Summary
Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.
Abstract
Tweedimensionale (2D) celculturen bootsen in vivo tumorgroei niet naar tevredenheid na. Daarom werden driedimensionale (3D) cultuursferoïde modellen ontwikkeld. Deze modellen kunnen bijzonder belangrijk zijn op het gebied van neuro-oncologie. Inderdaad, hersentumoren hebben de neiging om de gezonde hersenomgeving binnen te dringen. We beschrijven hierin een ideale 3D glioblastoom sferoïde-gebaseerde test die we ontwikkelden om tumorinvasie te bestuderen. Wij bieden alle technische details en analytische tools om deze test succesvol uit te voeren.
Introduction
In de meeste studies met behulp van primaire of commercieel beschikbare cellijnen, tests worden uitgevoerd op cellen geteeld op plastic oppervlakken als monolayer culturen. Het beheren van celcultuur in 2D betekent nadelen, omdat het geen in vivo 3D-celomgeving nabootst. In 2D-culturen is het hele celoppervlak direct in contact met het medium, waardoor de celgroei verandert en de beschikbaarheid van geneesmiddelen wordt gewijzigd. Bovendien activeert het niet-fysiologische kunststofoppervlak celdifferentiatie1. Driedimensionale cultuurmodellen zijn ontwikkeld om deze moeilijkheden te overwinnen. Ze hebben het voordeel van het nabootsen van de meercellige architectuur en heterogeniteit van tumoren2, en dus kan worden beschouwd als een meer relevant model voor vaste tumoren3. De complexe morfologie van sferoïden draagt bij aan een betere evaluatie van medicijnpenetrantie en resistentie4. De tumor heterogeniteit in de sferoïde beïnvloedt de verspreiding van zuurstof en voedingsstoffen, en de reactie op farmacologische middelen (Figuur 1A). Verspreiding van zuurstof wordt gewijzigd wanneer de sferoïde grootte 300 μm bereikt, wat leidt tot een hypoxische omgeving in het midden van de sferoïde (Figuur 1A, C). Metabolieten zijn ook minder penetrerendoor de cellagen en compenserende metabole reacties vinden plaats5. Wanneer de diameter van de sferoïde toeneemt, kunnen necrotische kernen worden waargenomen, waardoor verdere nabootsing van kenmerken die bij veel vaste vormen van kanker worden gevonden, waaronder het agressieve hersenkankerglioblastoom (GBM)6.
Verschillende 2D of 3D invasie testen voor glioblastoom zijn gemeld in de literatuur7,8. Tweedimensionale testen zijn voornamelijk voor het bestuderen van invasie in een horizontaal vlak op een dunne matrixlaag of in een Boyden kamer test9. Driedimensionale tests zijn beschreven met 3D sferoïde culturen met behulp van klassieke glioblastoom cellijnen10. Meer complexe varianten worden vertegenwoordigd door invasie van hersenorganoïden door tumorsferoïden in confrontatieculturen11. Het is echter nog steeds belangrijk om een gebruiksvriendelijke en reproduceerbare test te ontwikkelen die voor elk laboratorium beschikbaar is. We hebben een protocol ontwikkeld om glioblastoom stamcellen-achtige cellen te genereren uit patiëntmonsters. De kwantificering van deze tests is gemakkelijk beheersbaar en vereist alleen open-access online software. Kortom, tumorstukjes worden in kleine stukjes gesneden en enzymatisch verteerd. Enkele cellen afkomstig van de spijsvertering worden gekweekt in neurobasaal medium. Na 4-7 dagen vormen sferoïde structuren zich spontaan. Bij intracraniale implantatie in muizenmodellen vormen ze tumoren die een necrotische kern vertonen die wordt omringd door pseudo-palisadecellen12. Dit lijkt sterk op de kenmerken van GBM-patiënten.
