Summary
Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.
Abstract
Culturas celulares bidimensionais (2D) não imitam o crescimento do tumor in vivo de forma satisfatória. Assim, foram desenvolvidos modelos esferóides de cultura tridimensional (3D). Esses modelos podem ser particularmente importantes no campo da neuro-oncologia. De fato, tumores cerebrais têm a tendência de invadir o ambiente cerebral saudável. Descrevemos aqui em um ensaio 3D baseado em glioblastoma baseado em esferóide sheroide que desenvolvemos para estudar a invasão de tumores. Fornecemos todos os detalhes técnicos e ferramentas analíticas para realizar este ensaio com sucesso.
Introduction
Na maioria dos estudos usando linhas celulares primárias ou comercialmente disponíveis, os ensaios são realizados em células cultivadas em superfícies plásticas como culturas de monocamada. Gerenciar a cultura celular em 2D representa desvantagens, pois não imita um ambiente celular in vivo 3D. Em culturas 2D, toda a superfície celular está diretamente em contato com o meio, alterando o crescimento celular e modificando a disponibilidade de medicamentos. Além disso, a superfície plástica não fisiológica desencadeia a diferenciação celular1. Modelos de cultura tridimensional foram desenvolvidos para superar essas dificuldades. Eles têm a vantagem de imitar a arquitetura multicelular e a heterogeneidade dos tumores2, e, portanto, poderiam ser considerados um modelo mais relevante para tumores sólidos3. A morfologia complexa dos esferóides contribui para avaliar melhor a penetração e resistência da droga4. A heterogeneidade tumoral no esferóide impacta a difusão de oxigênio e nutrientes, e a resposta aos agentes farmacológicos (Figura 1A). A difusão de oxigênio é alterada quando o tamanho esferoide atinge 300 μm, induzindo um ambiente hipóxico no centro do esferóide(Figura 1A,C). Os metabólitos também são menos penetrantes através das camadas celulares e as reações metabólicas compensatórias ocorrem5. Quando o diâmetro do esferóide aumenta, núcleos necrosados podem ser observados, imitando ainda mais características encontradas em muitos cânceres sólidos, incluindo o agressivo glioblastoma de câncer cerebral (GBM)6.
Vários ensaios de invasão 2D ou 3D para glioblastoma foram relatados na literatura7,8. Ensaios bidimensionais são principalmente para estudar a invasão em um plano horizontal em uma fina camada de matriz ou em um ensaio de câmara de Boyden9. Ensaios tridimensionais foram descritos com culturas esferóides 3D usando linhas celulares glioblastoma clássicas10. Variantes mais complexas são representadas pela invasão de organóides cerebrais por esferóides tumorais em culturas de confronto11. No entanto, ainda é importante desenvolver um ensaio fácil de usar e reprodutível disponível para qualquer laboratório. Desenvolvemos um protocolo para gerar células-tronco de glioblastoma a partir de amostras de pacientes. A quantificação desses ensaios é facilmente gerenciável e requer apenas software on-line de acesso aberto. Resumidamente, os pedaços do tumor são cortados em pequenos pedaços e digeridos enzimticamente. As células únicas derivadas da digestão são cultivadas em meio neurobasal. Após 4-7 dias, estruturas esferóides formam-se espontaneamente. Após a implantação intracraniana em modelos de camundongos, formam tumores exibindo um núcleo necrosado cercado por células pseudo-palisading12. Isso se assemelha muito às características encontradas em pacientes GBM.
Neste artigo, descrevemos nosso protocolo de produção de esferóides a partir de um determinado número de células para garantir a reprodutibilidade. Duas matrizes complementares podem ser utilizadas para este fim: Matrigel e colágeno tipo I. Matrigel é enriquecido em fatores de crescimento e imita a membrana basal mamífera necessária para o apego celular e migração. Por outro lado, o colágeno tipo I, um elemento estrutural do estroma, é a matriz extracelular fibriária mais comum e é usado em ensaios de invasão celular. Aqui, ilustramos nosso modelo esferóide GBM realizando ensaios de migração e proliferação. A análise foi feita não apenas em pontos de tempo fixo, mas também por monitoramento da expansão esferóide e movimento celular por imagem ao vivo. Além disso, a microscopia eletrônica foi feita para visualizar detalhes morfológicos.
