Summary
Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.
Abstract
Le colture cellulari bidimensionali (2D) non imitano la crescita del tumore in vivo in modo soddisfacente. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di sferoidcoltura tridimensionale (3D). Questi modelli possono essere particolarmente importanti nel campo della neuro-oncologia. Infatti, i tumori cerebrali hanno la tendenza a invadere l'ambiente cerebrale sano. Descriviamo qui in un saggio ideale basato sul glioblastoma sferoide 3D che abbiamo sviluppato per studiare l'invasione tumorale. Forniamo tutti i dettagli tecnici e gli strumenti analitici per eseguire con successo questo saggio.
Introduction
Nella maggior parte degli studi che utilizzano linee cellulari primarie o disponibili in commercio, i saggi vengono eseguiti su cellule coltivate su superfici plastiche come colture monostratori. La gestione della coltura cellulare in 2D rappresenta uno svantaggio, in quanto non imita un ambiente cellulare 3D in vivo. Nelle colture 2D, l'intera superficie cellulare è direttamente in contatto con il mezzo, alterando la crescita cellulare e modificando la disponibilità di farmaci. Inoltre, la superficie plastica non fisiologica innesca la differenziazione cellulare1. Sono stati sviluppati modelli di coltura tridimensionali per superare queste difficoltà. Hanno il vantaggio di imitare l'architettura multicellulare e l'eterogeneità dei tumori2, e quindi potrebbe essere considerato un modello più rilevante per i tumori solidi3. La complessa morfologia degli sferoidi contribuisce a valutare meglio la penetrazione e la resistenza dei farmaci4. L'eterogeneità tumorale nello sferoide influisce sulla diffusione di ossigeno e sostanze nutritive e la risposta agli agenti farmacologici (Figura 1A). La diffusione dell'ossigeno viene alterata quando la dimensione dello sferoide raggiunge i 300 m, inducendo un ambiente ipossico al centro dello sferoide (Figura 1A,C). I metaboliti sono anche meno penetranti attraverso gli strati cellulari e compensando le reazioni metaboliche avvengono5. Quando il diametro dello sferoide aumenta, i nuclei necrotici possono essere osservati, imitando ulteriormente le caratteristiche che si trovano in molti tipi di cancro solido, tra cui il cancro al cervello aggressivo glioblastoma (GBM)6.
Diversi saggi di invasione 2D o 3D per il glioblastoma sono stati riportati nella letteratura7,8. I saggi bidimensionali sono principalmente per studiare l'invasione in un piano orizzontale su uno strato sottile di matrice o in un assaggio della camera di Boyden9. I saggi tridimensionali sono stati descritti con colture di sferoidi 3D utilizzando classiche linee cellulari glioblastoma10. Varianti più complesse sono rappresentate dall'invasione degli organoidi cerebrali da parte di sferoidi tumorali nelle colture di confronto11. Tuttavia, è ancora importante sviluppare un saggio facile da usare e riproducibile a disposizione di qualsiasi laboratorio. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare cellule staminali del glioblastoma da campioni di pazienti. La quantificazione di questi saggi è facilmente gestibile e richiede solo software online ad accesso aperto. In breve, i pezzi tumorali vengono tagliati in piccoli pezzi e eviticamente digeriti. Le cellule singole derivate dalla digestione sono coltivate nel mezzo neurobasale. Dopo 4-7 giorni, le strutture sferoidi si formano spontaneamente. Al momento dell'impianto intracranico nei modelli di topi, formano tumori che presentano un nucleo necrotico circondato da cellule pseudo-palizzate12. Questo è molto simile alle caratteristiche che si trovano nei pazienti GBM.
In questo articolo, descriviamo il nostro protocollo per produrre sferoidi da un determinato numero di cellule per garantire la riproducibilità. A questo scopo possono essere utilizzate due matrici complementari: Matrigel e collagene di tipo I. Matrigel è arricchito in fattori di crescita e imita la membrana basale dei mammiferi necessaria per l'attaccamento cellulare e la migrazione. D'altra parte, il collagene I, un elemento strutturale dello stroma, è la matrice extracellulare fibrillare più comune ed è usato nei saggi di invasione cellulare. Qui illustriamo il nostro modello di sferoide GBM eseguendo analisi su migrazione e proliferazione. L'analisi è stata effettuata non solo in momenti fissi, ma anche monitorando l'espansione degli sferoidi e il movimento cellulare mediante imaging dal vivo. Inoltre, la microscopia elettronica è stata fatta per visualizzare i dettagli morfologici.
