Summary
在这里,我们描述了一种容易使用的胶质细胞瘤入侵测定。这种测定适用于胶质母细胞瘤干细胞。还介绍了斐济宏,用于轻松量化入侵、移徙和扩散。
Abstract
二维(2D)细胞培养物在体内肿瘤生长不令人满意地模仿。因此,开发了三维(3D)培养球形模型。这些模型在神经肿瘤学领域可能特别重要。事实上,脑肿瘤有侵入健康大脑环境的倾向。我们在这里描述了一个理想的3D胶质母细胞瘤球体为基础的测定,我们开发研究肿瘤入侵。我们提供所有技术细节和分析工具,以成功执行此测定。
Introduction
在大多数使用原细胞系或商业上可用的细胞系的研究中,在塑料表面作为单层培养物生长的细胞上进行检测。在 2D 中管理单元格培养表示缺点,因为它不模仿体内 3D 细胞环境。在2D培养物中,整个细胞表面与介质直接接触,改变细胞生长,改变药物可用性。此外,非生理塑料表面触发细胞分化1。为克服这些困难,我们开发了三维文化模型。它们具有模仿肿瘤2的多细胞架构和异质性的优点,因此可被视为实体肿瘤3的更相关的模型。球类复杂的形态有助于更好地评价药物渗透和抗药性4。球体中的肿瘤异质性影响氧和营养的扩散,以及对药理剂的反应(图1A)。当球体尺寸达到300μm时,氧气的扩散会改变,在球体中心引起缺氧环境(图1A,C)。代谢物也较少穿透细胞层和补偿代谢反应发生5。当球形的直径增加时,可以观察到坏死核,进一步模仿许多固体癌症中发现的特征,包括恶性脑癌胶质细胞瘤(GBM)6。
文献77、88报道了胶质细胞瘤的几种2D或3D入侵测定。二维测定主要用于研究在薄矩阵层或博伊登腔室测定9中水平平面上的入侵。三维检测用经典的胶质细胞系10来描述3D球形培养。更复杂的变异表现为对抗培养中肿瘤球类对脑器官的入侵11。然而,开发一种易于利用和可重复的检测对于任何实验室都仍然很重要。我们开发了一种协议,从患者样本中产生胶质细胞瘤干细胞样细胞。这些检测的量化易于管理,只需要开放访问的在线软件。简单地说,肿瘤片被切成小块,酶消化。从消化中提取的单细胞在神经基础培养基中培养。4-7天后,球形结构自发形成。在小鼠模型中植入颅内后,它们形成肿瘤,表现出一个被伪细胞包围的坏死核12。这与 GBM 患者的特征非常相似。
在本文中,我们描述了我们根据确定数量的细胞生产球体以确保可重复性的协议。两种补充基质可用于此目的:母质和胶原蛋白 I 型,Matrigel 富含生长因子,并模仿细胞连接和迁移所需的哺乳动物基膜。另一方面,胶原蛋白I型,一种基质的结构元素,是最常见的纤维外细胞基质,用于细胞入侵测定。在这里,我们通过执行迁移和增殖测定来说明我们的 GBM 球形模型。分析不仅在固定的时间点进行,而且通过实时成像监测球体扩张和细胞运动。此外,还进行了电子显微镜的可视化形态细节。
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Protocol
所有患者均获得书面同意(根据当地道德委员会的规定,从挪威卑尔根的豪克兰医院获得)。我们的协议遵循我们机构人类研究伦理委员会的准则。
1. 生成均匀大小的肿瘤球体
注:干细胞在神经基础培养中培养,补充B27补充剂、肝素、FGF-2、青霉素和链霉素,如前文第12条所述。这些细胞在培养中自发地形成球体。
- 用5 mL磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗肿瘤细胞,并在 37°C 下用 0.5-1 mL 分离酶(参见材料表)孵育细胞 5 分钟。
- 用4-4.5 mL PBS清洗,并添加10 mL的完整生长介质(完整的神经基础介质,cNBM)。
- 使用带锥盘蓝色和细胞计数室幻灯片的自动计数技术对单元格进行计数。
- 要生成 100 个球类,每个球体有 104个细胞(根据首选尺寸),在 NBM 的 8 mL 中混合 10个 6个细胞,将 2 mL 的 2% 甲基纤维素混合。
- 将悬浮液转移到无菌系统容器,用多通道移液器将 100 μL/井分配到 96 井圆形底板上。
- 在37°C、5%CO2和 95% 湿度下孵育板。大小相等的球体将形成,可在3-4天后使用。