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Protocol
O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com as regulamentações do comitê de ética local). Nosso protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.
1. Geração de esferóides tumorais de tamanho uniforme
NOTA: As células-tronco são cultivadas em meio neurobasal complementado com suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito nos artigos anteriores12. Essas células formam espontaneamente esferóides na cultura.
- Lave as células tumorais com soro torário tamponado de 5 mL (PBS) e incubar as células com enzima de dissociação de 0,5-1 mL (ver Tabela de Materiais) por 5 minutos a 37 °C.
- Lave com PBS de 4-4,5 mL e adicione 10 mL do meio de crescimento completo (meio neurobasal completo, cNBM).
- Conte as células usando uma técnica de contagem automática com trypan azul e um slide de câmara de contagem de células.
- Para gerar 100 esferóides com 104 células por esferoide (de acordo com o tamanho preferencial), misture 106 células em 8 mL de NBM com 2 mL de 2% de metilcelulose.
- Transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril e dispense 100 μL/poço com uma pipeta multicanal em uma placa inferior redonda de 96.
- Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade. Esferóides de tamanho igual formarão e poderão ser usados após 3-4 dias.
2. Experimentos tridimensionais
- Proliferação
- Preparação
- Suspender inibidores (por exemplo, rotenona como na Figura 4A) e produtos químicos em 100 μL de médio e adicionar aos 100 μL de meio em cada poço (ou seja, um esferoide por poço).
- Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2e 95% de umidade.
- Aquisição e análise de imagens
- Tire fotos com um microscópio de vídeo em brightfield para criar uma série de condições em T0 e os seguintes tempos esperados.
- Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe um círculo em torno do núcleo esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área de cada esferóide. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, use a macro mostrada no Documento Complementar 1 apenas com área //Núcleo.
- Preparação
- Invasão
- Preparação
- Prepare a matriz de colágeno em um tubo no gelo com colágeno tipo I a 1 mg/mL de concentração final, 1x PBS, 0,023xVde colágeno,1 M de hidróxido de sódio e H2O. Estéreo Incubar a solução no gelo por 30 min.
- Coletar esferóides da placa do poço de fundo redondo em tubos de 500 μL e lavar 2x com 200 μL 1x PBS.
- Pipa os esferóides cuidadosamente em 100 μL da matriz de colágeno e inserir no centro de um poço em 96 placas normais de poço.
- Incubar o gel de colágeno por 30 min a 37 °C e, em seguida, adicionar cNBM em cima do gel. Inibidores ou ativadores (por exemplo, cloreto de hidrogênio como mostrado na Figura 4B, 4C) podem ser adicionados ao meio nesta etapa.
- Aquisição e análise de imagens
- Tire fotos sequencialmente com um microscópio de vídeo no modo brightfield 24 h após a inclusão de colágeno.
- Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe ao redor do núcleo e da área total do esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área invasiva de cada esferóide subtraia a área total com a área central. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, utilize a macro conforme indicado no Documento Complementar 1 para determinar a área invasiva.
- Preparação
- Migração
- Preparação
- Cubra uma placa de 6 poços com Matrigel (0,2 mg/mL) em NBM por 30 min a 37 °C, depois retire o Matrigel e adicione 2 mL de cNBM.
- Transfira os esferóides para 50 μL de cNBM da placa do poço de fundo redondo para a placa de 6 poços.
- Incubar a placa a 37 °C e esperar 30 min para que os esferóides aderem.
- Após 24 h de incubação, manche com 10 ng/mL de Hoechst e incubação de 30 min a 37 °C.
- Aquisição e análise de imagens
- Obter imagens usando um microscópio de vídeo em brightfield. Um laser de 405 nm é usado para visualização da coloração de Hoechst.
- Use o software Fiji para analisar imagens e executar a macro conforme indicado no Documento Complementar 1.
