knockdown-tilnærmingen for å indusere enkelt- og dobbeltknockdown av Crk og CrkL med sanntidsanalyser av cellemigrasjon og invasjon i hele perioden av eksperimentene er nødvendig for omfattende analyser av Crk- og CrkL-medierte funksjoner i kreftceller. Dataene som presenteres i denne studien tyder på at denne metoden også kan brukes til å teste kandidatmedisiner for deres hemmende effekter på Crk og CrkL. Samlet sett er sanntidscelleanalysesystemet nyttig i å sette opp eksperimenter for cellemigrasjon eller celleinvasjon og gjør sanntid, grundig og omfattende analyser mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Olivia Funk for hennes tekniske assistanse med sanntidscelleanalysesystemdata. Vi takker også Medical Writing Center på Children's Mercy Kansas City for redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (til TP) og av Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board funding (til TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
