Summary
Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.
Abstract
Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) n’imitent pas la croissance in vivo de tumeur de manière satisfaisante. Par conséquent, des modèles sphéroïdes de culture tridimensionnels (3D) ont été développés. Ces modèles peuvent être particulièrement importants dans le domaine de la neuro-oncologie. En effet, les tumeurs cérébrales ont tendance à envahir l’environnement sain du cerveau. Nous décrivons ici dans un essai idéal de glioblastoma spheroid-basé que nous avons développé pour étudier l’invasion de tumeur. Nous fournissons tous les détails techniques et les outils analytiques pour effectuer avec succès cet essai.
Introduction
Dans la plupart des études utilisant des lignées cellulaires primaires ou disponibles dans le commerce, des essais sont effectués sur des cellules cultivées sur des surfaces en plastique comme cultures monocouches. La gestion de la culture cellulaire en 2D représente des inconvénients, car elle n’imite pas un environnement cellulaire in vivo 3D. Dans les cultures 2D, toute la surface cellulaire est directement en contact avec le milieu, modifiant la croissance cellulaire et modifiant la disponibilité des médicaments. En outre, la surface plastique non physiologique déclenche la différenciation cellulaire1. Des modèles de culture tridimensionnels ont été développés pour surmonter ces difficultés. Ils ont l’avantage d’imiter l’architecture multicellulaire et l’hétérogénéité des tumeurs2, et pourrait donc être considéré comme un modèle plus pertinent pour les tumeurs solides3. La morphologie complexe des sphéroïdes contribue à mieux évaluer la pénérance et la résistance des médicaments4. L’hétérogénéité tumorale dans le sphéroïde a un impact sur la diffusion de l’oxygène et des nutriments, et la réponse aux agents pharmacologiques (figure 1A). La diffusion de l’oxygène est modifiée lorsque la taille du sphéroïde atteint 300 m, induisant un environnement hypoxique au centre du sphéroïde(figure 1A,C). Les métabolites sont également moins pénétrants à travers les couches cellulaires et les réactions métaboliques compensatoires ont lieu5. Lorsque le diamètre du sphéroïde augmente, des noyaux nécrotiques peuvent être observés, imitant davantage les caractéristiques trouvées dans de nombreux cancers solides, y compris le glioblastome agressif de cancer du cerveau (GBM)6.
Plusieurs essais d’invasion 2D ou 3D pour le glioblastome ont été rapportés dans la littérature7,8. Les essais bidimensionnels sont principalement pour étudier l’invasion dans un plan horizontal sur une fine couche de matrice ou dans un essai de chambre Boyden9. Des essais tridimensionnels ont été décrits avec des cultures sphéroïdes 3D utilisant des lignées cellulaires classiques de glioblastome10. Des variantes plus complexes sont représentées par l’invasion des organoïdes cérébraux par des sphéroïdes tumoraux dans les cultures de confrontation11. Cependant, il est toujours important de développer un essai facile à utiliser et reproductible à la disposition de n’importe quel laboratoire. Nous avons mis au point un protocole pour générer des cellules souches de glioblastome à partir d’échantillons de patients. La quantification de ces essais est facilement gérable et ne nécessite qu’un logiciel en ligne en libre accès. En bref, les morceaux de tumeur sont coupés en petits morceaux et enzymatiquement digérés. Les cellules simples dérivées de la digestion sont cultivées dans le milieu neurobasal. Après 4-7 jours, les structures sphéroïdes se forment spontanément. Sur l’implantation intracrânienne dans les modèles de souris, ils forment des tumeurs présentant un noyau nécrotique entouré de cellules pseudo-palisading12. Cela ressemble étroitement aux caractéristiques trouvées dans les patients gbM.