NOTA: Tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o sobrenadante danifica os esferóides. Para o manuseio de gel tipo colágeno I, mantenha o gel no gelo para evitar a polimerização do colágeno, não adicione um componente ácido porque a mudança no pH afetará a compactação do gel, e as células de pipeta rapidamente no colágeno para evitar a morte celular e a degradação do gel.
- Preparação
3. Fiji Macro
NOTA: Fiji é um programa de análise de imagens desenvolvido em domínio público que permite o desenvolvimento de macros para acelerar a análise de imagens. A análise manual também é possível, mas este é um processo lento e pode introduzir vieses. As imagens podem ser importadas por arrastar e soltar no software e quantificadas com o plugin ROI Manager Tools. O procedimento utilizado neste estudo é descrito abaixo:
- Abra a janela de macro: Plugins | Macros | Intérprete Interativo.
- Copie e cole o seguinte laço roxo adaptado. Mantenha as frases roxas e adicione as frases verdes de interesse (Documento Complementar 1).
- Para analisar toda a série, ajuste os parâmetros em vermelho para uma quantificação específica e execute a macro usando Macros | Executar macro ou pressionar Ctrl+R.
- Verifique e, se necessário, adapte manualmente a região de interesse (ROI).
4. Microscopia eletrônica de esferóides
NOTA: A maioria das etapas a seguir deve ser feita em uma coifa química.
- Etapa de fixação
- Recolhado o esferóide com uma ponta de pipeta cortada, coloque-o em um tubo de 1,5 mL e lave 1x com tampão de fosfato de 0,1 M (PB).
- Fixar o esferóide durante a noite a 4 °C em 2% de glutaraldeído/2% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M PB.
- Substitua a solução de fixação por uma solução de 1% de PFA em 0,1 M PB seguida de preparação da amostra.
- Preparação da amostra
- Transfira os esferóides para um coador e coloque-os em um copo de vidro, a fim de evitar danos esferóides.
- Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.
- Incubar com ósmio por 2 h no escuro. Diluir o ósmio para 4% em 1% de tampão PB de 0,1 M.
- Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.
- Desidratar da seguinte forma: mergulhe em 50% de etanol por 10 min, 70% de etanol por 10 min, 2x 90% de etanol por 15 min, 2x 100% de etanol por 20 min e 2x de acetona por 30 min.
- Incubar as amostras em uma mistura de acetona/resina 50/50 por 2 h. Durante esta etapa, prepare a resina EPON (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
- Descarte a mistura acetona/resina, substitua por resina recém-preparada e incuba durante a noite.
- Substitua a resina por uma nova e incuba entre 2-6 h.
- Adicione os esferóides na resina em um molde a 60 °C por 48-72 h.
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Representative Results
Os esferóides foram preparados conforme descrito na seção de protocolos e observações foram feitas sobre migração, invasão, proliferação e microscopia. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, utilizou-se a coloração da anidraIX carboxica para determinar a atividade hipóxica(Figura 1A-C). Mais células CAIX positivas foram observadas no centro esferóide (Figura 1A-C). Células hipóxias localizadas no núcleo esferóide tendem a ser mais glicolíticos do que as ao redor. Mitocôndrias podem ser imaginadas para análises posteriores, como mostrado pela microscopia eletrônica (Figura 1Ba-1Bb). Os esferóides compostos por 2,5 x 103, 5 x 103, 104, ou 2 x 104 células apresentam um diâmetro esferóide de cerca de 350, 400, 500 ou 650 μm respectivamente(Figura 2A). Os esferóides podem ser usados dentro de 4 dias após o início do experimento (Figura 2B). A quantificação de cada ensaio (ou seja, proliferação, invasão, migração) é mostrada na Figura 3. As macros de Fiji foram desenvolvidas para quantificar a proliferação, invasão ou migração (Figura 3 e Documento Complementar 1).
