Summary
여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.
Abstract
2차원(2D) 세포 배양은 생체 내 종양 성장을 만족스럽게 모방하지 않는다. 따라서 3차원(3D) 배양 스페로이드 모델이 개발되었습니다. 이 모형은 신경 종양학의 필드에서 특히 중요할지도 모릅니다. 실제로 뇌종양은 건강한 뇌 환경을 침범하는 경향이 있습니다. 본명은 종양 침범을 연구하기 위해 개발한 이상적인 3D 교모세포종 스페로이드 기반 분석기를 기술한다. 우리는 이 분석방법을 성공적으로 수행하기 위해 모든 기술적 세부 사항과 분석 도구를 제공합니다.
Introduction
1 차 또는 상업적으로 이용 가능한 세포주를 사용하여 대부분의 연구 결과에서는, 단층 배양으로 플라스틱 표면에 성장한 세포에 공아학은 수행됩니다. 2D에서 세포 배양을 관리하는 것은 생체 내 3D 세포 환경을 모방하지 않기 때문에 단점을 나타낸다. 2D 배양물에서, 전체 세포 표면은 배지와 직접 접촉하여 세포 성장을 변화시키고 약물 가용성을 수정한다. 또한, 비 생리학적 플라스틱 표면은 세포 분화를 유발한다1. 이러한 어려움을 극복하기 위해 3차원 배양 모델이 개발되었습니다. 그(것)들은 종양2의다세포 건축 및 이질성을 모방하는 이점이 있고, 따라서 고형종양3를위한 더 관련성 있는 모형으로 여겨질 수 있었다. 스페로이드의 복잡한 형태는 약물 침투및 내성을 더 잘 평가하는 데기여합니다 4. 스페로이드에서의 종양 이질성은 산소 및 영양소의 확산에 영향을 미치고, 약리작용제에 대한반응(도 1A). 산소의 확산은 스페로이드 크기가 300 μm에 도달하면 변경되어 스페로이드 의 중심에 저산소 환경을 유도합니다(그림 1A,C). 대사 산물은 또한 세포 층을 통해서 더 적은 관통및 보상 신진 대사 반응이 일어난다5. 스페로이드의 직경이 증가하면, 괴사 코어가 관찰될 수 있고, 공격적인 뇌암 교모세포종(GBM)을 포함하여 많은 고형암에서 발견되는 특성을 더욱 모방한다6.
교모세포종에 대한 몇몇 2D 또는 3D 침략 검칙은 문헌7,,8에보고되었다. 2차원 분석실험은 주로 얇은 매트릭스 층 또는 보이든 챔버 분석기에서 수평 평면에서 침략을 연구하기 위한 것이다9. 3차원 실험은 고전적인 교모세포종세포주(10)를사용하여 3D 스페로이드 배양물로 기재되었다. 보다 복잡한 변이체는 대립배양체 11에서종양 스페로이드에 의한 뇌 오르가노이드의 침입으로 표현된다. 그러나, 어떤 실험실든지 에 유효한 사용하기 쉬운 및 재현가능한 분석분석기를 개발하는 것이 아직도 중요합니다. 우리는 환자 샘플에서 교모세포종 줄기 와 같은 세포를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 분석법의 정량화는 쉽게 관리할 수 있으며 개방형 온라인 소프트웨어만 필요합니다. 간단히, 종양 조각은 작은 조각으로 절단하고 효소 소화. 소화에서 파생 된 단일 세포는 신경 기 저 기 에서 재배 됩니다. 4-7 일 후에 스페로이드 구조가 자발적으로 형성됩니다. 마우스 모델에서 두개내 이식 시, 그들은 의사 팔리사딩 세포(12)에둘러싸인 괴사 코어를 나타내는 종양을 형성한다. 이것은 GBM 환자에서 찾아낸 특성과 밀접하게 유사합니다.
