Summary
هنا، نحن نصف سهل الاستخدام غزو القول للورم الأرومي الدبقي. هذا القول مناسب للخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي. كما يتم وصف ماكرو فيجي لسهولة تقدير كمية الغزو والهجرة والانتشار.
Abstract
ثنائية الأبعاد (2D) الثقافات الخلية لا تحاكي في نمو ورم الجسم الحي مرضية. لذلك ، تم تطوير نماذج كروية الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D). قد تكون هذه النماذج مهمة بشكل خاص في مجال الأورام العصبية. في الواقع، أورام الدماغ لديها ميل لغزو بيئة الدماغ صحية. نحن نصف هنا مثالية 3D الورم الأرومي الجليس spheroid القائم على القول أننا وضعت لدراسة غزو الورم. نحن نقدم جميع التفاصيل التقنية والأدوات التحليلية لتنفيذ هذا القول بنجاح.
Introduction
في معظم الدراسات باستخدام خطوط الخلايا الأولية أو المتاحة تجاريا، يتم تنفيذ المقالات على الخلايا التي تزرع على الأسطح البلاستيكية كثقافات أحادية الطبقات. إدارة ثقافة الخلية في 2D يمثل عيوب، كما أنه لا يحاكي في بيئة الخلية 3D في الجسم الحي. في الثقافات 2D، سطح الخلية بأكملها هو على اتصال مباشر مع المتوسطة، وتغيير نمو الخلايا وتعديل توافر المخدرات. وعلاوة على ذلك، فإن سطح البلاستيك غير الفسيولوجي ة يثير تمايز الخلية1. وقد تم تطوير نماذج ثقافية ثلاثية الأبعاد للتغلب على هذه الصعوبات. لديهم ميزة محاكاة العمارة متعددة الخلايا وعدم تجانس الأورام2، وبالتالي يمكن اعتبارها نموذجًا أكثر ملاءمة للأورام الصلبة3. مورفولوجيا معقدة من spheroids يساهم في تقييم أفضل penetrance المخدرات والمقاومة4. عدم تجانس الورم في السفيرويد يؤثر على انتشار الأكسجين والمواد المغذية ، والاستجابة للعوامل الدوائية(الشكل 1A). يتم تغيير انتشار الأكسجين عندما يصل حجم السفيرويد إلى 300 ميكرومتر ، مما يؤدي إلى بيئة نقص الأكسكة في وسط السفيرويد(الشكل 1A ، C). الأيض هي أيضا أقل اختراق من خلال طبقات الخلية وردود الفعل الأيضية التعويضية تجري5. عندما يزيد قطر السفيرويد ، يمكن ملاحظة النوى النخرية ، مما يزيد من محاكاة الخصائص الموجودة في العديد من أنواع السرطان الصلبة ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي سرطان الدماغ العدواني (GBM)6.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من المقالات الغزو 2D أو 3D للورم الأرومي الدبقي في الأدب7,8. المقالات ثنائية الأبعاد هي أساسا لدراسة الغزو في مستوى أفقي على طبقة مصفوفة رقيقة أو في غرفة Boyden اقدر9. وقد وصفت المقالات ثلاثية الأبعاد مع الثقافات الكروية 3D باستخدام خطوط الخلايا الأرومية الكلاسيكية10. يتم تمثيل المتغيرات الأكثر تعقيدا من قبل غزو الاعضاء في الدماغ من قبل السفير الورم في الثقافات المواجهة11. ومع ذلك، لا يزال من المهم تطوير نسخة سهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ متاحة لأي مختبر. لقد وضعنا بروتوكولا لتوليد الخلايا الجذعية الورم الأرومي الدبقي من عينات المريض. يمكن التحكم بسهولة في القياس الكمي لهذه المقالات ويتطلب فقط برامج مفتوحة الوصول عبر الإنترنت. لفترة وجيزة، يتم قطع قطع الورم إلى قطع صغيرة وهضمها بشكل أنزيمي. تزرع الخلايا المفردة المشتقة من عملية الهضم في الوسط العصبي. بعد 4-7 أيام ، تتشكل هياكل السبرويد تلقائيًا. عند زرع داخل الجمجمة في نماذج الفئران ، فإنها تشكل أورامًا تعرض نواة نخرمحاطة بخلايا زائفة12. هذا يشبه إلى حد كبير الخصائص الموجودة في المرضى GBM.