Dans cet article, nous décrivons notre protocole pour produire des sphéroïdes à partir d’un nombre déterminé de cellules pour assurer la reproductibilité. Deux matrices complémentaires peuvent être utilisées à cette fin : le matrigel et le type de collagène I. Matrigel est enrichi en facteurs de croissance et imite la membrane basale mammifère nécessaire à l’attachement et à la migration des cellules. D’autre part, le type de collagène I, un élément structurel du stroma, est la matrice extracellulaire fibrillaire la plus commune et est utilisé dans les essais d’invasion cellulaire. Ici, nous élisons notre modèle de sphéroïde GBM en effectuant des essais de migration et de prolifération. L’analyse a été effectuée non seulement aux points fixes, mais aussi en surveillant l’expansion des sphéroïdes et le mouvement cellulaire par imagerie en direct. En outre, la microscopie électronique a été faite pour visualiser les détails morphologiques.
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Protocol
Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients (de l’hôpital Haukeland, Bergen, Norvège selon les règlements des comités d’éthique locaux). Notre protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche humaine de notre institution.
1. Génération de sphéroïdes de tumeur de taille uniforme
REMARQUE : Les cellules de tige-comme sont cultivées dans le milieu neurobasal complété avec le supplément de B27, l’héparine, FGF-2, la pénicilline, et la streptomycine, comme décrit dans les articles précédents12. Ces cellules forment spontanément des sphéroïdes dans la culture.
- Laver les cellules tumorales avec 5 mL phosphate tamponné saline (PBS) et incuber les cellules avec 0,5-1 mL enzyme de dissociation (voir Tableau des matériaux) pendant 5 minutes à 37 oC.
- Laver avec 4-4,5 ml PBS et ajouter 10 ml du milieu de croissance complète (milieu neurobasal complet, cNBM).
- Comptez les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique avec du bleu trypan et d’une diapositive de chambre de comptage cellulaire.
- Pour générer 100 sphéroïdes avec 104 cellules par sphéroïde (selon la taille préférée), mélanger 106 cellules dans 8 ml de NBM avec 2 ml de méthylcellulose de 2 %.
- Transférer la suspension dans un contenant de système stérile et distribuer 100 L/puits avec une pipette multicanal dans une plaque inférieure ronde de 96 puits.
- Incuber la plaque à 37 oC, 5% de CO2 et 95% d’humidité. Des sphéroïdes de taille égale se formeront et peuvent être utilisés après 3-4 jours.
2. Expériences tridimensionnelles
- Prolifération
- Préparation
- Suspendre les inhibiteurs (p. ex., la roténone comme dans la figure 4A)et les produits chimiques dans 100 l de milieu et ajouter à la 100 L de milieu dans chaque puits (c.-à-d. un spheroid par puits).
- Incuber la plaque à 37 oC, 5% de CO2, et 95% d’humidité.
- Acquisition et analyse d’images
- Prenez des photos avec un microscope vidéo dans brightfield pour créer une série de conditions à T0 et les heures suivantes attendues.
- Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatique. Pour ce faire manuellement, dessiner un cercle autour du noyau sphéroïde avec l’outil de sélection à main levée et mesurer la zone de chaque sphéroïde. Pour analyser les images d’une manière semi-automatique, utilisez la macro montrée dans le document supplémentaire 1 avec //Zone centrale seulement.
- Préparation
- Invasion
- Préparation
- Préparer la matrice de collagène dans un tube sur glace avec du collagène de type I à 1 mg/mL de concentration finale, 1x PBS,collagène0,023xV , 1 M d’hydroxyde de sodium, et stérile H2O. Incubate la solution sur la glace pendant 30 min.
- Recueillir des sphéroïdes à partir de la plaque ronde de puits de fond dans des tubes de 500 L et laver 2x avec 200 L 1x PBS.
- Pipette les sphéroïdes soigneusement dans 100 L de la matrice de collagène et insérer au centre d’un puits dans la normale 96 plaques de puits.
- Incuber le gel de collagène pendant 30 min à 37 oC, puis ajouter le cNBM sur le gel. Les inhibiteurs ou les activateurs (p. ex., le chlorure d’hydrogène comme indiqué dans la figure 4B, 4C)peuvent être ajoutés au milieu à cette étape.