이 문서에서는, 우리는 재현성을 보장하기 위해 결정된 수의 세포에서 스페로이드를 생산하는 우리의 프로토콜을 설명합니다. 두 개의 상보적인 행렬이 이 목적을 위해 사용될 수 있습니다: Matrigel 및 콜라겐 모형 I. Matrigel는 성장 인자에 풍부하고 세포 부착 및 이동을 위해 요구되는 포유류 기저 막을 모방합니다. 다른 한편으로는, 기질의 구조적인 요소인 콜라겐 타입 I은, 가장 일반적인 섬유질 세포외 매트릭스이고 세포 침략 검정에 이용됩니다. 본 명세서에서, 우리는 이동 및 증식 아세술을 수행함으로써 GBM 스페로이드 모델을 설명한다. 분석은 고정된 시점에서뿐만 아니라 라이브 이미징에 의한 스페로이드 팽창 및 세포 움직임을 모니터링하여 수행되었습니다. 또한, 전자 현미경 검사는 형태학적 세부 사항을 시각화하기 위하여 행해졌습니다.
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Protocol
통보 된 서면 동의는 모든 환자 (지역 윤리위원회 규정에 따라 노르웨이 베르겐 하우켈랜드 병원에서) 얻었습니다. 우리의 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 균일 한 크기의 종양 스페로이드의 생성
참고: 줄기형 세포는 이전 기사12에기재된 바와 같이 B27 보충제, 헤파린, FGF-2, 페니실린 및 스트렙토마이신을 보충하는 신경기저 배지에서 배양된다. 이 세포는 문화에서 자발적으로 스페로이드를 형성합니다.
- 종양 세포를 5 mL 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 0.5-1 mL 해리 효소로 세포를 인큐베이팅 (재료 표참조)에서 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 4-4.5 mL PBS로 세척하고 완전한 성장 배지 (완전한 신경 기저 배지, cNBM)의 10 mL를 추가합니다.
- 트라이판 블루와 셀 카운팅 챔버 슬라이드와 자동 카운팅 기술을 사용하여 세포를 계산합니다.
- 스페로이드 당 10개의 4 세포 (바람직한 크기에 따라)로 100 개의 스페로이드를 생성하려면 NBM 8 mL에서 106 세포를 2 % 메틸 셀룰로오스 2 mL과 혼합하십시오.
- 서스펜션을 멸균 시스템 용기로 옮기고 멀티채널 파이펫으로 100 μL/well을 96개의 잘 둥근 바닥 판에 분배합니다.
- 플레이트를 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 배양합니다. 동일한 크기의 스페로이드가 형성되며 3-4 일 후에 사용할 수 있습니다.
2. 3차원 실험
- 확산
- 준비
- 억제제(예를 들어, 도4A에서와같이 로테네)와 화학물질을 배지의 100 μL에 첨가하고 각 웰(즉, 웰당 1개의 스페로이드)에 배지의 100 μL을 첨가한다.
- 플레이트를 37°C, 5%CO2및 95% 습도에서 배양합니다.
- 이미지 수집 및 분석
- 밝은 필드에서 비디오 현미경으로 사진을 찍어 T0과 다음 시간에 일련의 조건을 만듭니다.
- 피지를 사용하여 수동으로 또는 반자동 방식으로 사진을 분석할 수 있습니다. 수동으로 사용하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 스페로이드 코어 주위에 원을 그리고 각 스페로이드의 면적을 측정합니다. 이미지를 반자동화된 방식으로 분석하려면 //Core 영역만 사용하여 보충 문서 1에 표시된 매크로를 사용합니다.
- 준비
- 침공
- 준비
- 1 mg/mL 최종 농도에서 I형 콜라겐, 1x PBS, 0.023xV콜라겐,1 M 수산화 나트륨, 멸균H2O. 용액을 얼음 위에 30분 동안 인큐베이션하여 얼음 위에 콜라겐 매트릭스를 준비시다.
- 500 μL 튜브에서 둥근 바닥 웰 플레이트에서 스페로이드를 수집하고 200 μL 1x PBS로 2x를 세척합니다.
- 스페로이드를 콜라겐 매트릭스의 100 μL로 조심스럽게 파이펫하고 정상 96 웰 플레이트의 웰 중앙에 삽입합니다.
- 콜라겐 젤을 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 젤 위에 cNBM을 추가합니다. 억제제 또는 활성제(예를 들어, 도 4B, 4C에도시된 염화수소)는 이 단계에서 배지에 첨가될 수 있다.
- 이미지 수집 및 분석
- 콜라겐 포함 후 24시간 동안 브라이트필드 모드에서 비디오 현미경으로 순차적으로 사진을 찍습니다.
- 피지를 사용하여 수동으로 또는 반자동 방식으로 사진을 분석할 수 있습니다. 수동으로 사용하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 스페로이드의 코어 및 전체 영역을 그리고 코어 영역을 뺀 값으로 각 스페로이드의 침습 영역을 측정합니다. 반자동화 된 방식으로 이미지를 분석하려면 보충 문서 1에 표시된 대로 매크로를 사용하여 침습 영역을 결정합니다.
- 준비
- 마이그레이션
- 준비
- 37°C에서 30분 동안 NBM에서 마트리겔(0.2 mg/mL)으로 6개의 웰 플레이트를 코팅한 다음, 마트리겔을 제거하고 cNBM 2 mL을 추가합니다.
- 원형 바닥 웰 플레이트로부터 6웰 플레이트로 50 μL의 cNBM으로 스페로이드를 옮김을 전달한다.
- 37 °C에서 플레이트를 배양하고 스페로이드가 부착 될 때까지 30 분 기다립니다.
- 배양 24시간 후, Hoechst의 10 ng/mL로 얼룩을 내고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 이미지 수집 및 분석
- 밝은 시야에서 비디오 현미경을 사용하여 이미지를 가져옵니다. 405 nm 레이저는 Hoechst 염색의 시각화에 사용됩니다.
- 피지 소프트웨어를 사용하여 사진을 분석하고 보조 문서 1에표시된 대로 매크로를 실행합니다.
참고 : 우물의 바닥을 만지거나 상급체를 완전히 제거하면 스페로이드가 손상됩니다. 콜라겐 타입 I 젤 취급의 경우, 콜라겐 중합을 피하기 위해 얼음 위에 젤을 보관하고, pH의 변화가 젤의 소형화에 영향을 미치기 때문에 산성 성분을 첨가하지 말고, 피펫 세포를 콜라겐내로 급속히 주입하여 세포 사멸 및 겔의 분해를 방지한다.
- 준비
3. 피지 매크로
참고 : 피지는 이미지 분석 속도를 매크로의 개발을 할 수 있도록 공개 도메인에서 개발 된 이미지 분석 프로그램입니다. 수동 분석도 가능하지만 이는 느린 프로세스이며 편향을 유발할 수 있습니다. 이미지는 소프트웨어의 끌어서 놓기로 가져오고 ROI 관리자 도구 플러그인으로 정량화할 수 있습니다. 이 연구에서 사용되는 절차는 아래에 설명되어 있습니다.
- 매크로 창 열기: 플러그인 | 매크로 | 대화 형 인터프리터.
- 다음에 적용된 보라색 루프를 복사하여 붙여넣습니다. 보라색 문장을 유지하고 관심의 녹색 문장을 추가(보충 문서 1).
- 전체 계열을 분석하려면 특정 정량화를 위해 매개 변수를 빨간색으로 조정하고 매크로를 사용하여 매크로를 실행합니다 | 매크로를 실행하거나 Ctrl+R을 누른다.
- 필요한 경우 ROI(관심 영역)를 수동으로 조정합니다.
4. 스페로이드의 전자 현미경 검사법
참고: 다음 단계의 대부분은 화학 적 후드에서 수행해야합니다.
- 고정 단계
- 절단 피펫 팁으로 스페로이드를 수집하고 1.5 mL 튜브에 넣고 0.1 M 인산 완충제 (PB)로 1x를 씻습니다.
- 0.1 M PB에서 2% 글루타랄데히드/2% 파라포름알데히드(PFA)에서 4°C에서 하룻밤 동안 스페로이드를 고정시다.
- 고정 용액을 0.1 M PB에서 1% PFA 의 용액으로 교체한 다음 샘플 전공을 수행합니다.
- 샘플 준비
- 스페로이드를 스트레이너로 옮기고 스페로이드 손상을 피하기 위해 유리 비커에 넣습니다.
- 0.1M PB로 3x 조심스럽게 씻으소서.
- 어둠 속에서 2 시간 동안 오스뮴으로 배양하십시오. 1% 0.1 M PB 완충액에서 4%로 오스뮴을 희석한다.
- 0.1M PB로 3x 조심스럽게 씻으소서.
- 다음과 같이 탈수: 10분 동안 50% 에탄올, 10분 동안 70% 에탄올, 15분 동안 2x 90% 에탄올, 20분 동안 2x 100% 에탄올, 30분 동안 2x 아세톤에 담가 주세요.
- 샘플을 아세톤/수지 의 50/50 혼합물에서 2 시간 동안 배양합니다. 이 단계에서, 에폰 수지 (포함-812 : 11.25g; DDSA: 9 g; NMA: 4.5 g).
- 아세톤/수지 혼합물을 버리고, 갓 준비한 수지로 대체하고 밤새 배양하십시오.
- 수지의 새 것으로 교체하고 2-6 시간 사이에 배양하십시오.
- 48-72 시간 동안 60 °C에서 금형에 수지의 스페로이드를 추가합니다.
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Representative Results
스페로이드는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고 이동, 침략, 증식 및 현미경 검사법에 관한 관찰이 이루어졌다. 구형 구조의 별개의 영역에서 저산소증을 측정하기 위해, 카르복식 아히드라아제 IX 염색을 저산소 활성을 결정하는 데 사용하였다(도1A-C). 더 많은 CAIX 양성 세포가 스페로이드 센터에서 관찰되었다(그림1A-C). 스페로이드 코어에 위치한 저산소 세포는 주변 세포보다 더 당화성인 경향이 있습니다. 미토콘드리아는 전자 현미경검사법에 의해 도시된 바와 같이 추가 분석을 위해 이미지화될 수있다(그림 1Ba-1Bb). 2.5 x 103,5 x 103,104,또는 2 x 104 세포로 구성된 스페로이드는 각각 약 350, 400, 500 또는 650 μm의 스페로이드 직경을 나타낸다(도2A). 스페로이드는 실험을 시작한 후 4일 이내에 사용될 수있다(도 2B). 각 분석법의 정량화(즉, 증식, 침입, 이동)는 도 3에도시되어 있다. 피지 매크로는 확산, 침입 또는 마이그레이션을 정량화하기 위해 개발되었다(그림3 및 보충 문서 1).
스페로이드 코어의 증가는 세포 증식의 자극을반영하였다(도 4A). 로테논에 의한 억제시, 미토콘드리아 호흡기 사슬의 복합체 I의 확립된 억제제, 미토콘드리아에서의 ATP 생산의 대부분은 손상되었다. 그 결과, 72시간 후에 증식은 20% 감소하였다(도4A). 콜라겐 타입의 침입은 코어 영역으로부터 의 전체 면적의 감산에 의해 계산되었다. 산성 처리는 24 시간의 기간에 걸쳐 침략을 강화(그림 4B). 더욱이 염화수소 처리는 스페로이드의 철새 면적을 대조군대비 1.5배 감소시키는 것으로 나타났다(도4C).Figure 4 스페로이드 역학은 UniverSlide13에서라이브 이미징을 위해 장착하여 연구되었습니다. 스페로이드는 높은 내부 역학을 가지고 빠르게 이동(그림 4D에서영화 1 및 추적 분석).
그림 1: 스페로이드는 고형 종양을 모방하는 관련 모델이다. (A)스페로이드는 다른 영역을 가진 둥근 3D 구조로. (a)P3 스페로이드의 밝은 필드 그림은 조밀한 중앙 영역과 둥근 모양을 보여줍니다. 스케일 = 100 μm.(b)히르쉐이저 등에서 적응된 개략적표현은 6은 스페로이드에서O2,CO2,대사산물 및 카타볼라이트 구배를 나타낸다. (c)왼쪽 패널: DAPI(파란색)로 염색된 스페로이드의 공초점 사진과 카르박딕 아히드라아제 IX(녹색)에 대한 항체를 갖는다. 오른쪽 패널: 파선 영역에서 형광의 정량화. 스케일 = 100 μm.(B)묘사 된 미토콘드리아 (파선)가있는 전자 현미경 이미지. 큰 미토콘드리아는 증식 지역에서 더 작은 동안 정지 지역에서 보입니다. 배율 = 250 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전체 스페로이드 준비 단계. (A)인간 P3 아교모세포종 스페로이드 의 생성. 대표 이미지는 왼쪽 패널에 있고 오른쪽 패널의 해당 증식 분석이 있습니다. 24 시간에서, P3 세포는 조밀한 스페로이드를 형성했습니다. 초기 세포 수는 스페로이드의 크기를 결정했습니다. 스케일 바 = 250 μm.(B)증식, 침략 또는 이주를 연구하기 위한 쉬운 프로토콜의 개략적 그림. 다양한 조건하에서 스페로이드:(a)종양 성장을 위한 무혈청 배지에서,(b)단일 세포 침입을 용이하게 하기 위한 콜라겐 매트릭스에서, 및(c)세포 이동을 위한 마트리겔 코팅에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 피지 소프트웨어로 시험관내 분석법의 정량화. 피지를 사용하여 얻은 관심 지역(ROI)의 표현입니다. 코어 영역은 빨간색으로 표시되고 핵심 영역을 포함하는 총 영역은 노란색으로 표시됩니다. 침습 적 영역은 코어 영역에서 전체 영역의 빼기에 해당합니다. (A)증식 분석. (B)콜라겐 겔의 침입 분석에서 브라이트필드 획득. (C)형광 획득에 의한 마트리겔 코팅에 대한 마이그레이션 분석. 핵은 DAPI로 염색하였고, 파란색으로 염색되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 교모세포종 P3 스페로이드 증식, 침략, 또는 이주 검문. (A)증식 분석. 좌측 패널: DMSO를 대조군으로 하거나 20 μM의 로테네(호흡사슬 복합체 I 억제제)를 시간 0 또는 72시간시에 가진 대표적인 사진. 오른쪽 패널: 이미지에서 파선으로 표시되는 스페로이드 영역 정량화. 척도 = 250 μm.(B)콜라겐 매트릭스의 침입 분석. 왼쪽 패널: 0 또는 24 시간 시 20 mM 염화수소유무에 관계없이 대표적인 사진. 오른쪽 패널: 침습 영역의 정량화. 스케일 = 100 μm.(C)마트리겔 코팅에 대한 이동 분석. 왼쪽 패널: 0 시간 또는 24시간 의 밝은 필드 모드의 대표 이미지가 하단 패널에 표시됩니다. 오른쪽 패널: 철새 영역의 정량화. 스케일 = 250 μm.(D)Z-스택 표현에서 스페로이드(40 μm 단계)에서(a)스페로이드 동적 추적18시간(3시간 간격을 가진 이미지)에서(b).b 세포는 안정적으로 핵 mCherry (주황색) 및 세포질 GFP (청색)를 발현하였다. 배율 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: P3 스페로이드 다이내믹이 18시간 이상 기록되었습니다(30분마다 이미지 화). 배율 막대 = 100 μm. 이 동영상은 시간이 지남에 따라 병합된 Z-스택을 5 μm의 Z-스텝으로 대략 150 μm의 총 부피에 대해 나타내며, 세포는 NLS:mCherry(핵은 주황색) 및 세포질 GFP(청색)를 발현하기 위해 렌티바이러스에 감염되었다. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
보충 문서 1: 3D 스페로이드의 침략, 증식 및 마이그레이션을 분석하기 위한 피지 매크로. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
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Discussion
종양 스페로이드 세포 반응은 세포 사멸 및 약물 반응뿐만 아니라 증식, 침습 및 이동을 포함한 종양 특성을 연구하기 위해 잘 적응된다. 암세포는 그림 4B,C에서볼 수 있듯이 침습성 미세 종양을 형성하는 3D 매트릭스를 침범합니다. 침습 적 과정 동안, 매트릭스 금속 단백질 효소 (MMP) 종양 세포(13)및 MMP 억제제 (예를 들어, GM6001 또는 Rebimastat)를 둘러싼 다이제스트 매트릭스는 세포 침략을 손상시킬 수 있지만 이동(14). 이주와 침략은 우리의 스페로이드 분석에서 공부될 수 있는 겹치지 만 별도의 분자 사건15를관련시킵니다. 이렇게 하기 위하여는, 특정 신호 통로는 유전 수준에서 또는 약리학적인 금지를 통해 표적으로 할 수 있습니다.
교모세포종은 다른 과정(예를 들어, 공동 옵션, 백색 물질 관부 침략, 간질 침입)에 의해 주변 조직을 광범위하게 침범하는 것으로 알려져있다 16. 우리는 최근에 교모 세포종 침공9,,12,,17의두 가지 새로운 메커니즘을 설명했다. 특히, 우리는 수학세포 혈전폰딘-1(TSP1)을 연구하고 종양세포(12)에서CD47의 활성화를 통해 종양 세포 침범에 관여하는 것으로 나타났다. 또한, proteomic 접근 방식을 사용하여, 우리는 GBM 침공17에서PLP1과 DNM1의 예기치 않은 역할을 발견했다. 이러한 연구에서, 3D 침략 분석제는 TSP1, PLP1, 또는 DNM1의 약리학적 방해유무에 관계없이 성공적으로 사용되었다. 약리학적 인 폐색 외에도 염화수소로의 산성 처리가 3D 분석의 침입에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 종양 산증은 대사 경로(glycolysis), TGFβ로서의 성장 인자를 포함하는 다수의 신호화 경로를 활성화시키고, 면역 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다5.
3차원 배양은 2D 배양보다 더 생리학적으로 관련된 환경을 제공하며, 많은 분자 및 대사 파라미터가 다르게 조절될 수 있다. 따라서, 약리학적 변조는 상이한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 표준 면역 성 교학외에, 신진 대사 사건은 또한 2-DG-IR와 같은 탐사선을 사용하여 3D 문화에서 공부될 수 있습니다. 이러한 발견을 확증하기 위해, 전자 수송 사슬 복합제 I 억제제는 또한 이러한 맥락에서 사용될 수 있다.
또한, 3D 배양 시스템은 기저 조건 하에서 또는 자극 또는 약리학적 단서가 있는 경우에 살아있는 화상 진찰을 사용하여 동적 프로세스의 연구 결과에 또한 적합합니다.
이 문서에 설명 된 절차를 수행 할 때 다음과 같은 중요한 단계를 고려해야합니다 : 1) 괴사를 피하기 위해 스페로이드 직경이 400 μm를 초과해서는 안됩니다. 2) 피지 소프트웨어를 사용하여 침략의 정량화는 신중하게 교정하고 절차의 자세한 설명에 표시된 대로 수행해야합니다.; 3) 겔 강성은 스페로이드를 안정된 구성으로 유지하는 데 적합해야 합니다. 4) 매우 산성 pH가 침입 과정을 방해하기 때문에 pH 값을 제어해야합니다.
이 문서에서 설명하는 스페로이드 시스템의 한 가지 제한은 완전한 종양 미세 환경의 부족입니다. 우리는 사용된 매트릭스가 교모세포종에서 발견되는 기질을 완전히 나타내지 않는다는 것을 인정합니다. 그러나 콜라겐은 뇌 매트릭스의 일부이며 모든 실험실에서 사용할 수 있는 즉시 사용하기 쉬운 분석방법을 개발하고자 했습니다. 그럼에도 불구하고, 향후 실험은 또한 기질 및 면역 세포를 포함한 세포 성분뿐만 아니라 추가적인 매트릭스 성분을 포함할 수 있다. 복잡성의 또 다른 수준은 신경 성분의 포함, 하지만 이러한 실험 신중 하 게 교정 하 고 설계 해야 합니다.
결론적으로, 우리는 우리의 spheroid 3D 시스템과 우리가이 문서에서 제공하는 분석 도구가 특히 뇌종양 발달을 공부에, 조사자에게 유용 할 수 있다고 생각합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 트랜스 칸 에 의해 지원되었다 2017, ARC 2017, 리그 콘트르 르 암 (코미테 드 라 지롱드 에 드 라 샤랑테 - 해양). 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원 (CHU 툴루즈)에서 펠로우십의 수혜자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
References
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