In dit artikel beschrijven we ons protocol om sferoïden te produceren uit een bepaald aantal cellen om reproduceerbaarheid te garanderen. Hiervoor kunnen twee complementaire matrices worden gebruikt: Matrigel en collageen type I. Matrigel is verrijkt met groeifactoren en bootst het basale basale membraan van zoogdieren na dat nodig is voor celhechting en migratie. Aan de andere kant, collageen type I, een structureel element van stroma, is de meest voorkomende fibrillaire extracellulaire matrix en wordt gebruikt in cel invasie testen. Hierin illustreren we ons GBM sferoïde model door migratie- en proliferatietesten uit te voeren. Analyse werd niet alleen gedaan op vaste tijdpunten, maar ook door het monitoren van sferoïde expansie en celbeweging door live beeldvorming. Bovendien werd elektronenmicroscopie gedaan om morfologische details te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten (van het Haukeland Ziekenhuis, Bergen, Noorwegen volgens de lokale ethische commissie regelgeving). Ons protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek van onze instelling.
1. Generatie van uniforme grootte tumor sferoïden
OPMERKING: Stam-achtige cellen worden gekweekt in neurobasaal medium aangevuld met B27 supplement, heparine, FGF-2, penicilline, en streptomycine, zoals beschreven in eerdere artikelen12. Deze cellen vormen spontaan sferoïden in de cultuur.
- Was de tumorcellen met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer de cellen met 0,5-1 mL dissociatieenzym (zie Tabel van materialen)gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Was met 4-4,5 mL PBS en voeg 10 mL van het volledige groeimedium toe (compleet neurobasaal medium, cNBM).
- Tel de cellen met behulp van een automatische teltechniek met trypan blauw en een cel tellen kamer dia.
- Voor het genereren van 100 sferoïden met 104 cellen per sferoïde (volgens de gewenste grootte), meng 106 cellen in 8 mL NBM met 2 mL van 2% methylcellulose.
- Breng de suspensie over in een steriele systeemcontainer en doseer 100 μL/well met een meerkanaals pipet in een 96-putronde bodemplaat.
- De plaat uitbroeden bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Gelijke grootte sferoïden zal vormen en kan worden gebruikt na 3-4 dagen.
2. Driedimensionale experimenten
- Proliferatie
- Voorbereiding
- Hang remmers (bijvoorbeeld rotenone zoals in figuur 4A)en chemicaliën in 100 μL medium en voeg toe aan de 100 μL medium in elke put (dat wil zeggen, een sferoïde per put).
- Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2en 95% luchtvochtigheid.
- Beeldverwerving en -analyse
- Maak foto's met een videomicroscoop in brightfield om een reeks voorwaarden te creëren bij T0 en de volgende verwachte tijden.
- Gebruik Fiji om foto's handmatig of op een semigeautomatiseerde manier te analyseren. Om dit handmatig te doen, tekent u een cirkel rond de sferoïde kern met het keuzegereedschap uit de vrije hand en meet u het gebied van elke sferoïde. Als u de afbeeldingen op een semigeautomatiseerde manier wilt analyseren, gebruikt u de macro die wordt weergegeven in Aanvullend document 1 met alleen het kerngebied.
- Voorbereiding
- Invasie
- Voorbereiding
- Bereid de collageenmatrix in een buis op ijs met collageen van type I bij 1 mg/mL eindconcentratie, 1x PBS, 0,023xVcollageen,1 M natriumhydroxide en steriele H2O. Incubeer de oplossing op ijs gedurende 30 min.
- Verzamel sferoïden van de ronde bodemputplaat in 500 μL buizen en was 2x met 200 μL 1x PBS.
- Pipetteer de sferoïden voorzichtig in 100 μL van de collageenmatrix en steek in het midden van een put in normale 96 putplaten.
- Incubeer de collageengel gedurende 30 min bij 37 °C en voeg vervolgens cNBM bovenop de gel toe. Remmers of activators (bijvoorbeeld waterstofchloride zoals aangegeven in figuur 4B, 4C)kunnen in deze stap aan het medium worden toegevoegd.