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Protocol
Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall'Ospedale Haukeland, Bergen, Norvegia secondo i regolamenti del comitato etico locale). Il nostro protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.
1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi
NOTA: Le cellule staminali sono coltivate in mezzi neurobasali completati con supplemento B27, eparina, FGF-2, penicillina e streptomicina, come descritto negli articoli precedenti12. Queste cellule formano spontaneamente sferoidi in coltura.
- Lavare le cellule tumorali con 5 mL di salina tampone fosfato (PBS) e incubare le cellule con enzima di dissociazione di 0,5-1 mL (vedi Tabella dei materiali)per 5 minuti a 37 .
- Lavare con 4-4,5 mL di PBS e aggiungere 10 mL del mezzo di crescita completo (mezzo neurobasale completo, cNBM).
- Contare le celle utilizzando una tecnica di conteggio automatico con trypan blu e una diapositiva camera di conteggio cellulare.
- Per generare 100 sferoidi con 104 cellule per sferoide (secondo le dimensioni preferite), mescolare 106 cellule in 8 mL di NBM con 2 mL di 2% metilcellulosa.
- Trasferire le sospensioni in un contenitore di sistema sterile e erogare 100 .l/well con una pipetta multicanale in una piastra inferiore ben rotonda 96.
- Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 e il 95% di umidità. Sferoidi di dimensioni uguali si formeranno e possono essere utilizzati dopo 3-4 giorni.
2. Esperimenti tridimensionali
- Proliferazione
- Preparazione
- Sospendere gli inibitori (ad es. rotenone come nella Figura 4A)e le sostanze chimiche in 100 , l'una di mezzo e aggiungere a 100 , l'una di mezzo in ogni pozzo (ad es. uno sferoide per bene).
- Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2e il 95% di umidità.
- Acquisizione e analisi delle immagini
- Scatta foto con un microscopio video in brightfield per creare una serie di condizioni a T0 e nei seguenti momenti previsti.
- Utilizzare Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegna un cerchio intorno al nucleo dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misura l'area di ogni sferoide. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare la macro mostrata nel documento supplementare 1 solo con //Core Area.
- Preparazione
- Invasione
- Preparazione
- Preparare la matrice di collagene in un tubo sul ghiaccio con collagene di tipo I a 1 concentrazione finale mg/mL, 1x PBS,collagene0.023xV , 1 M di idrossido di sodio e sterile H2O. Incubare la soluzione sul ghiaccio per 30 min.
- Raccogliere gli sferoidi dal pozzo del fondo rotondo in tubi da 500 l e lavarle 2 volte con 200 l1 PBS.
- Pipetta gli sferoidi con attenzione in 100 l della matrice di collagene e inserire al centro di un pozzo in normali 96 pozze di pozzo.
- Incubare il gel di collagene per 30 min a 37 gradi centigradi e quindi aggiungere cNBM sopra il gel. Inibitori o attivatori (ad esempio, cloruro di idrogeno come mostrato nella Figura 4B, 4C) possono essere aggiunti al mezzo in questa fase.
- Acquisizione e analisi delle immagini
- Scattare foto in sequenza con un microscopio video in modalità brightfield 24 h dopo l'inclusione del collagene.
- Utilizzare Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegnare intorno al nucleo e all'area totale dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misurare l'area invasiva di ogni sferoide sottraendo l'area totale con l'area del nucleo. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare la macro come indicato nel documento supplementare 1 per determinare l'area invasiva.
- Preparazione
- Migrazione
- Preparazione
- Rivestire una piastra 6 po' con Matrigel (0,2 mg/mL) in NBM per 30 min a 37 gradi centigradi, quindi rimuovere il Matrigel e aggiungere 2 mL di cNBM.
- Trasferire gli sferoidi in 50 o L di cNBM dalla piastra del fondo rotondo alla piastra 6 del pozzo.
- Incubare la piastra a 37 gradi centigradi e attendere 30 min per gli sferoidi di aderire.
- Dopo 24 h di incubazione, macchia con 10 ng/mL di Hoechst e incuba 30 min a 37 gradi centigradi.
- Acquisizione e analisi delle immagini
- Ottenere immagini utilizzando un microscopio video in brightfield. Un laser da 405 nm viene utilizzato per la visualizzazione della colorazione Hoechst.
- Utilizzare il software Fiji per analizzare le immagini ed eseguire la macro come indicato nel documento supplementare 1.