O aumento do núcleo esferóide refletiu a estimulação da proliferação celular (Figura 4A). Após a inibição por rotenona, um inibidor estabelecido do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, a grande maioria da produção de ATP nas mitocôndrias foi comprometida. Como conseqüência, a proliferação foi reduzida em 20% após 72 h (Figura 4A). A invasão do tipo colágeno I foi calculada pela subtração da área total da área central. O tratamento ácido aumentou a invasão durante um período de 24 h (Figura 4B). Além disso, verificou-se que o tratamento com cloreto de hidrogênio reduziu a área migratória dos esferóides em 1,5 vezes em comparação com o controle(Figura 4C). A dinâmica esferóide foi estudada pela montagem para imagens ao vivo no UniverSlide13. Os esferóides apresentaram alta dinâmica interna e se moveram rapidamente (Filme 1 e análise de rastreamento na Figura 4D).
Figura 1: O esferóide é um modelo relevante para imitar tumores sólidos. (A) Esferoide como uma estrutura 3D redonda com diferentes áreas. (a) Uma imagem brilhante de um esferóide P3 mostra uma aparência redonda com uma área central densa. Escala = 100 μm.(b) A representação esquemática adaptada de Hirschhaeuser et al.6 mostra os gradientes O2,CO2,metabólitos e catabolite no esferóide. (c) Painel esquerdo: imagem confocal de um esferóide manchado com DAPI (azul) e com anticorpos contra anidria carboxica IX (verde). Painel direito: quantificação da fluorescência da área tracejada. Escala = 100 μm.(B) Imagens de microscopia eletrônica com mitocôndrias delineadas (linhas tracejadas). Grandes mitocôndrias são vistas na área quiescente enquanto são menores na área de proliferação. Escala = 250 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapas gerais de preparação esferóide. (A)Geração de esferoides de glioblastoma P3 humanos. Imagens representativas estão no painel esquerdo e análise de proliferação correspondente no painel direito. Às 24 horas, as células P3 formavam esferóides densos. O número inicial de células determinou o tamanho dos esferóides. Barra de escala = 250 μm.(B) Ilustração esquemática dos protocolos fáceis para estudar proliferação, invasão ou migração. Esferóides sob várias condições: (a) No meio livre de soro para o crescimento do tumor, (b) Na matriz de colágeno para facilitar a invasão de células únicas, e(c) no revestimento de matrigel para migração celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de ensaios in vitro com o software Fiji. Representação das regiões de interesse (ROI) obtidas utilizando Fiji. A área central é representada em vermelho e a área total, que contém a área central, em amarelo. A área invasiva corresponde à subtração da área total da área central. (A)Ensaio de proliferação. (B) Ensaio de invasão em gel de colágeno em aquisições brightfield. (C) Ensaio de migração sobre revestimento de Matrigel por aquisição de fluorescência. Os núcleos foram manchados com DAPI, em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Glioblastoma P3 esferoide em ensaios de proliferação, invasão ou migração. (A)Ensaio de proliferação. Painel esquerdo: Fotos representativas com DMSO como controle ou com 20 μM de rotenona (inibidor do complexo da cadeia respiratória I) no tempo 0 ou 72 h. Painel direito: Quantificação da área esferóide representada como linhas tracejadas nas imagens. Escala = 250 μm.(B) Ensaio de invasão na matriz de colágeno. Painel esquerdo: Fotos representativas com ou sem cloreto de hidrogênio de 20 mM, no tempo 0 ou 24 h. Painel direito: Quantificação de áreas invasoras. Escala = 100 μm.(C) Ensaio de migração no revestimento de Matrigel. Painel esquerdo: Imagens representativas no modo brightfield no tempo 0 ou 24 h. As áreas ampliadas são representadas nos painéis inferiores. Painel direito: Quantificação de áreas migratórias. Escala = 250 μm.(D) Representação de pilha Z do esferóide (passo de 40 μm) em(a) dinâmica esferóide rastreada acima de 18 h (imagem com intervalo de 3 h) em(b). As células expressam-se firmemente mCherry nuclear (laranja) e GFP citoplasmático (azul). Escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: P3 dinâmica esferóide gravada acima de 18 horas (imagem a cada 30 min). Barra de escala = 100 μm. O filme representa uma pilha Z mesclada ao longo do tempo com um passo Z de 5 μm para um volume total aproximado de 150 μm. As células foram infectadas com lentivírus para expressar NLS:mCherry (núcleos são laranja) e com GFP citoplasmático (cor azul). Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Documento Complementar 1: Macro fiji para análise de invasão, proliferação e migração de esferóide 3D. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
Os ensaios esferóides tumorais são bem adaptados para estudar características tumorais, incluindo proliferação, invasão e migração, bem como morte celular e resposta a medicamentos. As células cancerígenas invadem a matriz 3D formando um microtumor invasivo, como visto na Figura 4B,C. Durante o processo invasivo, as matrizes de metaloproteinases matriciais (MMP) digerem matrizes ao redor das células tumorais13, e os inibidores de MMP (por exemplo, GM6001 ou Rebimastat) podem prejudicar a invasão celular, mas não a migração14. Migração e invasão envolvem eventos moleculares sobrepostos, mas separados15, que podem ser estudados em nosso ensaio esferoide. Para isso, vias específicas de sinalização podem ser direcionadas tanto no nível genético quanto através da inibição farmacológica.
