Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En 3D Spheroid modell for Glioblastoma

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

Her beskriver vi en brukervennlig invasjonsanalyse for glioblastom. Denne analysen er egnet for glioblastom stamceller. En Fiji-makro for enkel kvantifisering av invasjon, migrasjon og spredning er også beskrevet.

Abstract

Todimensjonale (2D) cellekulturer etterligner ikke in vivo tumorvekst tilfredsstillende. Derfor ble tredimensjonale (3D) kultur spheroid modeller utviklet. Disse modellene kan være spesielt viktige innen nevro-onkologi. Faktisk har hjernesvulster tendensen til å invadere det sunne hjernemiljøet. Vi beskriver her i en ideell 3D glioblastoma spheroid-basert analyse som vi utviklet for å studere tumorinvasjon. Vi tilbyr alle tekniske detaljer og analytiske verktøy for å utføre denne analysen.

Introduction

I de fleste studier ved hjelp av primære eller kommersielt tilgjengelige cellelinjer, utføres analyser på celler dyrket på plastoverflater som monolayer kulturer. Håndtering av cellekultur i 2D representerer ulemper, da det ikke etterligner et in vivo 3D-cellemiljø. I 2D-kulturer er hele celleoverflaten direkte i kontakt med mediet, endrer cellevekst og endrer tilgjengeligheten av legemidler. Videre utløser den ikkefysiologiske plastoverflaten celledifferensiering1. Tredimensjonale kulturmodeller er utviklet for å overvinne disse vanskelighetene. De har fordelen av å etterligne multicellulær arkitektur og heterogenitet av svulster2, og dermed kan betraktes som en mer relevant modell for solide svulster3. Den komplekse morfologien av spheroider bidrar til bedre å evaluere narkotika penetrance og motstand4. Tumorheterogeniteten i spheroid påvirker spredningen av oksygen og næringsstoffer, og responsen på farmakologiske midler (figur 1A). Diffusjon av oksygen endres når spheroidstørrelsen når 300 μm, noe som induserer et hypoksisk miljø i midten av spheroid (Figur 1A, C). Metabolitter er også mindre gjennomtrengende gjennom cellelagene og kompenserende metabolske reaksjoner finner sted5. Når diameteren av spheroid øker, nekrotiske kjerner kan observeres, ytterligere etterligne egenskaper som finnes i mange faste kreftformer, inkludert aggressiv hjernekreft glioblastom (GBM)6.

Flere 2D- eller 3D-invasjonsanalyser for glioblastom er rapportert i litteraturen7,8. Todimensjonale analyser er hovedsakelig for å studere invasjon i et horisontalt plan på et tynt matriselag eller i en Boyden kammeranalyse9. Tredimensjonale analyser har blitt beskrevet med 3D spheroid kulturer ved hjelp av klassiske glioblastom celle linjer10. Mer komplekse varianter er representert ved invasjon av hjerneorganoider av tumorspheroider i konfrontasjonskulturer11. Det er imidlertid fortsatt viktig å utvikle en brukervennlig og reproduserbar analyse tilgjengelig for alle laboratorier. Vi har utviklet en protokoll for å generere glioblastom stamceller fra pasientprøver. Kvantifiseringen av disse analyserene er lett håndterbar og krever bare åpen tilgang online programvare. Kort, tumor stykker er kuttet i små biter og enzymatically fordøyd. Enkeltceller avledet fra fordøyelsen dyrkes i nevrobasalmedium. Etter 4-7 dager dannes spheroidstrukturer spontant. Ved intrakraniell implantasjon hos musmodeller danner de svulster som viser en nekrotisk kjerne omgitt av pseudo-palisading celler12. Dette ligner på egenskapene som finnes hos GBM-pasienter.

I denne artikkelen beskriver vi vår protokoll for å produsere spheroider fra et bestemt antall celler for å sikre reproduserbarhet. To komplementære matriser kan brukes til dette formålet: Matrigel og kollagen type I. Matrigel er beriket i vekstfaktorer og etterligner pattedyr basalmembranen som kreves for cellevedlegg og migrasjon. På den annen side er kollagen type I, et strukturelt element av stroma, den vanligste flimmerlcellede, ekstracellulære matrisen og brukes i celleinvasjonsanalyser. Her illustrerer vi vår GBM spheroid-modell ved å utføre migrerings- og spredningsanalyser. Analyse ble gjort ikke bare på faste tidspunkter, men også ved å overvåke spheroid ekspansjon og cellebevegelse ved live imaging. Videre ble elektronmikroskopi gjort for å visualisere morfologiske detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter (fra Haukeland sykehus, Bergen, Norge i henhold til lokale etiske utvalgsforskrifter). Vår protokoll følger retningslinjene i institusjonens etikkkomité for menneskelig forskning.