- Acquisition et analyse d’images
- Prenez des photos séquentiellement avec un microscope vidéo en mode brightfield 24 h après l’inclusion de collagène.
- Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatique. Pour ce faire manuellement, dessiner autour du noyau et la zone totale du sphéroïde avec l’outil de sélection à main levée et mesurer la zone invasive de chaque sphéroïde en soustrayant la zone totale avec la surface centrale. Pour analyser les images d’une manière semi-automatique, utilisez la macro comme indiqué dans le document supplémentaire 1 pour déterminer la zone invasive.
- Préparation
- Migration
- Préparation
- Enrober une plaque de 6 puits avec du Matrigel (0,2 mg/mL) en NBM pendant 30 min à 37 oC, puis retirer le Matrigel et ajouter 2 ml de cNBM.
- Transférer les sphéroïdes dans 50 L de cNBM de la plaque de puits de fond rond à la plaque de 6 puits.
- Incuber la plaque à 37 oC et attendre 30 min pour que les sphéroïdes adhèrent.
- Après 24 h d’incubation, tache avec 10 ng/mL de Hoechst et incubate 30 min à 37 oC.
- Acquisition et analyse d’images
- Obtenez des images à l’aide d’un microscope vidéo dans le champ lumineux. Un laser de 405 nm est utilisé pour la visualisation de la coloration Hoechst.
- Utilisez le logiciel Fidji pour analyser les images et exécuter la macro comme indiqué dans le document supplémentaire 1.
REMARQUE : Toucher le fond du puits ou enlever complètement les dommages supernatants les sphéroïdes. Pour la manipulation du gel de type collagène I, conserver le gel sur la glace pour éviter la polymérisation du collagène, n’ajoutez pas un composant acide parce que le changement de pH affectera la compacité du gel, et les cellules de pipette rapidement dans le collagène pour empêcher la mort cellulaire et la dégradation du gel.
- Préparation
3. Macro Fidji
REMARQUE : Fidji est un programme d’analyse d’images développé dans le domaine public qui permet au développement de macros d’accélérer l’analyse d’image. L’analyse manuelle est également possible, mais il s’agit d’un processus lent et peut introduire des biais. Les images peuvent être importées par drag-and-drop dans le logiciel et quantifiées avec le plugin ROI Manager Tools. La procédure utilisée dans cette étude est décrite ci-dessous :
- Ouvrez la fenêtre macro : Plugins Macros Interprète interactif.
- Copiez et collez la boucle violette adaptée suivante. Conservez les phrases violettes et ajoutez les phrases vertes d’intérêt(Document supplémentaire 1).
- Pour analyser l’ensemble de la série, ajustez les paramètres en rouge pour une quantification spécifique et exécutez la macro à l’aide de Macros . Exécuter Macro ou presser Ctrl-R.
- Vérifier et, si nécessaire, adapter manuellement la région d’intérêt (ROI).
4. Microscopie électronique des sphéroïdes
REMARQUE : La plupart des étapes suivantes doivent être faites dans une hotte chimique.
- Étape de fixation
- Recueillir le sphéroïde avec une pointe de pipette coupée, le mettre dans un tube de 1,5 mL, et laver 1x avec 0,1 M tampon de phosphate (PB).
- Fixer le sphéroïde pendant la nuit à 4 oC en glutaraldéhyde de 2% /2% paraformaldéhyde (PFA) en 0,1 M PB.
- Remplacez la solution de fixation par une solution de 1% de PFA en 0,1 M PB suivie d’une préparation d’échantillon.
- Préparation de l’échantillon
- Transférer les sphéroïdes dans une passoire et les mettre dans un bécher de verre afin d’éviter les dommages sphéroïdes.
- Laver soigneusement 3x avec 0,1 M PB.