2. 三维实验
- 增殖
- 制备
- 悬浮抑制剂(例如,如图4A所示的罗酮)和100 μL介质中的化学物质,并添加到每口井中100μL的介质中(即每口井一个球体)。
- 在37°C、5%CO2和95%湿度下孵育板。
- 图像采集和分析
- 在明亮场使用视频显微镜拍照,在 T0和以下时间创建一系列条件。
- 使用斐济手动或半自动方式分析图片。要手动执行此操作,使用徒手选择工具在球形核心周围绘制一个圆圈,并测量每个球形的面积。要以半自动方式分析图像,请使用补充文档 1中显示的仅 //核心区域的宏。
- 制备
- 入侵
- 制备
- 以1mg/mL最终浓度、1倍PBS、0.023xV胶原蛋白、1 M氢氧化钠和无菌H2O.将溶液孵育在冰上30分钟,在冰管中制备胶原蛋白基质。I型胶原蛋白最终浓度为1mg/mL。
- 从 500 μL 管中的圆底孔板收集球体,用 200 μL 1x PBS 洗涤 2 倍。
- 将球体小心地移入胶原蛋白基质的100μL中,并插入正常96孔板中的井中心。
- 在37°C下孵化胶原蛋白凝胶30分钟,然后在凝胶顶部加入cNBM。在此步骤中,可以将抑制剂或活化剂(例如,如图 4B、4C所示的氯化氢)添加到介质中。
- 图像采集和分析
- 胶原蛋白加入后24小时使用明场模式的视频显微镜依次拍照。
- 使用斐济手动或半自动方式分析图片。要手动执行此操作,使用徒手选择工具围绕球形的球芯和球形总面积绘制,并通过减去核心区域的总面积来测量每个球形的侵入面积。要以半自动方式分析图像,请使用补充文档 1中所示的宏来确定入侵区域。
- 制备
- 迁移
- 制备
- 在 37 °C 下,在 NBM 中涂覆 6 孔板(0.2 毫克/mL),30 分钟,然后取出母体,加入 2 mL 的 cNBM。
- 将球体从圆底孔板转移到6孔板的50μLcNBM中。
- 在37°C下孵育板,等待30分钟,让球体粘附。
- 孵育24小时后,用10纳克/mL的Hoechst染色,并在37°C孵育30分钟。
- 图像采集和分析
- 在明亮场使用视频显微镜获取图像。405 nm 激光用于可视化 Hoechst 染色。
- 使用斐济软件分析图片并运行补充文档 1中所示的宏。
注:触摸井底或完全去除上清液会损害球体。对于胶原蛋白I型凝胶的处理,保持凝胶在冰上,以避免胶原蛋白聚合,不要添加酸性成分,因为pH值的变化会影响凝胶的紧凑性,并移液细胞迅速进入胶原蛋白,以防止细胞死亡和凝胶降解。
- 制备
3. 斐济宏
注:斐济是在公共领域开发的图像分析程序,它允许宏的开发以加快图像分析。手动分析也是可能的,但这是一个缓慢的过程,可能会引入偏差。图像可以通过软件中的拖放导入,并通过 ROI 管理器工具插件进行量化。本研究中使用的过程如下:
- 打开宏窗口:插件 |宏 |交互式口译员。
- 复制并粘贴以下经过调整的紫色循环。保留紫色句子并添加感兴趣的绿色句子(补充文件 1)。
- 要分析整个系列,请调整特定定量的红色参数,并使用宏运行宏 |运行宏或按Ctrl_R。
- 检查并在必要时手动调整感兴趣的区域 (ROI)。
4. 球形电子显微镜
注:以下步骤中的大多数必须在化学罩中完成。
- 固定步骤
- 用切割移液器尖端收集球体,将其放入 1.5 mL 管中,用 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (PB) 洗涤 1x。
- 在 0.1 M PB 中将球体在 4°C 下固定在 2% 谷醛/2% 的甲醛 (PFA) 中过夜。
- 在 0.1 M PB 中用 1% PFA 的解决方案替换固定解决方案,然后进行样品制备。
- 样品制备
- 将球形转移到滤网中,放入玻璃杯中,以避免球体损坏。
- 用 0.1 M PB 小心洗涤 3 倍。
- 在黑暗中孵育2小时。在 1% 0.1 M PB 缓冲液中稀释至 4%。
- 用 0.1 M PB 小心洗涤 3 倍。
- 脱水如下:浸泡在50%乙醇10分钟,70%乙醇10分钟,2x90%乙醇15分钟,2x100%乙醇20分钟,2x丙酮30分钟。
- 将样品孵育在50/50混合物中的丙酮/树脂2小时。在此步骤中,制备 EPON 树脂(嵌入-812:11.25 g;DDSA: 9 g;NMA: 4.5 g)。
- 丢弃丙酮/树脂混合物,用新鲜准备的树脂代替,孵育过夜。
- 用新的树脂代替树脂,孵育2-6小时。
- 将树脂中的球体加入 60°C 的模具中,温度为 48-72 小时。
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Representative Results
如协议部分所述,编制了球类,并就迁移、入侵、扩散和显微镜进行了观测。为了测量球形结构不同区域的缺氧,用车盒性水合酶IX染色来确定缺氧活性(图1A-C)。在球形中心观察到更多的CAIX阳性细胞(图1A-C)。位于球状核中的缺氧细胞往往比周围的细胞更甘油。线粒体可以成像,以便进一步分析,如电子显微镜所示(图1Ba-1Bb)。由2.5 x 103、5x 103、104或2 x 104 4细胞组成的球形体直径分别为约350、400、500或650μm(图2A)。球形可在开始实验后4天内使用(图2B)。图3显示了每种测定的量化(即扩散、入侵、迁移)。斐济宏是为了量化扩散、入侵或移徙而开发的(图3和补充文件1)。
球形核的增加反映了细胞增殖的刺激(图4A)。在线粒体呼吸链复合I的既定抑制剂罗泰诺抑制后,线粒体中绝大多数ATP生产都受到损害。因此,在72小时后,增殖减少了20%(图4A)。胶原蛋白I型的入侵是通过从核心区域减去总面积来计算的。酸性处理在24小时期间加强了入侵(图4B)。此外,我们发现氯化氢处理比对照减少球体迁移面积1.5倍(图4C)。在UniverSlide13中安装实时成像来研究球体动力学。球形具有较高的内部动力学,移动迅速(图4D中的影片1和跟踪分析)。
图1:球形是模拟实体肿瘤的相关模型。(A) 球形作为具有不同区域的圆形 3D 结构。(a) P3 球形的明亮场图显示了具有密集中心区域的圆形外观。比例 = 100 μm.(b) 从 Hirschhaeuser 等人6改编的原理图表示显示球形中的 O2、CO2、代谢物和催化物梯度。(c) 左面板:沾有DAPI(蓝色)的球形和针对碳水化合物水合酶的抗体的共聚焦图片(绿色)。右面板:从破折号区域对荧光进行定量。刻度 = 100 μm. (B) 电子显微镜图像与划定的线粒体(虚线)。大型线粒体在静物区看到,而在增殖区较小。刻度 = 250 nm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2:总体球形制备步骤。(A) 人类 P3 胶质母细胞瘤球类的一代.代表图像位于左侧面板上,右侧面板上有相应的扩散分析。在24小时,P3细胞形成密集的球体。初始细胞数决定了球体的大小。比例尺 = 250 μm. (B) 用于研究扩散、入侵或迁移的简易协议的原理图图。在各种条件下的球样: (a) 在无血清介质中肿瘤生长, (b) 在胶原蛋白基质中促进单细胞入侵, 和 (c) 用于细胞迁移的母质涂层。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3:使用斐济软件进行体外测定的量化。代表使用斐济获得的感兴趣区域 (ROI)。核心区域以红色表示,总面积(包含核心区域)以黄色表示。入侵区域对应于核心区域总面积的减法。(A) 扩散测定。(B) 在光明场收购胶原蛋白凝胶中的入侵测定。(C) 通过荧光采集对母胶涂层进行迁移测定。核被DAPI染成蓝色。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4:胶质母细胞瘤P3球体在增殖、入侵或迁移测定中。(A) 扩散测定。左面板:代表图片与DMSO作为控制或20μM的罗酮(呼吸链复合I抑制剂)在时间0或72小时。右面板:图像中表示为虚线的球形区域量化。胶原蛋白基质中的量表 = 250 μm. (B) 入侵测定。左面板:代表图片与或不含20mM氯化氢,时间0或24小时。右面板:入侵区域的量化。刻度 = 100 μm. (C) 在母体涂层上的迁移测定。左面板:在 0 或 24 小时时,在明亮场模式下的代表性图像。放大区域表示在底部面板中。右面板:移民区的量化。刻度 = 250 μm. (D) 球形的 Z 堆栈表示 ( 40 μm 步数) 在 (a) 球形动态跟踪超过 18 h (图像与 3 小时间隔) 在 (b).细胞稳稳地表示核mCherry(橙色)和细胞质GFP(蓝色)。比例 = 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
电影 1: P3 球形动态记录超过 18 小时 (图像每 30 分钟)。刻度柱 = 100 μm。影片代表一个合并的Z堆栈,Z步长为5μm,总体积约为150μm。 细胞被感染扁病毒以表达NLS:mCherry(核是橙色)和细胞质GFP(蓝色)。请点击此处查看此文件(右键单击以下载)。
补充文件1:斐济宏观分析入侵,扩散和迁移的3D球体。请点击此处查看此文件(右键单击以下载)。
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Discussion
肿瘤球体测定非常适合研究肿瘤特征,包括增殖、入侵和迁移,以及细胞死亡和药物反应。癌细胞侵入形成侵入性微肿瘤的3D基质,如图4B,C所示。在入侵过程中,基质金属蛋白酶(MMP)消化肿瘤细胞13周围的基质,MMP抑制剂(例如GM6001或Rebimastat)可能损害细胞入侵,但不能迁移14。迁移和入侵涉及重叠但独立的分子事件15,可以在我们的球体测定中研究。为此,特定的信号通路可以针对遗传水平或通过药理抑制。
据了解,胶质细胞瘤通过不同的过程(例如,共同选择,白质道入侵,间质入侵)广泛侵入周围的组织。我们最近描述了胶质细胞瘤入侵的两种新机制9,9,12,17。,17特别是,我们研究了母细胞血栓-1(TSP1),并表明它通过激活肿瘤细胞12中的CD47而参与肿瘤细胞入侵。此外,使用蛋白酶,我们发现了PLP1和DNM1在GBM入侵17中的意外作用。在这些研究中,3D入侵测定被成功用于或没有TSP1、PLP1或DNM1的药理障碍。除了药理障碍外,我们还表明氯化氢的酸处理会影响3D测定中的入侵。众所周知,肿瘤酸中毒激活了许多信号通路,包括代谢途径(糖解),生长因子为TGF+,并抑制免疫反应5。
与二维培养物相比,三维培养提供了更具有生理相关性的环境,许多分子和代谢参数可能受到不同的调节。因此,药理调制可能具有不同的影响。因此,除了标准免疫活动学外,还可以使用2-DG-IR等探针在3D培养中研究代谢事件。为了证实这些发现,电子传输链复合I抑制剂也可用于此上下文。
此外,3D 培养系统还非常适合在基础条件下或在有刺激或药理线索的情况下使用实时成像的动态过程的研究。
执行本文所述程序时应考虑以下关键步骤:1) 球形直径不应超过 400 μm,以避免坏死;2) 使用斐济软件对入侵的量化必须仔细校准,并如程序详细说明所示执行;3) 凝胶刚度必须适合将球体稳定配置;4) pH值必须控制,因为酸性pH值会阻碍入侵过程。
本文描述的球形系统的一个局限性是缺乏完整的肿瘤微环境。我们承认所使用的基质不能完全代表胶质细胞瘤中的频闪。然而,胶原蛋白是大脑基质的一部分,我们希望开发一种现成的、易于使用的测定法,可用于任何实验室。然而,未来的实验可能还包括额外的基质成分以及细胞元素,包括基质和免疫细胞。另一个复杂程度是神经元成分的包含,但这些实验必须仔细校准和设计。
最后,我们认为我们的球形3D系统以及我们在本文中提供的分析工具可能对研究者有用,特别是在研究脑肿瘤发育方面。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的财务利益。
Acknowledgments
这项工作得到了Transcan 2017,ARC 2017,癌症联盟(吉龙德和查伦特-海洋委员会)的支持。约里斯·古扬是图卢兹大学医院(CHU图卢兹)奖学金的获得者。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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