1. Generasjon av ensartet størrelse tumor spheroids

MERK: Stamceller dyrkes i nevrobasalmedium supplert med B27 supplement, heparin, FGF-2, penicillin, og streptomycin, som beskrevet i tidligere artikler12. Disse cellene danner spontant spheroider i kultur.

  1. Vask tumorcellene med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og inkuber cellene med 0,5-1 ml dissosiasjonsenzymet (se materialtabellen) i 5 minutter ved 37 °C.
  2. Vask med 4-4,5 ml PBS og tilsett 10 ml av hele vekstmediet (komplett nevrobasalmedium, cNBM).
  3. Tell cellene ved hjelp av en automatisk telleteknikk med trypan blå og et celletellingskammerlysbilde.
  4. For å generere 100 spheroider med 104 celler per spheroid (i henhold til foretrukket størrelse), bland 106 celler i 8 ml NBM med 2 ml 2% metylcellulose.
  5. Overfør fjæringen til en steril systembeholder og dispenser 100 μL/brønn med en flerkanals pipette til en 96 godt rund bunnplate.
  6. Inkuber platen ved 37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet. Like store spheroider vil danne og kan brukes etter 3-4 dager.

2. Tredimensjonale eksperimenter

  1. Spredning
    1. Forberedelse
      1. Suspender hemmere (f.eks. rotenon som i figur 4A)og kjemikalier i 100 μL medium og legg til 100 μL medium i hver brønn (dvs. en spheroid per brønn).
      2. Inkuber platen ved 37 °C, 5 % CO2og 95 % fuktighet.
    2. Bildeoppkjøp og analyse
      1. Ta bilder med et videomikroskop i brightfield for å skape en rekke forhold på T0 og følgende tider forventet.
      2. Bruk Fiji til å analysere bilder enten manuelt eller på en halvautomatisk måte. For å gjøre dette manuelt, tegne en sirkel rundt spheroid kjernen med frihåndsmarkeringsverktøyet og måle området for hver spheroid. Hvis du vil analysere bildene på en halvautomatisk måte, bruker du makroen som vises i tilleggsdokument 1 med //Core Area only.
  2. Invasjonen
    1. Forberedelse
      1. Forbered kollagenmatrisen i et rør på is med type I kollagen ved 1 mg/ml endelig konsentrasjon, 1x PBS, 0,023xVkollagen,1 M natriumhydroksid og steril H2O. Inkuber løsningen på is i 30 min.
      2. Samle spheroider fra den runde bunnbrønnplaten i 500 μL rør og vask 2x med 200 μL 1x PBS.
      3. Pipette spheroids nøye i 100 μL av kollagen matrisen og sett inn i midten av en brønn i normale 96 brønnplater.
      4. Inkuber kollagengelen i 30 min ved 37 °C og tilsett deretter cNBM på toppen av gelen. Inhibitorer eller aktivatorer (f.eks. hydrogenklorid som vist i figur 4B, 4C)kan legges til mediet på dette trinnet.
    2. Bildeoppkjøp og analyse
      1. Ta bilder sekvensielt med et videomikroskop i brightfield-modus 24 timer etter kollageninkludering.
      2. Bruk Fiji til å analysere bilder enten manuelt eller på en halvautomatisk måte. For å gjøre dette manuelt, tegne rundt kjernen og det totale arealet av spheroid med frihåndsmarkeringsverktøyet og måle det invasive området for hver spheroid ved å trekke det totale arealet med kjerneområdet. Hvis du vil analysere bildene på en halvautomatisk måte, bruker du makroen som angitt i tilleggsdokument 1 til å bestemme det invasive området.
  3. Migrasjon
    1. Forberedelse
      1. Coat en 6 brønnplate med Matrigel (0,2 mg/ ml) i NBM i 30 min ved 37 °C, fjern deretter Matrigel og tilsett 2 ml cNBM.
      2. Overfør spheroider til 50 μL cNBM fra den runde bunnbrønnplaten til 6 brønnplaten.
      3. Inkuber platen ved 37 °C og vent 30 minutter til spheroidene holder seg.
      4. Etter 24 timer inkubasjon, flekk med 10 ng/ml Hoechst og inkuber30 min ved 37 °C.
    2. Bildeoppkjøp og analyse
      1. Få bilder ved hjelp av et videomikroskop i brightfield. En 405 nm laser brukes til visualisering av Hoechst farging.
      2. Bruk Fiji-programvare til å analysere bilder og kjøre makroen som angitt i tilleggsdokument 1.
        MERK: Berøring av bunnen av brønnen eller fullstendig fjerning av supernatanten skader spheroidene. For kollagen type I gel håndtering, hold gelen på is for å unngå kollagen polymerisering, ikke legg til en sur komponent fordi endringen i pH vil påvirke kompaktheten av gelen, og pipetteceller raskt inn i kollagen for å forhindre celledød og nedbrytning av gelen.