Os glioblastomas são conhecidos por invadir extensivamente os tecidos circundantes por diferentes processos (por exemplo, co-opção, invasão do trato da matéria branca, invasão intersticial)16. Recentemente descrevemos dois novos mecanismos de invasão do glioblastoma9,12,17. Em particular, estudamos trombospondina matricelular-1 (TSP1) e mostramos que ele está envolvido na invasão de células tumorais através da ativação do CD47 em células tumorais12. Além disso, utilizando uma abordagem proteômica, descobrimos o papel inesperado de PLP1 e DNM1 na invasão GBM17. Nestes estudos, os ensaios de invasão 3D foram utilizados com ou sem obstrução farmacológica de TSP1, PLP1 ou DNM1. Além da obstrução farmacológica, também mostramos que o tratamento ácido com cloreto de hidrogênio impacta a invasão no ensaio 3D. Sabe-se que a acidose tumoral ativa uma série de vias de sinalização, incluindo vias metabólicas (glicólise), fatores de crescimento como TGFβ, e inibe a resposta imune5.
Culturas tridimensionais fornecem um ambiente mais fisiológico relevante do que culturas 2D, e muitos parâmetros moleculares e metabólicos podem ser regulados de forma diferente. Assim, a modulação farmacológica pode ter um impacto diferente. Consequentemente, além da imunohistologia padrão, eventos metabólicos também podem ser estudados na cultura 3D usando sondas como 2-DG-IR. Para corroborar esses achados, o inibidor da cadeia de transporte de elétrons I também pode ser usado neste contexto.
Além disso, o sistema de cultura 3D também é adequado para o estudo de processos dinâmicos utilizando imagens ao vivo sob condições basais ou na presença de estímulos ou pistas farmacológicas.
As seguintes etapas críticas devem ser consideradas na realização dos procedimentos descritos neste artigo: 1) O diâmetro esferóide não deve exceder 400 μm para evitar necrose; 2) A quantificação da invasão utilizando o software Fiji deve ser cuidadosamente calibrada e realizada conforme indicado na descrição detalhada do procedimento.; 3) A rigidez do gel deve ser adequada para manter o esferoide em uma configuração estável; 4) O valor do pH deve ser controlado, pois um pH muito ácido impedirá o processo de invasão.
Uma limitação do sistema esferóide descrita neste artigo é a falta do microambiente tumoral completo. Reconhecemos que a matriz utilizada não representa totalmente o estroma encontrado no glioblastoma. No entanto, as colágenas fazem parte da matriz cerebral e queríamos desenvolver um ensaio pronto e fácil de usar que possa ser usado em qualquer laboratório. No entanto, experimentos futuros também podem incluir componentes matriciais adicionais, bem como elementos celulares, incluindo células estrômicas e imunes. Outro nível de complexidade é a inclusão de componentes neuronais, mas esses experimentos devem ser cuidadosamente calibrados e projetados.
Em conclusão, acreditamos que nosso sistema 3D esferóide e as ferramentas analíticas que fornecemos neste artigo podem ser úteis para os pesquisadores, especialmente no estudo do desenvolvimento de tumores cerebrais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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