في هذه المقالة، نحن نصف بروتوكولنا لإنتاج spheroids من عدد محدد من الخلايا لضمان الاستنساخ. يمكن استخدام مصفوفتين متكاملتين لهذا الغرض: Matrigel ونوع الكولاجين I. Matrigel يتم تخصيبه في عوامل النمو ويحاكي الغشاء القاعدي الثديي المطلوب للتعلق بالخلايا والهجرة. من ناحية أخرى ، الكولاجين من النوع الأول ، وهو عنصر هيكلي من ستروما ، هو المصفوفة خارج الخلية الرجفانية الأكثر شيوعًا ويستخدم في المقالات غزو الخلية. هنا، ونحن نوضح نموذجنا SPheroid GBM من خلال تنفيذ الهجرة والانتشار المقالات. تم إجراء التحليل ليس فقط في نقاط زمنية محددة ولكن أيضا عن طريق رصد توسع الخلايا وانتقال الخلايا عن طريق التصوير الحي. وعلاوة على ذلك، تم إجراء المجهر الإلكتروني لتصور التفاصيل المورفولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى (من مستشفى هوكيلاد، بيرغن، النرويج وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات المحلية). يتبع بروتوكولنا المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسستنا.
1. توليد حجم موحد ورم spheroids
ملاحظة: يتم استزراع الخلايا الشبيهة بالجذع في وسط عصبي مكمل بملحق B27، الهيبارين، FGF-2، البنسلين، والعقديات، كما هو موضح في المواد السابقة12. هذه الخلايا تشكل تلقائيا spheroids في الثقافة.
- غسل الخلايا السرطانية مع 5 مل الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS) واحتضان الخلايا مع إنزيم التفكك 0.5-1 مل (انظر جدول المواد)لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
- يغسل مع 4-4.5 مل PBS وإضافة 10 مل من متوسط النمو الكامل (كامل الوسط العصبي، cNBM).
- عد الخلايا باستخدام تقنية العد التلقائي مع trypan الأزرق وشريحة غرفة العد الخلية.
- لتوليد 100 spheroids مع 104 خلايا لكل spheroid (وفقا للحجم المفضل)، مزيج 106 خلايا في 8 مل من NBM مع 2 مل من 2٪ ميثيل سيلولوز.
- نقل التعليق إلى وعاء نظام معقم والاستغناء 100 μL/well مع ماصة متعددة القنوات في لوحة قاع مستديرة 96 جيدا.
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و الرطوبة 95٪. سوف تشكل spheroids متساوية الحجم ويمكن استخدامها بعد 3-4 أيام.
2. تجارب ثلاثية الأبعاد
- انتشار
- اعداد
- مثبطات تعليق (على سبيل المثال، الروتن كما هو الحال في الشكل 4A)والمواد الكيميائية في 100 ميكرولتر من المتوسط وإضافة إلى 100 ميكرولتر من المتوسط في كل بئر (أي واحد spheroid لكل بئر).
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و الرطوبة 95٪.
- الحصول على الصور وتحليلها
- التقاط الصور مع مجهر الفيديو في brightfield لخلق سلسلة من الظروف في T0 والأوقات التالية المتوقعة.
- استخدم فيجي لتحليل الصور إما يدويًا أو بطريقة شبه آلية. للقيام بذلك يدويا، رسم دائرة حول جوهر كرويويد مع أداة الاختيار الحر وقياس مساحة كل كرويرويد. لتحليل الصور بطريقة نصف آلية، استخدم الماكرو المعروض في المستند التكميلي 1 مع "المنطقة الأساسية فقط".
- اعداد
- الغزو
- اعداد
- إعداد مصفوفة الكولاجين في أنبوب على الجليد مع نوع I الكولاجين في 1 ملغ / مل التركيز النهائي، 1x PBS، 0.023xVالكولاجين،1 M هيدروكسيد الصوديوم، وعقيمة H2O. احتضان الحل على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- جمع spheroids من لوحة بئر القاع الجولة في 500 أنابيب ميكرولتر وغسل 2x مع 200 ميكرولتر 1x PBS.
- Pipette spheroids بعناية في 100 ميكرولتر من مصفوفة الكولاجين وإدراجها في وسط بئر في لوحات البئر العادية 96.
- احتضان هلام الكولاجين لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ثم إضافة cNBM على رأس هلام. يمكن إضافة مثبطات أو المنشطات (على سبيل المثال، كلوريد الهيدروجين كما هو مبين في الشكل 4B، 4C)إلى الوسط في هذه الخطوة.