3. Fiji Makro

MERK: Fiji er et bildeanalyseprogram utviklet i det offentlige rom som gjør det mulig for utviklingen av makroer å øke hastigheten på bildeanalyse. Manuell analyse er også mulig, men dette er en langsom prosess og kan introdusere skjevheter. Bilder kan importeres ved å dra og slippe i programvaren og kvantifiseres med ROI Manager Tools plugin. Prosedyren som brukes i denne studien er beskrevet nedenfor:

  1. Åpne makrovinduet: Plugins | Makroer | Interaktiv tolk.
  2. Kopier og lim inn følgende tilpassede lilla sløyfe. Behold de lilla setningene og legg til de grønne setningene av interesse (Tilleggsdokument 1).
  3. Hvis du vil analysere hele serien, justerer du parameterne i rødt for en bestemt kvantifisering og kjører makroen ved hjelp av makroer | Kjør makro eller trykk CTRL+R.
  4. Kontroller og, om nødvendig, manuelt tilpasse regionen av interesse (ROI).

4. Elektronmikroskopi av spheroider

MERK: De fleste av følgende trinnene må gjøres i en kjemisk hette.

  1. Fixation trinn
    1. Samle spheroid med en kuttet pipette spiss, sette den i et 1,5 ml rør, og vask 1x med 0,1 M fosfat buffer (PB).
    2. Fest spheroid over natten ved 4 °C i 2 % glutaraldehyd/2 % paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB.
    3. Erstatt fikseringsløsningen med en løsning på 1 % PFA i 0,1 M PB etterfulgt av prøvetilberedning.
  2. Prøve forberedelse
    1. Overfør spheroidene til en sil og legg dem i et glassbeger for å unngå spheroidskade.
    2. Vask forsiktig 3x med 0,1 M PB.
    3. Inkuber med osmium for 2 timer i mørket. Fortynn osmium til 4 % i 1 % 0,1 M PB-buffer.
    4. Vask forsiktig 3x med 0,1 M PB.
      1. Dehydrere som følger: suge i 50% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, 2x 90% etanol i 15 min, 2x 100% etanol i 20 min, og 2x aceton i 30 min.
    5. Inkuber prøvene i en 50/50 blanding av aceton /harpiks i 2 timer. I løpet av dette trinnet, forberede EPON harpiks (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; I 1999 ble det avgitt en 000 000 000 000 000 0
    6. Kast aceton/harpiksblandingen, erstatt med nylaget harpiks og inkuber over natten.
    7. Bytt harpiksen med en ny og inkuber mellom 2-6 h.
    8. Tilsett spheroider i harpiks i en mugg ved 60 °C i 48-72 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spheroider ble utarbeidet som beskrevet i protokollseksjonen og observasjoner ble gjort om migrasjon, invasjon, spredning og mikroskopi. For å måle hypoksi i forskjellige områder av sfærisk struktur, ble karboksanhydrase IX farging brukt til å bestemme hypoksisk aktivitet (Figur 1A-C). Flere CAIX-positive celler ble observert i spheroidsenteret (figur 1A-C). Hypoksiske celler som ligger i spheroidkjernen har en tendens til å være mer glykolytisk enn de omkringliggende. Mitokondrier kan avbildes for ytterligere analyser som vist ved elektronmikroskopi (Figur 1Ba-1Bb). Spheroider bestående av 2,5 x 103,5 x 103,104eller 2 x 104 celler viser en spheroid diameter på henholdsvis ca. 350, 400, 500 eller 650 μm (figur 2A). Spheroider kan brukes innen 4 dager etter at eksperimentet er startet (figur 2B). Kvantifiseringen av hver analyse (dvs. spredning, invasjon, migrasjon) vises i figur 3. Fiji-makroer ble utviklet for å kvantifisere spredning, invasjon eller migrasjon (Figur 3 og supplerende dokument 1).