NOTA: Toccare il fondo del pozzo o rimuovere completamente il supernatante danneggia gli sferoidi. Per la movimentazione del gel di tipo collagene, tenere il gel sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione del collagene, non aggiungere un componente acido perché il cambiamento di pH influenzerà rapidamente la compattezza del gel e le cellule pipette nel collagene per prevenire la morte cellulare e la degradazione del gel.
- Preparazione
3. Macro Fiji
NOTA: Fiji è un programma di analisi delle immagini sviluppato nel pubblico dominio che permette lo sviluppo di macro per accelerare l'analisi delle immagini. Anche l'analisi manuale è possibile, ma questo è un processo lento e può introdurre distorsioni. Le immagini possono essere importate mediante trascinamento della selezione nel software e quantificate con il plugin ROI Manager Tools. La procedura utilizzata in questo studio è descritta di seguito:
- Aprire la finestra della macro: Plugins Macros Interprete interattivo.
- Copiare e incollare il seguente loop viola adattato. Mantenere le frasi viola e aggiungere le frasi verdi di interesse (Documento supplementare 1).
- Per analizzare l'intera serie, regolare i parametri in rosso per una quantificazione specifica ed eseguire la macro utilizzando Macro. Eseguire la macro o premendo Ctrl .
- Controllare e, se necessario, adattare manualmente la regione di interesse (ROI).
4. Microscopia elettronica degli sferoidi
NOTA: la maggior parte dei seguenti passaggi deve essere eseguita in una cappa chimica.
- Fase di fissaggio
- Raccogliere lo sferoide con una punta di tubodicatura tagliata, metterlo in un tubo da 1,5 mL e lavare 1x con buffer di fosfato da 0,1 M (PB).
- Fissare lo sferoide durante la notte a 4 gradi centigradi nel 2% di glutaraldeide/2% di paraformaldeide (PFA) in 0,1 M PB.
- Sostituire la soluzione di fissaggio con una soluzione di 1% PFA in 0,1 M PB seguita dalla preparazione del campione.
- Preparazione del campione
- Trasferire gli sferoidi in un colino e metterli in un bicchiere di vetro per evitare danni sferoidi.
- Lavare con cura 3x con 0,1 M PB.
- Incubare con osmio per 2 h al buio. Diluire l'osmio al 4% nel buffer PB 1%0,1 M.
- Lavare con cura 3x con 0,1 M PB.
- Diidratati come segue: immergere in 50% etanolo per 10 min, 70% etanolo per 10 min, 2x 90% etanolo per 15 min, 2x 100% etanolo per 20 min, e 2x acetone per 30 min.
- Incubare i campioni in una miscela 50/50 di acetone/resina per 2 h. Durante questo passaggio, preparare la resina EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
- Scartare la miscela di acetone/resina, sostituire con resina appena preparata e incubare durante la notte.
- Sostituire la resina con una nuova e incubare tra 2-6 h.
- Aggiungere gli sferoidi in resina in uno stampo a 60 gradi centigradi per 48-72 h.
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Representative Results
Gli sferoidi sono stati preparati come descritto nella sezione protocolli e sono state fatte osservazioni riguardanti la migrazione, l'invasione, la proliferazione e la microscopia. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, l'colorazione iX di anidera carboxica è stata utilizzata per determinare l'attività ipossica (Figura 1A-C). Sono state osservate più cellule CAIX-positive nel centro sferoide (Figura 1A-C). Le cellule ipossiche situate nel nucleo dello sferoide tendono ad essere più glititiche di quelle circostanti. I mitocondri possono essere immagine per ulteriori analisi come dimostrato dalla microscopia elettronica (Figura 1Ba-1Bb). Gli sferoidi composti da 2,5 x 103, 5 x 103, 104o 2 x 104 celle presentano rispettivamente un diametro di sferoide di circa 350, 400, 500 o 650 m (Figura 2A). Gli spheroid possono essere utilizzati entro 4 giorni dall'inizio dell'esperimento (Figura 2B). La quantificazione di ogni saggio (cioè proliferazione, invasione, migrazione) è illustrata nella Figura 3. Le macro Fiji sono state sviluppate per quantificare la proliferazione, l'invasione o la migrazione (Figura 3 e Documento supplementare 1).
L'aumento del nucleo sferoide rifletteva la stimolazione della proliferazione cellulare (Figura 4A). Dopo l'inibizione da parte di rotenone, un inibitore stabilito del complesso I della catena respiratoria mitocondriale, la stragrande maggioranza della produzione di ATP nei mitocondri è stata compromessa. Di conseguenza, la proliferazione è stata ridotta del 20% dopo 72 h(Figura 4A). L'invasione del collagene tipo I è stata calcolata dalla sottrazione dell'area totale dall'area centrale. Trattamento acido ha migliorato l'invasione in un periodo di 24 h (Figura 4B). Inoltre, abbiamo scoperto che il trattamento del cloruro di idrogeno ha ridotto l'area migratoria degli sferoidi di 1,5 volte rispetto al controllo (Figura 4C). La dinamica dello Spheroid è stata studiata mediante montaggio per l'imaging live in UniverSlide13. Gli spheroid sferoidi avevano elevate dinamiche interne e si muovevano rapidamente (Film 1 e analisi di tracciamento in Figura 4D).
Figura 1: Lo sferoide è un modello rilevante per imitare i tumori solidi. (A) Spheroid come struttura 3D rotonda con diverse aree. (a) Un'immagine a campo luminoso di uno sferoide P3 mostra un aspetto rotondo con una densa area centrale. La scala è 100 m.(b) Rappresentazione schematica adattata da Hirschhaeuser et al.6 mostra i gradienti O2, CO2, metabolita e catabolita nello sferoide. (c) Pannello sinistro: immagine confocale di uno sferoide macchiato di DAPI (blu) e con anticorpi contro l'andrasimica carboxica IX (verde). Pannello destro: quantificazione della fluorescenza dall'area tratteggiata. Scala : 100 m. (B) Immagini di microscopia elettronica con mitocondri (linee tratteggiate) delineate. I grandi mitocondri sono visti nella quiescentarea mentre sono più piccoli nella zona di proliferazione. Scala: 250 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Passaggi generali per la preparazione degli sferoidi. (A) Generazione di sferoidi glioblastoma P3 umani. Le immagini rappresentative si trovano sul pannello di sinistra e la corrispondente analisi della proliferazione sul pannello di destra. A 24 h, le cellule P3 formavano sferoidi densi. Il numero iniziale di cellule ha determinato la dimensione degli sferoidi. Barra di scala - 250 m. (B) Illustrazione schematica dei protocolli facili per studiare la proliferazione, l'invasione o la migrazione. Spheroidi in varie condizioni: (a) In mezzo senza siero per la crescita del tumore, (b) Nella matrice del collagene per facilitare l'invasione di singole cellule, e (c) Sul rivestimento Matrigel per la migrazione cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dei saggi in vitro con il software Fiji. Rappresentazione delle regioni di interesse (ROI) ottenute utilizzando Fiji. L'area centrale è rappresentata in rosso e l'area totale, che contiene l'area del nucleo, in giallo. L'area invasiva corrisponde alla sottrazione dell'area totale dall'area centrale. (A) Saggio di proliferazione. (B) Ansaggio dell'invasione in gel di collagene nelle acquisizioni di campi luminosi. (C) Analisi migratoria sul rivestimento Matrigel per acquisizione di fluorescenza. I nuclei erano macchiati di DAPI, in blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Glioblastoma P3 sferoide in proliferazione, invasione, o analisi della migrazione. (A) Saggio di proliferazione. Pannello sinistro: Immagini rappresentative con DMSO come controllo o con 20 m di rotenone (inibitore della catena respiratoria I) al momento 0 o 72 h. Pannello destro: quantificazione dell'area Spheroid rappresentata come linee tratteggiate nelle immagini. Scala : 250 m. (B) Prova di invasione nella matrice del collagene. Pannello sinistro: immagini rappresentative con o senza cloruro di idrogeno da 20 mM, al momento 0 o 24 h. Pannello destro: Quantificazione delle aree invasive. Scala : 100 m.(C)Analisi migratore sul rivestimento di Matrigel. Pannello sinistro: le immagini rappresentative in modalità campo luminoso al momento 0 o 24 h. Le aree ingrandite sono rappresentate nei pannelli inferiori. Pannello destro: Quantificazione delle aree migratorie. Scala - 250 m.(D) rappresentazione dello stack dello sferoide (passo di 40 m) in (a) sferoide dinamico tracciato oltre 18 h (immagine con intervallo 3 h) in (b). Cellule espresse stabilmente mCherry (arancione) e GFP citoplasmasmico (blu). Scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1: P3 sferoide dinamica registrato oltre 18 h (immagine ogni 30 min). Barra della scala: 100 m. Il film rappresenta una pila a z fusa nel tempo con un passo a z di 5 m per un volume totale approssimativo di 150 m. Le cellule sono state infettate da lentivirus per esprimere NLS:mCherry (i nuclei sono arancioni) e con GFP citoplasmico (colore blu). Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Documento supplementare 1: Macro Fiji per analizzare l'invasione, la proliferazione e la migrazione dello sferoide 3D. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
I saggi dello sferoide tumorale sono ben adattati per studiare le caratteristiche tumorali tra cui la proliferazione, l'invasione e la migrazione, così come la morte cellulare e la risposta ai farmaci. Le cellule tumorali invadono la matrice 3D formando un microtumore invasivo, come si vede nella Figura 4B,C. Durante il processo invasivo, matrici digeriste digeriscono matrici digerite a matrice (MMP) che circondano le cellule tumorali13e gli inibitori MMP (ad esempio, GM6001 o Rebimastat) possono compromettere l'invasione cellulare ma non la migrazione14. La migrazione e l'invasione comportano la sovrapposizione ma eventi molecolari separati15, che possono essere studiati nel nostro saggio sferoide. Per fare ciò, percorsi di segnalazione specifici possono essere mirati sia a livello genetico che attraverso l'inibizione farmacologica.
I glioblastomi sono noti per invadere ampiamente i tessuti circostanti da diversi processi (ad esempio, co-opzione, invasione del tratto di materia bianca, invasione interstiziale)16. Recentemente abbiamo descritto due nuovi meccanismi di invasione del glioblastoma9,12,17. In particolare, abbiamo studiato trombombostagno-1 matricellulare (TSP1) e dimostrato che è coinvolto nell'invasione delle cellule tumorali attraverso l'attivazione del CD47 nelle cellule tumorali12. Inoltre, utilizzando un approccio proteomico, abbiamo scoperto il ruolo inaspettato di PLP1 e DNM1 nell'invasione GBM17. In questi studi, i saggi di invasione 3D sono stati utilizzati con successo con o senza ostruzione farmacologica di TSP1, PLP1 o DNM1. Oltre all'ostruzione farmacologica, abbiamo anche dimostrato che il trattamento acido con cloruro di idrogeno influisce sull'invasione nell'analisi 3D. È noto che l'acidosi tumorale attiva una serie di vie di segnalazione, comprese le vie metaboliche (glicolisi), fattori di crescita come TGF, e inibisce la risposta immunitaria5.
Le colture tridimensionali forniscono un ambiente più fisiologico rilevante rispetto alle colture 2D e molti parametri molecolari e metabolici possono essere regolati in modo diverso. Pertanto, la modulazione farmacologica può avere un impatto diverso. Di conseguenza, oltre all'immunohistologia standard, gli eventi metabolici possono essere studiati anche nella coltura 3D utilizzando sonde come 2-DG-IR. Per corroborare questi risultati, l'inibitore della catena di trasporto degli elettroni I può essere utilizzato anche in questo contesto.
Inoltre, il sistema di coltura 3D è anche adatto allo studio di processi dinamici utilizzando l'imaging dal vivo in condizioni basali o in presenza di stimoli o spunti farmacologici.
Quando si eseguono le procedure descritte in questo articolo, è necessario prendere in considerazione le seguenti misure critiche: 1) Il diametro dello sferoide non deve superare i 400 m per evitare la necrosi; 2) La quantificazione dell'invasione utilizzando il software Fiji deve essere attentamente calibrata ed eseguita come indicato nella descrizione dettagliata della procedura.; 3) La rigidità gel deve essere adatta a contenere lo sferoide in una configurazione stabile; 4) Il valore del pH deve essere controllato, in quanto un pH molto acido ostacolerà il processo di invasione.
Una limitazione del sistema sferoide descritto in questo articolo è la mancanza del microambiente tumorale completo. Riconosciamo che la matrice utilizzata non rappresenta pienamente lo stroma trovato nel glioblastoma. Tuttavia, i collageni fanno parte della matrice cerebrale e volevamo sviluppare un saggio pronto e facile da usare che può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio. Tuttavia, esperimenti futuri possono anche includere componenti aggiuntivi della matrice e elementi cellulari, tra cui le cellule stromali e immunitarie. Un altro livello di complessità è l'inclusione di componenti neuronali, ma questi esperimenti devono essere accuratamente calibrati e progettati.
In conclusione, crediamo che il nostro sistema 3D sferoide e gli strumenti analitici che forniamo in questo articolo possano essere utili per gli investigatori, specialmente nello studio dello sviluppo del tumore al cervello.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon è un ricevente di borsa di studio presso l'Ospedale Universitario di Tolosa (CHU Tolosa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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