- Incuber avec de l’osmium pendant 2 h dans l’obscurité. Diluer l’osmium à 4 % dans un tampon de 0,1 M PB de 1 %.
- Laver soigneusement 3x avec 0,1 M PB.
- Déshydrater comme suit: tremper dans 50% d’éthanol pendant 10 min, 70% d’éthanol pour 10 min, 2x 90% d’éthanol pendant 15 min, 2x 100% d’éthanol pendant 20 min, et 2x acétone pour 30 min.
- Incuber les échantillons dans un mélange de 50/50 d’acétone/résine pendant 2 h. Au cours de cette étape, préparer la résine EPON (Embed-812 : 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
- Jeter le mélange d’acétone/résine, remplacer par de la résine fraîchement préparée et incuber toute la nuit.
- Remplacer la résine par une nouvelle et incuber entre 2-6 h.
- Ajouter les sphéroïdes dans la résine dans un moule à 60 oC pendant 48-72 h.
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Representative Results
Des sphéroïdes ont été préparés comme décrit dans la section des protocoles et des observations ont été faites concernant la migration, l’invasion, la prolifération et la microscopie. Pour mesurer l’hypoxie dans des zones distinctes de la structure sphérique, la coloration carboxique d’anhydrase IX a été utilisée pour déterminer l’activité hypoxique(figure 1A-C). Plus de cellules CAIX-positives ont été observées dans le centre sphéroïde (figure 1A-C). Les cellules hypoxiques situées dans le noyau sphéroïde ont tendance à être plus glycolytiques que les cellules environnantes. Les mitochondries peuvent être représentées pour d’autres analyses telles que montrées par microscopie électronique(figure 1Ba-1Bb). Les sphéroïdes composés de 2,5 x 103, 5 x 103, 104, ou 2 x 104 cellules présentent un diamètre sphéroïde d’environ 350, 400, 500, ou 650 m respectivement(figure 2A). Les sphéroïdes peuvent être utilisés dans les 4 jours suivant le début de l’expérience(figure 2B). La quantification de chaque essai (c.-à-d. prolifération, invasion, migration) est indiquée à la figure 3. Des macros fidjiens ont été élaborées pour quantifier la prolifération, l’invasion ou la migration(figure 3 et document supplémentaire 1).
L’augmentation du noyau sphéroïde reflète la stimulation de la prolifération cellulaire(figure 4A). Sur l’inhibition par la roténone, un inhibiteur établi du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, la grande majorité de la production d’ATP dans les mitochondries a été compromise. En conséquence, la prolifération a été réduite de 20 % après 72 h(figure 4A). Invasion du type de collagène J’ai été calculée par la soustraction de la zone totale de la zone centrale. Le traitement acide a amélioré l’invasion sur une période de 24 h(figure 4B). De plus, nous avons constaté que le traitement du chlorure d’hydrogène réduisait de 1,5 fois la zone migratrice des sphéroïdes par rapport au contrôle(figure 4C). La dynamique sphéroïde a été étudiée par le montage pour l’imagerie en direct dans l’UniverSlide13. Les sphéroïdes avaient une forte dynamique interne et se déplaçaient rapidement (Film 1 et analyse de suivi dans la figure 4D).
Figure 1 : Le sphéroïde est un modèle pertinent pour imiter les tumeurs solides. (A) Spheroid comme structure 3D ronde avec différentes zones. aa) Une image de champ lumineux d’un sphéroïde P3 montre une apparence ronde avec une zone centrale dense. Échelle de 100 m. (b) Représentation schématique adaptée de Hirschhaeuser et coll.6 montre l’O2, LE CO2, le métabolite et les gradients de catabolite dans le sphéroïde. cc) Panneau gauche : image confocdale d’un sphéroïde taché de DAPI (bleu) et avec des anticorps contre l’anhydrase carboxique IX (vert). Panneau droit : quantification de la fluorescence de la zone pointillée. Échelle de 100 m (B) Images de microscopie électronique avec mitochondries délimitées (lignes pointillées). De grandes mitochondries sont observées dans la quiescentarea alors qu’elles sont plus petites dans la zone de prolifération. Échelle de 250 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Étapes globales de préparation des sphéroïdes. (A) Génération de sphéroïdes humains de glioblastome de P3. Les images représentatives sont sur le panneau de gauche et l’analyse correspondante de la prolifération sur le panneau de droite. À 24 h, les cellules P3 ont formé des sphéroïdes denses. Le nombre initial de cellules a déterminé la taille des sphéroïdes. Barre d’échelle de 250 m. (B) Illustration schématique des protocoles faciles pour étudier la prolifération, l’invasion ou la migration. Sphéroïdes dans diverses conditions: (a) Dans le milieu sans sérum pour la croissance tumorale, (b) Dans la matrice de collagène pour faciliter l’invasion de cellules simples, et (c) Sur le revêtement matrigel pour la migration cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Quantification des essais in vitro avec le logiciel Fidji. Représentation des régions d’intérêt (ROI) obtenues à l’aide de Fidji. La zone centrale est représentée en rouge et la superficie totale, qui contient la zone centrale, en jaune. La zone envahissante correspond à la soustraction de la superficie totale de la zone centrale. (A) Essai de prolifération. (B) Essai d’invasion dans le gel de collagène dans les acquisitions de champs lumineux. (C) Analyse de migration sur le revêtement Matrigel par acquisition de fluorescence. Les noyaux étaient tachés de DAPI, en bleu. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : sphéroïde de Glioblastoma P3 dans les essais de prolifération, d’invasion ou de migration. (A) Essai de prolifération. Panneau gauche : Images représentatives avec DMSO comme contrôle ou avec 20 M de roténone (inhibiteur du complexe respiratoire I) à l’époque 0 ou 72 h. Panneau droit : Quantification de zone sphéroïde représentée comme lignes pointillées dans les images. Échelle de 250 m. (B) Essai d’invasion dans la matrice de collagène. Panneau gauche : Images représentatives avec ou sans chlorure d’hydrogène de 20 mM, à l’époque 0 ou 24 h. Panneau droit : Quantification des zones envahissantes. Échelle de 100 m. (C) Essai de migration sur le revêtement Matrigel. Panneau gauche : Images représentatives en mode champ lumineux au moment 0 ou 24 h. Les zones agrandies sont représentées dans les panneaux inférieurs. Panneau de droite : Quantification des zones migratoires. Échelle de 250 m. (D) représentation de la pile Z du sphéroïde (40 m étape) dans (une) dynamique sphéroïde suivie sur 18 h (image avec 3 h d’intervalle) dans(b). Cellules exprimées de façon stable mCherry nucléaire (orange) et cytoplasmique GFP (bleu). Échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1 : Dynamique sphéroïde P3 enregistrée à plus de 18 h (image toutes les 30 minutes). Barre d’échelle à 100 m. Le film représente une pile Z fusionnée au fil du temps avec un Z-étape de 5 m pour un volume total approximatif de 150 m. Les cellules ont été infectées par le lentivirus pour exprimer NLS:mCherry (les noyaux sont orange) et avec GFP cytoplasmique (couleur bleue). S’il vous plaît cliquez ici pour afficher ce fichier (Cliquez à droite pour télécharger).
Document supplémentaire 1 : Macro fidjien pour analyser l’invasion, la prolifération et la migration du sphéroïde 3D. S’il vous plaît cliquez ici pour afficher ce fichier (Cliquez à droite pour télécharger).
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Discussion
Les essais sphéroïdes de tumeur sont bien adaptés pour étudier les caractéristiques de tumeur comprenant la prolifération, l’invasion, et la migration, aussi bien que la mort cellulaire et la réponse de drogue. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D formant un microtumor invasif, comme on le voit dans la figure 4B,C. Pendant le processus invasif, les métalloproteinases de matrice (MMP) digèrent les matrices entourant les cellules tumorales13, et les inhibiteurs de MMP (p. ex. GM6001 ou Rebimastat) peuvent altérer l’invasion cellulaire mais pas la migration14. La migration et l’invasion impliquent des événements moléculaires15, qui peuvent être étudiés dans notre essai sphéroïde. Pour ce faire, des voies de signalisation spécifiques peuvent être ciblées soit au niveau génétique, soit par inhibition pharmacologique.
Les glioblastomes sont connus pour envahir largement les tissus environnants par différents processus (p. ex., co-option, invasion de la matière blanche, invasion interstitielle)16. Nous avons récemment décrit deux nouveaux mécanismes d’invasion de glioblastome9,12,17. En particulier, nous avons étudié la thrombospondine matricellulaire-1 (TSP1) et avons montré qu’il est impliqué dans l’invasion de cellules tumorales par l’activation du CD47 dans les cellules tumorales12. En outre, en utilisant une approche protéomique, nous avons découvert le rôle inattendu de PLP1 et DNM1 dans l’invasion GBM17. Dans ces études, les essais d’invasion 3D ont été utilisés avec succès avec ou sans obstruction pharmacologique de TSP1, PLP1, ou DNM1. Outre l’obstruction pharmacologique, nous avons également montré que le traitement acide avec le chlorure d’hydrogène a des répercussions sur l’invasion dans l’essai 3D. On sait que l’acidose tumorale active un certain nombre de voies de signalisation, y compris les voies métaboliques (glycolyse), les facteurs de croissance comme TGF, et inhibe la réponse immunitaire5.
Les cultures tridimensionnelles fournissent un environnement plus physiologique pertinent que les cultures 2D, et de nombreux paramètres moléculaires et métaboliques peuvent être différemment réglementés. Ainsi, la modulation pharmacologique peut avoir un impact différent. Par conséquent, outre l’immunohistologie standard, les événements métaboliques peuvent également être étudiés dans la culture 3D utilisant des sondes telles que 2-DG-IR. Pour corroborer ces résultats, l’inhibiteur de la chaîne de transport d’électrons I peut également être utilisé dans ce contexte.
En outre, le système de culture 3D est également bien adapté à l’étude des processus dynamiques utilisant l’imagerie vivante dans des conditions basales ou en présence de stimuli ou de signaux pharmacologiques.
Les étapes critiques suivantes doivent être prises en considération lors de l’exécution des procédures décrites dans cet article: 1) Le diamètre sphéroïde ne doit pas dépasser 400 m afin d’éviter la nécrose; 2) La quantification de l’invasion à l’aide du logiciel Fidji doit être soigneusement calibrée et effectuée comme indiqué dans la description détaillée de la procédure.; 3) La rigidité de gel doit être appropriée pour tenir le sphéroïde dans une configuration stable ; 4) La valeur du pH doit être contrôlée, car un pH très acide entravera le processus d’invasion.
Une limitation du système sphéroïde décrit dans cet article est l’absence du microenvironnement complet de tumeur. Nous reconnaissons que la matrice utilisée ne représente pas entièrement le stroma trouvé dans le glioblastome. Cependant, les collagènes font partie de la matrice du cerveau et nous voulions développer un essai prêt et facile à utiliser qui peut être utilisé dans n’importe quel laboratoire. Néanmoins, les expériences futures peuvent également inclure des composants de matrice supplémentaires ainsi que des éléments cellulaires, y compris les cellules stromales et immunitaires. Un autre niveau de complexité est l’inclusion de composants neuronaux, mais ces expériences doivent être soigneusement calibrées et conçues.
En conclusion, nous croyons que notre système 3D sphéroïde et les outils analytiques que nous fournissons dans cet article peuvent être utiles pour les investigateurs, particulièrement dans l’étude du développement de tumeur de cerveau.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon est diplômé du CHU de Toulouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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