Økningen av spheroid kjerne reflekterte stimulering av cellespredning (Figur 4A). Ved hemming av rotenon, en etablert hemmer av kompleks I av mitokondrierespiratorisk kjeden, ble det store flertallet av ATP-produksjonen i mitokondriene kompromittert. Som en konsekvens ble spredning redusert med 20% etter 72 timer (Figur 4A). Invasjon av kollagen type Jeg ble beregnet av subtraksjon av det totale området fra kjerneområdet. Sur behandling forbedret invasjon over en periode på 24 timer (Figur 4B). Videre fant vi at hydrogenkloridbehandling reduserte migrerende området av spheroidene med 1,5 ganger sammenlignet med kontroll (figur 4C). Spheroid dynamikk ble studert ved montering for live imaging i UniverSlide13. Spheroids hadde høy intern dynamikk og beveget seg raskt (Film 1 og sporing analyse i figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Spheroid er en relevant modell for å etterligne solide svulster. (A) Spheroid som en rund 3D struktur med ulike områder. (a) Et brightfield bilde av en P3 spheroid viser et rundt utseende med et tett sentralt område. Skala = 100 μm. (b) Skjematisk representasjon tilpasset fra Hirschhaeuser et al.6 viser O2,CO2,metabolitter og katabolittgradienter i spheroid. (c) Venstre panel: konfokal bilde av en spheroid farget med DAPI (blå) og med antistoffer mot karboksanhydrase IX (grønn). Høyre panel: kvantifisering av fluorescens fra det stiplede området. Skala = 100 μm. (B) Elektronmikroskopibilder med avgrensede mitokondrier (stiplede linjer). Store mitokondrier er sett i quiescentarea mens de er mindre i spredningsområdet. Skala = 250 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Generelle trinn for spheroidforberedelse. (A) Generasjon av humane P3 glioblastomspheroider. Representative bilder er på venstre panel og tilsvarende spredningsanalyse på høyre panel. Ved 24 timer dannet P3-cellene tette spheroider. Det første antallet celler fastslått størrelsen på spheroider. Skalabar = 250 μm. (B) Skjematisk illustrasjon av de enkle protokollene for å studere spredning, invasjon eller migrasjon. Spheroider under ulike forhold: (a) I serumfritt medium for tumorvekst, (b) I kollagenmatrise for å lette encellede invasjon, og (c) På Matrigel belegg for cellemigrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvantifisering av in vitro analyser med Fiji-programvare. Representasjon av regionene av interesse (ROI) oppnådd ved hjelp av Fiji. Kjerneområdet er representert i rødt og det totale arealet, som inneholder kjerneområdet, i gult. Det invasive området tilsvarer subtraksjonen av det totale arealet fra kjerneområdet. (A) Proliferation analyse. (B) Invasjonsanalyse i kollagengel i brightfield oppkjøp. (C) Migrasjonsanalyse på Matrigel belegg ved fluorescens oppkjøp. Nuclei ble farget med DAPI, i blått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: GlioblastomP3 spheroid i spredning, invasjon eller migrasjon analyser. (A) Proliferation analyse. Venstre panel: Representative bilder med DMSO som kontroll eller med 20 μM rotenon (respiratorisk kjedekompleks I-hemmer) på tid 0 eller 72 timer. Høyre panel: Spheroid område kvantifisering representert som stiplede linjer i bildene. Skala = 250 μm. (B) Invasjonsanalyse i kollagenmatrise. Venstre panel: Representative bilder med eller uten 20 mM hydrogenklorid, på tid 0 eller 24 timer. Høyre panel: Kvantifisering av invasive områder. Skala = 100 μm. (C) Migreringsanalyse på Matrigel belegg. Venstre panel: Representative bilder i brightfield-modus på tid 0 eller 24 timer. Forstørrede områder er representert i de nederste panelene. Høyre panel: Kvantifisering av trekkområder. Skala = 250 μm. (D) Z-stack representasjon av spheroid (40 μm trinn) i (a) spheroid dynamisk sporet over 18 timer (bilde med 3 t intervall) i (b). Celler stabilt uttrykt kjernefysiskmCherry (oransje) og cytoplasmatisk GFP (blå). Skala = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Movie 1
Film 1: P3 spheroid dynamisk innspilt over 18 timer (avbildet hver 30 min). Skalabar = 100 μm. Filmen representerer en fusjonert Z-stack over tid med et Z-trinn på 5 μm for et omtrentlig totalt volum på 150 μm. Celler ble infisert med lentivirus for å uttrykke NLS:mCherry (kjerner er oransje) og med cytoplasmatisk GFP (blå farge). Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Supplerende dokument 1: Fiji-makro for analyse av invasjon, spredning og migrering av 3D-spheroid. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tumor spheroid analyser er godt tilpasset å studere tumor egenskaper inkludert spredning, invasjon, og migrasjon, samt celle død og narkotika respons. Kreftceller invaderer 3D-matrisen som danner en invasiv mikrotumor, sett i figur 4B, C. Under den invasive prosessen kan matrisemetalloproteinaser (MMP) fordøye matriser rundt tumorceller13, og MMP-hemmere (f.eks. GM6001 eller Rebimastat) svekke celleinvasjon, men ikke migrasjon14. Migrasjon og invasjon involverer overlappende, men separate molekylære hendelser15, som kan studeres i vår spheroid analyse. For å gjøre dette kan spesifikke signalveier målrettes enten på genetisk nivå eller gjennom farmakologisk hemming.