- الحصول على الصور وتحليلها
- التقاط الصور بالتتابع مع مجهر الفيديو في وضع برايتفيلد 24 ساعة بعد إدراج الكولاجين.
- استخدم فيجي لتحليل الصور إما يدويًا أو بطريقة شبه آلية. للقيام بذلك يدويا، رسم حول جوهر والمساحة الإجمالية للspheroid مع أداة الاختيار الحر وقياس المنطقة الغازية من كل spheroid عن طريق طرح المساحة الإجمالية مع المساحة الأساسية. لتحليل الصور بطريقة نصف آلية، استخدم الماكرو كما هو مبين في المستند التكميلي 1 لتحديد المنطقة الغازية.
- اعداد
- الهجره
- اعداد
- معطف 6 لوحة جيدة مع Matrigel (0.2 ملغ / مل) في NBM لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم إزالة Matrigel وإضافة 2 مل من cNBM.
- نقل spheroids إلى 50 ميكرولتر من cNBM من لوحة بئر القاع الجولة إلى لوحة البئر 6.
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية وانتظر 30 دقيقة لspheroids على الالتزام.
- بعد 24 ساعة من الحضانة، وصمة عار مع 10 نانوغرام / مل من Hoechst واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- الحصول على الصور وتحليلها
- الحصول على الصور باستخدام مجهر الفيديو في برايتفيلد. ويستخدم ليزر 405 نانومتر لتصور تلطيخ Hoechst.
- استخدام برامج فيجي لتحليل الصور وتشغيل الماكرو كما هو مبين في الوثيقة التكميلية 1.
ملاحظة: لمس الجزء السفلي من البئر أو إزالة تماما الأضرار supernatant spheroids. للكولاجين نوع الأول معالجة هلام، والحفاظ على هلام على الجليد لتجنب البلمرة الكولاجين، لا تضيف مكون حمضي لأن التغيير في درجة الحموضة سوف تؤثر على ضغط هلام، وخلايا ماصة بسرعة في الكولاجين لمنع موت الخلية وتدهور الجل.
- اعداد
3- فيجي ماكرو
ملاحظة: فيجي هو برنامج تحليل الصور وضعت في المجال العام الذي يسمح لتطوير وحدات الماكرو لتسريع تحليل الصور. التحليل اليدوي ممكن أيضًا ، ولكن هذه عملية بطيئة وقد تدخل تحيزات. يمكن استيراد الصور عن طريق السحب والإفلات في البرنامج وقياسها كميًا باستخدام البرنامج المساعد أدوات مدير عائد الاستثمار. ويرد أدناه وصف للإجراء المستخدم في هذه الدراسة:
- فتح نافذة الماكرو: الإضافات | وحدات الماكرو | مترجم تفاعلي.
- نسخ ولصق الحلقة الأرجوانية المقتبسة التالية. الحفاظ على الجمل الأرجواني وإضافة الجمل الخضراء ذات الفائدة(وثيقة تكميلية 1).
- لتحليل السلسلة بأكملها، قم بضبط المعلمات باللون الأحمر للحصول على قياس كمي محدد وتشغيل الماكرو باستخدام وحدات الماكرو | تشغيل الماكرو أو الضغط على Ctrl +R.
- تحقق من المنطقة ذات الاهتمام وتكيفها يدويًا إذا لزم الأمر.
4. المجهر الإلكتروني من السفيرويدات
ملاحظة: يجب القيام بمعظم الخطوات التالية في غطاء محرك السيارة الكيميائي.
- خطوة التثبيت
- جمع spheroid مع قطع تلميح ماصة، ووضعها في أنبوب 1.5 مل، وغسل 1x مع 0.1 M الفوسفات المخزن المؤقت (PB).
- إصلاح كرويرويد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في 2٪ الجلوتالديهيد/2٪ paraformaldehyde (PFA) في 0.1 M PB.
- استبدال حل التثبيت مع حل 1٪ PFA في 0.1 M PB متبوعاً إعداد العينة.
- إعداد العينة
- نقل spheroids في مصفاة ووضعها في كوب زجاجي من أجل تجنب الضرر الكروي.
- غسل بعناية 3x مع 0.1 M PB.
- احتضان مع osmium لمدة 2 ساعة في الظلام. تمييع osmium إلى 4٪ في 1٪ 0.1 M PB المخزن المؤقت.
- غسل بعناية 3x مع 0.1 M PB.
- التجفيف على النحو التالي: نقع في الإيثانول 50٪ لمدة 10 دقيقة، 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة، 2x 90٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة، 2x 100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة، و 2x الأسيتون لمدة 30 دقيقة.
- احتضان العينات في خليط 50/50 من الأسيتون / الراتنج لمدة 2 ساعة. خلال هذه الخطوة، قم بإعداد راتنج EPON (تضمين-812: 11.25 غرام؛ DDSA: 9 ز; NMA: 4.5 غرام).
- تخلص من خليط الأسيتون/الراتنج، واستبدله بالراتنج المعد حديثاً ويحتضنه بين عشية وضحاها.
- استبدال الراتنج من قبل واحد جديد واحتضان بين 2-6 ساعة.
- إضافة السفيرويدات في الراتنج في قالب في 60 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إعداد Spheroids على النحو المبين في قسم البروتوكولات وأبديت ملاحظات بشأن الهجرة والغزو والانتشار والمجهر. لقياس نقص الأكسجة في مناطق متميزة من الهيكل الكروي ، تم استخدام تلطيخ الأنهيدراك الكاربوكسي التاسع لتحديد النشاط الناقص(الشكل 1A-C). ولوحظ تهيئة المزيد من الخلايا الإيجابية CAIX في مركز كرويويد(الشكل 1A-C). الخلايا hypoxic الموجودة في جوهر كرويرويد تميل إلى أن تكون أكثر غليكوليتيك من تلك المحيطة بها. يمكن تصوير الميتوكوندريا لمزيد من التحليلات كما هو موضح في المجهر الإلكتروني(الشكل 1Ba-1Bb). Spheroids تتألف من 2.5 × 103، 5 × 103، 104، أو 2 × 104 خلايا تحمل قطر كروي من حوالي 350 ، 400 ، 500 ، أو 650 ميكرومتر على التوالي (الشكل 2ألف). يمكن استخدام السفيرويدات في غضون 4 أيام بعد بدء التجربة(الشكل 2B). ويرد التقدير الكمي لكل قياس (أي الانتشار والغزو والهجرة) في الشكل 3. تم تطوير وحدات الماكرو فيجي لتحديد حجم الانتشار أو الغزو أو الهجرة(الشكل 3 والوثيقة التكميلية 1).
تعكس زيادة جوهر السفيرويد تحفيز انتشار الخلايا(الشكل 4A). على تثبيط من قبل rotenone, مثبط المنشأة من المعقدة I من سلسلة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا, تم اختراق الغالبية العظمى من إنتاج ATP في الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، انخفض الانتشار بنسبة 20٪ بعد 72 ساعة(الشكل 4A). غزو نوع الكولاجين الأول تم حسابه من خلال طرح المساحة الإجمالية من المساحة الأساسية. تعزيز العلاج الحمضي الغزو على مدى فترة 24 ساعة(الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، وجدنا أن علاج كلوريد الهيدروجين خفضت منطقة الهجرة من السفيرويدات بمقدار 1.5 مرة مقارنة بالتحكم(الشكل 4C). تمت دراسة ديناميات Spheroid من قبل تركيب للتصوير الحي في UniverSlide13. وكان Spheroids ديناميات داخلية عالية وانتقلت بسرعة(الفيلم 1 وتتبع التحليل في الشكل 4D).
الشكل 1: السبرويد هو نموذج ذي صلة لتقليد الأورام الصلبة. (أ)كرويويد كبنية ثلاثية الأبعاد مستديرة مع مناطق مختلفة. (أ)صورة برايتفيلد من كرويويد P3 يظهر مظهر مستدير مع منطقة مركزية كثيفة. مقياس = 100 ميكرون(ب)التمثيل التخطيطي المكيف من Hirschhaeuser وآخرون6 يظهر O2، CO2، المستقلب ، والتدرجات catabolite في spheroid. (ج)لوحة اليسار: صورة محورية لكرويويد ملطخة بـ DAPI (أزرق) ومع أجسام مضادة ضد أنهيدراشي ة الكربوكسيك التاسعة (الأخضر). اللوحة اليمنى: التحديد الكمي للفلورسينس من المنطقة المتقطعة. مقياس = 100 ميكرومتر (ب) صور المجهر الإلكترون مع الميتوكوندريا المحددة (خطوط متقطعة). وينظر الميتوكوندريا الكبيرة في منطقة الكويسcentarea في حين أنها أصغر في منطقة الانتشار. مقياس = 250 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خطوات إعداد السبرويد العام. (أ)جيل من سرطان الأرومية P3 البشرية spheroids. الصور التمثيلية موجودة على اللوحة اليسرى وتحليل الانتشار المقابل على اللوحة اليمنى. في 24 ساعة، شكلت الخلايا P3 spheroids كثيفة. العدد الأولي للخلايا تحديد حجم spheroids. شريط مقياس = 250 ميكرومتر .(ب)التوضيح التخطيطي للبروتوكولات السهلة لدراسة الانتشار أو الغزو أو الهجرة. Spheroids في ظل ظروف مختلفة:(أ)في وسط خالية من المصل لنمو الورم،(ب)في مصفوفة الكولاجين لتسهيل غزو الخلية الواحدة، و(ج)على طلاء Matrigel للهجرة الخلية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي للمقالات المختبرية مع برامج فيجي. تمثيل المناطق ذات الاهتمام (ROI) التي تم الحصول عليها باستخدام فيجي. يتم تمثيل المساحة الأساسية باللون الأحمر والمساحة الإجمالية ، والتي تحتوي على المساحة الأساسية ، باللون الأصفر. المنطقة الغازية يتوافق مع الطرح من المساحة الإجمالية من المساحة الأساسية. (أ)القول بالانتشار. (ب)غزو القول في هلام الكولاجين في عمليات الاستحواذ برايت فيلد. (C)نقل الهجرة على طلاء Matrigel عن طريق اكتساب الفلورسينس. كانت النوى ملطخة بالـ(ديبي) باللون الأزرق يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: جليوبلاستوما P3 spheroid في الانتشار، الغزو، أو مقالات الهجرة. (أ)القول بالانتشار. اللوحة اليسرى: صور تمثيلية مع DMSO كتحكم أو مع 20 ميكرومتر من الروتينون (مثبط سلسلة الجهاز التنفسي المعقدة I) في الوقت 0 أو 72 ساعة. اللوحة اليمنى: القياس الكمي لمنطقة Spheroid يمثل كخطوط متقطعة في الصور. مقياس = 250 ميكرون(ب)قياس الغزو في مصفوفة الكولاجين. اللوحة اليسرى: صور تمثيلية مع أو بدون كلوريد الهيدروجين 20 mM، في الوقت 0 أو 24 ساعة. اللوحة اليمنى: القياس الكمي للمناطق الغازية. مقياس = 100 ميكرومتر (ج) قياس الهجرة على طلاء Matrigel. اللوحة اليسرى: يتم تمثيل الصور التمثيلية في وضع brightfield في الوقت 0 أو 24 ساعة. يتم تمثيل المناطق المكبرة في اللوحات السفلية. اللوحة اليمنى: القياس الكمي لمناطق الهجرة. مقياس = 250 ميكرومتر . (D) Z - كومة تمثيل spheroid (40 ميكرومتر خطوة) في (أ)دينامية كرويويد تتبع أكثر من 18 ساعة (صورة مع 3 ح الفاصل الزمني) في (ب). الخلايا عبرت بطعن ة mCherry النووية (البرتقالي) وstoplasmic GFP (الأزرق). مقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1 : P3 spheroid الديناميكية سجلت أكثر من 18 ساعة (صورة كل 30 دقيقة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الفيلم يمثل مدمجة Z كومة مع مرور الوقت مع Z-خطوة من 5 ميكرومتر لحجم إجمالي تقريبي من 150 ميكرون. الخلايا كانت مصابة بفيروس lentivirus للتعبير عن NLS:mCherry (النوى البرتقالية) ومع GFP السيتوبلازمية (اللون الأزرق). يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).
الوثيقة التكميلية 1: فيجي الماكرو لتحليل الغزو والانتشار وهجرة السكويد ثلاثي الأبعاد. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تكييف المقالات السفية الورم بشكل جيد لدراسة خصائص الورم بما في ذلك الانتشار والغزو والهجرة ، فضلا عن موت الخلايا والاستجابة للمخدرات. تغزو الخلايا السرطانية المصفوفة ثلاثية الأبعاد التي تشكل ورمًا صغيرًا غازيًا ، كما رأينا في الشكل 4B, C. خلال العملية الغازية، مصفوفة metalloproteinases (MMP) مصفوفات هضم المحيطة الخلايا السرطانية13،ومثبطات MMP (على سبيل المثال، GM6001 أو Rebimastat) قد تضعف غزو الخلايا ولكن ليس الهجرة14. الهجرة والغزو تنطوي على تداخل ولكن منفصلة الأحداث الجزيئية15، والتي يمكن دراستها في ازنا سفيرويد لدينا. وللقيام بذلك، يمكن استهداف مسارات إشارة محددة إما على المستوى الوراثي أو من خلال تثبيط الأدوية.
ومن المعروف أن الأورام الأرومية الدبقي لغزو الأنسجة المحيطة على نطاق واسع من خلال عمليات مختلفة (على سبيل المثال، الخيار المشترك، الغزو المسالة البيضاء، الغزو الخلالي)16. وصفنا مؤخرا اثنين من آليات جديدة من غزو الأرومية الدبقي9،12،17. على وجه الخصوص، درسنا الجلطات الأمومية-1 (TSP1) وأظهرت أنها تشارك في غزو الخلايا السرطانية من خلال تفعيل CD47 في الخلايا السرطانية12. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام نهج بروتوميميك، اكتشفنا الدور غير المتوقع من PLP1 و DNM1 في غزو GBM17. في هذه الدراسات، تم استخدام مقالات الغزو ثلاثي الأبعاد بنجاح مع أو بدون عرقلة دوائية من TSP1 أو PLP1 أو DNM1. إلى جانب انسداد الدوائية، أظهرنا أيضا أن العلاج الحمضي مع كلوريد الهيدروجين يؤثر على الغزو في الفحص ثلاثي الأبعاد. ومن المعروف أن الحماض الورم ينشط عددا من مسارات الإشارات، بما في ذلك المسارات الأيضية (الغليكوليتس)، وعوامل النمو كما TGFα، ويمنع الاستجابة المناعية5.
توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد بيئة ذات صلة بفسيولوجية أكثر من الثقافات ثنائية الأبعاد ، وقد يتم تنظيم العديد من المعلمات الجزيئية والأيضية بشكل مختلف. وبالتالي، قد يكون للتعديل الدوائي تأثير مختلف. وبالتالي ، إلى جانب علم المناعة القياسي ، يمكن أيضًا دراسة الأحداث الأيضية في الثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام تحقيقات مثل 2-DG-IR. ولتأكيد هذه النتائج، يمكن أيضاً استخدام مثبط سلسلة نقل الإلكترونات I في هذا السياق.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد مناسب أيضًا لدراسة العمليات الديناميكية باستخدام التصوير المباشر في ظل الظروف القاعدية أو في وجود إشارات تحفيزية أو دوائية.
وينبغي النظر في الخطوات الحرجة التالية عند تنفيذ الإجراءات الموضحة في هذه المادة: 1) يجب ألا يتجاوز قطر السبرويد 400 ميكرومتر من أجل تجنب النخر؛ 2) يجب معايرة القياس الكمي للغزو باستخدام البرمجيات فيجي بعناية وتنفيذها على النحو المبين في الوصف التفصيلي للإجراء. 3) يجب أن يكون صلابة هلام مناسبة لعقد كرويويد في تكوين مستقر؛ 4) يجب التحكم في قيمة درجة الحموضة ، لأن درجة الحموضة الحمضية للغاية ستعوق عملية الغزو.
أحد قيود نظام السفيرويد الموصوف في هذه المقالة هو عدم وجود بيئة الورم الدقيقة الكاملة. ونحن نعترف بأن المصفوفة المستخدمة لا تمثل تماما ستروما وجدت في الورم الأرومي الدبقي. ومع ذلك ، الكولاجين هي جزء من مصفوفة الدماغ وأردنا تطوير فحص جاهز وسهل الاستخدام يمكن استخدامه في أي مختبر. ومع ذلك، قد تشمل التجارب المستقبلية أيضًا مكونات مصفوفة إضافية بالإضافة إلى عناصر خلوية، بما في ذلك الخلايا السترومية والمناعية. مستوى آخر من التعقيد هو إدراج مكونات الخلايا العصبية، ولكن يجب معايرة هذه التجارب بعناية وتصميمها.
في الختام، نعتقد أن نظامنا ثلاثي الأبعاد الكروي والأدوات التحليلية التي نقدمها في هذه المقالة قد تكون مفيدة للمحققين، خاصة في دراسة تطور ورم الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل ترانسكان 2017، ARC 2017، Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et la Charente-Maritime). جورس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
References
- Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
- Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
- Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
- Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
- Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
- Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
- de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
- Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).