- Beeldverwerving en -analyse
- Neem foto's sequentieel met een videomicroscoop in brightfield-modus 24 uur na collageenopname.
- Gebruik Fiji om foto's handmatig of op een semigeautomatiseerde manier te analyseren. Om dit handmatig te doen, teken je rond de kern en het totale gebied van de sferoïde met het keuzegereedschap uit de vrije hand en meet je het invasieve gebied van elke sferoïde door het totale gebied met kerngebied af te trekken. Als u de beelden op een semigeautomatiseerde manier wilt analyseren, gebruikt u de macro zoals aangegeven in Aanvullend Document 1 om het invasieve gebied te bepalen.
- Voorbereiding
- Migratie
- Voorbereiding
- Coat een 6 putplaat met Matrigel (0,2 mg/mL) in NBM gedurende 30 min bij 37 °C, verwijder vervolgens de Matrigel en voeg 2 mL cNBM toe.
- Breng sferoïden over in 50 μL cNBM van de ronde bodemputplaat naar de 6 putplaat.
- Incubeer de plaat bij 37 °C en wacht 30 min tot de sferoïden zich hechten.
- Na 24 uur incubatie, vlek met 10 ng/mL van Hoechst en 30 min incuberen bij 37 °C.
- Beeldverwerving en -analyse
- Verkrijgen van beelden met behulp van een video microscoop in brightfield. Een 405 nm laser wordt gebruikt voor visualisatie van Hoechst kleuring.
- Gebruik Fiji-software om foto's te analyseren en de macro uit te voeren zoals aangegeven in aanvullend document 1.
LET OP: Het aanraken van de onderkant van de put of het volledig verwijderen van de supernatant beschadigt de sferoïden. Voor collageen type I gel behandeling, houd de gel op ijs om collageen polymerisatie te voorkomen, voeg geen zure component, omdat de verandering in de pH zal invloed hebben op de compactheid van de gel, en pipet cellen snel in het collageen om celdood en de afbraak van de gel te voorkomen.
- Voorbereiding
3. Fiji Macro
OPMERKING: Fiji is een beeldanalyseprogramma ontwikkeld in het publieke domein waarmee de ontwikkeling van macro's de beeldanalyse kan versnellen. Handmatige analyse is ook mogelijk, maar dit is een langzaam proces en kan vooroordelen introduceren. Afbeeldingen kunnen worden geïmporteerd door drag-and-drop in de software en gekwantificeerd met de ROI Manager Tools-plug-in. De procedure die in deze studie wordt gebruikt, wordt hieronder beschreven:
- Het macrovenster openen: Plug-ins | Macro's | Interactieve tolk.
- Kopieer en plak de volgende aangepaste paarse lus. Houd de paarse zinnen en voeg de groene zinnen van belang (Aanvullend Document 1).
- Als u de hele reeks wilt analyseren, past u de parameters in het rood aan voor een specifieke kwantificering en voert u de macro uit met macro's | Voer Macro uit of druk op Ctrl+R.
- Controleer en pas indien nodig handmatig de regio van belang (ROI) aan.
4. Elektronenmicroscopie van sferoïden
LET OP: De meeste van de volgende stappen moeten worden gedaan in een chemische kap.
- Fixatiestap
- Verzamel de sferoïde met een gesneden pipettip, doe het in een buis van 1,5 mL en was 1x met 0,1 M fosfaatbuffer (PB).
- Fix the sferoid overnight at 4 °C in 2% glutaraldehyde/2% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M PB.
- Vervang de fixatieoplossing door een oplossing van 1% PFA in 0,1 M PB, gevolgd door monstervoorbereiding.
- Bereiding van het monster
- Breng de sferoïden in een zeef en leg ze in een glazen beker om sferoïde schade te voorkomen.
- Zorgvuldig 3x wassen met 0.1 M PB.
- Incubeer met osmium voor 2 uur in het donker. Verdun osmium tot 4% in 1% 0,1 M PB buffer.
- Zorgvuldig 3x wassen met 0.1 M PB.
- Dehydrateer als volgt: weken in 50% ethanol gedurende 10 min, 70% ethanol voor 10 min, 2x 90% ethanol voor 15 min, 2x 100% ethanol voor 20 min, en 2x aceton voor 30 min.
- Incubeer de monsters in een 50/50 mengsel van aceton/hars gedurende 2 uur. Bereid tijdens deze stap de EPON-hars voor (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
- Gooi het aceton/harsmengsel weg, vervang de vers bereide hars en incubeer 's nachts.
- Vervang de hars door een nieuwe en incubeer tussen 2-6 uur.
- Voeg de sferoïden in hars in een mal bij 60 °C voor 48-72 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sferoïden werden voorbereid zoals beschreven in de protocollen sectie en waarnemingen werden gedaan met betrekking tot migratie, invasie, proliferatie, en microscopie. Om hypoxie in verschillende gebieden van de bolvormige structuur te meten, werd carboxische anhydrase IX-kleuring gebruikt voor het bepalen van hypoxische activiteit(figuur 1A-C). Meer CAIX-positieve cellen werden waargenomen in het sferoïde centrum (Figuur 1A-C). Hypoxische cellen in de sferoïde kern hebben de neiging om meer glycolytic dan de omliggende. Mitochondriën kunnen worden afgebeeld voor verdere analyses zoals blijkt uit elektronenmicroscopie (Figuur 1Ba-1Bb). Sferoïden bestaande uit respectievelijk 2,5 x 103, 5 x 103, 104of 2 x 104 cellen vertonen een sferoïde diameter van respectievelijk ongeveer 350, 400, 500 of 650 μm (figuur 2A). Sferoïden kunnen binnen 4 dagen na aanvang van het experiment worden gebruikt (figuur 2B). De kwantificering van elke test (d.w.z. proliferatie, invasie, migratie) wordt weergegeven in figuur 3. Fiji-macro's werden ontwikkeld om proliferatie, invasie of migratie te kwantificeren(figuur 3 en aanvullend document 1).
De toename van de sferoïde kern weerspiegelde de stimulatie van celproliferatie (figuur 4A). Na remming door rotenon, een gevestigde remmer van complex I van de mitochondriale ademhalingsketen, werd de overgrote meerderheid van de ATP-productie in de mitochondriën aangetast. Als gevolg hiervan werd de proliferatie na 72 uur(figuur 4A)met 20% verminderd. Invasie van collageen type I werd berekend door de aftrekking van het totale gebied van het kerngebied. Zure behandeling verbeterde invasie over een periode van 24 uur (Figuur 4B). Bovendien stelden we vast dat de behandeling van waterstofchloride het migratiegebied van de sferoïden met 1,5 keer heeft verminderd ten opzichte van de controle (figuur 4C). Sferoid dynamica werd bestudeerd door montage voor live imaging in de UniverSlide13. Sferoïden had een hoge interne dynamiek en verhuisde snel(Film 1 en tracking analyse in figuur 4D).
Figuur 1: De sferoïde is een relevant model om vaste tumoren na te bootsen. (A) Spheroid als een ronde 3D-structuur met verschillende gebieden. (a) Een brightfield foto van een P3 sferoid toont een ronde verschijning met een dicht centraal gebied. Schaal = 100 μm.b) Schematische representatie aangepast van Hirschhaeuser et al.6 toont de O2,CO2,metaboliet en katabolietgradiënten in de sferoïde. c) Linkerpaneel: confocale afbeelding van een sferoïde gekleurd met DAPI (blauw) en met antilichamen tegen carboxische anhydrase IX (groen). Rechterpaneel: kwantificering van de fluorescentie uit het stippelgebied. Schaal = 100 μm. (B) Elektronenmicroscopiebeelden met afgebakende mitochondriën (stippellijnen). Grote mitochondriën worden gezien in het rustige gebied, terwijl ze kleiner zijn in het proliferatiegebied. Schaal = 250 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Algemene sferoïde voorbereidingsstappen. (A) Generatie van menselijke P3 glioblastoom sheroïden. Representatieve afbeeldingen staan op het linkerpaneel en de bijbehorende proliferatieanalyse op het rechterpaneel. Om 24 uur vormden de P3 cellen dichte sferoïden. Het initiële aantal cellen bepaalde de grootte van de sferoïden. Schaalbalk = 250 μm. (B) Schematische illustratie van de eenvoudige protocollen voor het bestuderen van proliferatie, invasie of migratie. Spheroïden onder verschillende omstandigheden:a) In serumvrij medium voor tumorgroei,b) In collageenmatrix voor het vergemakkelijken van eencellige invasie, en (c) Op Matrigel coating voor celmigratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van in vitro tests met Fiji-software. Vertegenwoordiging van de regio's van belang (ROI) verkregen met behulp van Fiji. Het kerngebied wordt vertegenwoordigd in rood en het totale gebied, dat het kerngebied, in geel bevat. Het invasieve gebied komt overeen met de aftrekking van het totale gebied van het kerngebied. (A) Proliferatie test. (B) Invasie test in collageen gel in brightfield overnames. (C) Migratietest op Matrigel-coating door overname van fluorescentie. Kernen werden bevlekt met DAPI, in het blauw. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Glioblastoom P3 sferoïde bij proliferatie, invasie of migratietesten. (A) Proliferatie test. Linkerpaneel: Representatieve foto's met DMSO als controle of met 20 μM rotenone (ademhalingsketencomplex I-remmer) op tijd 0 of 72 uur. Rechterpaneel: Spheroid gebied kwantificering weergegeven als stippellijnen in de beelden. Schaal = 250 μm. (B) Invasietest in collageenmatrix. Linkerpaneel: Representatieve foto's met of zonder 20 mM waterstofchloride, op tijdstip 0 of 24 uur. Rechterpaneel: Kwantificering van invasieve gebieden. Schaal = 100 μm. (C) Migratietest op Matrigel-coating. Linkerpaneel: Representatieve afbeeldingen in de brightfield-modus op tijdstip 0 of 24 uur. Vergrote gebieden worden weergegeven in de onderste panelen. Rechterpanel: Kwantificering van migratiegebieden. Schaal = 250 μm. (D) Z-stack representatie van de sferoïde (40 μm stap) in (a) sferoïde dynamische bijgehouden meer dan 18 uur (afbeelding met 3 uur interval) in (b). Cellen stabiel uitgedrukt nucleaire mCherry (oranje) en cytoplasmale GFP (blauw). Schaal = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: P3 sferoid dynamic opgenomen meer dan 18 uur (afgebeeld om de 30 min). Schaalbalk = 100 μm. De film vertegenwoordigt een samengevoegde Z-stack in de loop van de tijd met een Z-stap van 5 μm voor een geschatte totale volume van 150 μm. Cellen werden besmet met lentivirus om NLS:mCherry uit te drukken (kernen zijn oranje) en met cytoplasmamgfp (blauwe kleur). Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend document 1: Fiji macro voor het analyseren van invasie, proliferatie, en migratie van 3D sferoid. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor sferoïde testen zijn goed aangepast aan tumor kenmerken met inbegrip van proliferatie, invasie, en migratie, evenals celdood en drug reactie te bestuderen. Kankercellen dringen de 3D-matrix de vorming van een invasieve microtumor, zoals te zien in figuur 4B, C. Tijdens het invasieve proces kunnen matrix metalloproteinasen (MMP) matrices rondom tumorcellen13verteren , en MMP-remmers (bijvoorbeeld GM6001 of Rebimastat) de celinvasie schaden, maar niet migratie14. Migratie en invasie te betrekken overlappende maar afzonderlijke moleculaire gebeurtenissen15, die kunnen worden bestudeerd in onze sferoïde test. Om dit te doen, kunnen specifieke signaleringstrajecten worden gericht op genetisch niveau of door farmacologische remming.
Glioblastomen staan erom bekend dat ze de omliggende weefsels uitgebreid binnendringen door verschillende processen (bijvoorbeeld co-optie, invasie van witte stoffen, interstitiële invasie)16. We beschreven onlangs twee nieuwe mechanismen van glioblastoom invasie9,12,17. In het bijzonder bestudeerden we matricellulaire trombose-1 (TSP1) en toonden we aan dat het betrokken is bij tumorcelinvasie door de activering van CD47 in tumorcellen12. Bovendien, met behulp van een proteomische benadering, ontdekten we de onverwachte rol van PLP1 en DNM1 in GBM invasie17. In deze studies werden 3D-invasietesten met succes gebruikt met of zonder farmacologische obstructie van TSP1, PLP1 of DNM1. Naast farmacologische obstructie, toonden we ook aan dat zure behandeling met waterstofchloride de invasie in de 3D-test beïnvloedt. Het is bekend dat tumoracidose een aantal signaleringstrajecten activeert, waaronder metabole trajecten (glycolyse), groeifactoren als TGFβ, en deimmuunrespons5 remt.
Driedimensionale culturen bieden een meer fysiologische relevante omgeving dan 2D-culturen, en veel moleculaire en metabole parameters kunnen verschillend worden geregeld. Farmacologische modulatie kan dus een andere impact hebben. Naast standaard immunohistologie kunnen metabole voorvallen dus ook in de 3D-cultuur worden bestudeerd met behulp van sondes zoals 2-DG-IR. Om deze bevindingen te bevestigen, kan de elektronentransportketen complex I-remmer ook in deze context worden gebruikt.
Daarnaast is het 3D-cultuursysteem ook zeer geschikt voor de studie van dynamische processen met behulp van live beeldvorming onder basale omstandigheden of in aanwezigheid van stimuli of farmacologische signalen.
Bij de uitvoering van de in dit artikel beschreven procedures moeten de volgende kritische stappen in overweging worden genomen: 1) De sferoïdediameter mag niet meer dan 400 μm bedragen om necrose te voorkomen; 2) De kwantificering van invasie met behulp van Fiji-software moet zorgvuldig worden gekalibreerd en uitgevoerd, zoals aangegeven in de gedetailleerde beschrijving van de procedure.; 3) De gelstijfheid moet geschikt zijn om de sferoïde in een stabiele configuratie te houden; 4) De pH-waarde moet worden gecontroleerd, omdat een zeer zure pH het invasieproces zal belemmeren.
Een beperking van het sferoïde systeem beschreven in dit artikel is het ontbreken van de volledige tumor micro-omgeving. We erkennen dat de gebruikte matrix niet volledig de stroma vertegenwoordigt die in glioblastoom wordt gevonden. Echter, collageen maken deel uit van de hersenen matrix en we wilden een kant-en-klare test die kan worden gebruikt in elk laboratorium te ontwikkelen. Niettemin kunnen toekomstige experimenten ook aanvullende matrixcomponenten en cellulaire elementen bevatten, waaronder stromale en immuuncellen. Een ander niveau van complexiteit is de opname van neuronale componenten, maar deze experimenten moeten zorgvuldig worden gekalibreerd en ontworpen.
Tot slot, we geloven dat onze sferoïde 3D-systeem en de analytische tools die we bieden in dit artikel nuttig kan zijn voor onderzoekers, vooral bij het bestuderen van de ontwikkeling van hersentumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon is een ontvanger van de beurs van het Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
References
- Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
- Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
- Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
- Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
- Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
- Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
- de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
- Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).