Glioblastomer er kjent for å i stor grad invadere de omkringliggende vevene ved forskjellige prosesser (f.eks. medopsjon, hvit materie-invasjon, interstitiell invasjon)16. Vi har nylig beskrevet to nye mekanismer for glioblastom invasjon9,12,17. Spesielt studerte vi matricellulære tromboemspondin-1 (TSP1) og viste at det er involvert i tumorcelleinvasjon gjennom aktivering av CD47 i tumorceller12. Videre, ved hjelp av en proteomisk tilnærming, oppdaget vi den uventede rollen som PLP1 og DNM1 i GBM invasjon17. I disse studiene ble 3D-invasjonsanalyser vellykket brukt med eller uten farmakologisk obstruksjon av TSP1, PLP1 eller DNM1. Foruten farmakologisk obstruksjon viste vi også at syrebehandling med hydrogenklorid påvirker invasjonen i 3D-analysen. Det er kjent at tumoracidose aktiverer en rekke signalveier, inkludert metabolske veier (glykolyse), vekstfaktorer som TGFβ, og hemmer immunresponsen5.

Tredimensjonale kulturer gir et mer fysiologisk relevant miljø enn 2D-kulturer, og mange molekylære og metabolske parametere kan være forskjellig regulert. Dermed kan farmakologisk modulering ha en annen innvirkning. Følgelig, i tillegg til standard immunhistologi, metabolske hendelser kan også studeres i 3D-kultur ved hjelp av sonder som 2-DG-IR. For å bekrefte disse funnene kan elektrontransportkjedekomplekset I-hemmeren også brukes i denne sammenhengen.

I tillegg er 3D-kultursystemet også godt egnet til studiet av dynamiske prosesser ved hjelp av levende avbildning under basalforhold eller i nærvær av stimuli eller farmakologiske signaler.

Følgende kritiske trinn bør vurderes når du utfører prosedyrene som er beskrevet i denne artikkelen: 1) Spheroid diameter bør ikke overstige 400 μm for å unngå nekrose; 2) Kvantifiseringen av invasjon ved hjelp av Fiji-programvare må være nøye kalibrert og utført som angitt i den detaljerte beskrivelsen av prosedyren.; 3) Gelstivheten må være egnet til å holde spheroid i en stabil konfigurasjon; 4) PH-verdien må kontrolleres, da en svært sur pH vil hindre invasjonsprosessen.

En begrensning av spheroid systemet beskrevet i denne artikkelen er mangelen på hele tumor mikromiljø. Vi erkjenner at matrisen som brukes ikke fullt ut representerer stroma funnet i glioblastom. Collagens er imidlertid en del av hjernematrisen, og vi ønsket å utvikle en klar og brukervennlig analyse som kan brukes i alle laboratorier. Likevel kan fremtidige eksperimenter også omfatte flere matrisekomponenter samt cellulære elementer, inkludert stromale og immunceller. Et annet nivå av kompleksitet er inkludering av nevronale komponenter, men disse eksperimentene må kalibreres nøye og utformes.

Til slutt tror vi at vårt spheroid 3D-system og de analytiske verktøyene vi gir i denne artikkelen, kan være nyttige for forskere, spesielt i å studere hjernesvulstutvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon er mottaker av fellesskap fra Toulouse Universitetssykehus (CHU Toulouse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

Kreftforskning Utgave 158 glioblastom pasientavledet celle spheroid invasjon migrasjon spredning in vitro-modeller
En 3D Spheroid modell for Glioblastoma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter