Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En 3D sfäroid modell för Glioblastoma

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

Här beskriver vi en lätt att använda invasionsanalys för glioblastom. Denna analys är lämplig för glioblastom stamceller-liknande celler. Ett fijitenma makro för enkel kvantifiering av invasion, migration och spridning beskrivs också.

Abstract

Tvådimensionella (2D) cell kulturer inte efterlikna in vivo tumör tillväxt tillfredsställande. Därför utvecklades tredimensionella (3D) kultur sfäroid modeller. Dessa modeller kan vara särskilt viktiga inom neuro-onkologi. Faktum är att hjärntumörer har en tendens att invadera den friska hjärnmiljön. Vi beskriver häri en idealisk 3D glioblastoma sfäroid-baserade analys som vi utvecklat för att studera tumör invasion. Vi tillhandahåller alla tekniska detaljer och analysverktyg för att framgångsrikt utföra denna analys.

Introduction

I de flesta studier med primära eller kommersiellt tillgängliga cellinjer utförs analyser på celler som odlas på plastytor som monolagerkulturer. Hantera cellkultur i 2D representerar nackdelar, eftersom det inte efterliknar en in vivo 3D-cellmiljö. I 2D-kulturer är hela cellytan direkt i kontakt med mediet, förändrar celltillväxt och ändrar läkemedelstillgänglighet. Dessutom utlöser den ickefysiologiska plastytan celldifferentiering1. Tredimensionella kulturmodeller har utvecklats för att övervinna dessa svårigheter. De har fördelen av att härma den flercelliga arkitekturen och heterogeniteten hos tumörer2, och kan därför anses vara en mer relevant modell för solida tumörer3. Den komplexa morfologi av sfäroider bidrar till att bättre utvärdera läkemedlet penetrance och resistens4. Tumören heterogenitet i sfäroiden påverkar spridningen av syre och näringsämnen, och svaret på farmakologiska medel (figur 1A). Diffusion av syre ändras när sfäroidstorleken når 300 μm, vilket leder till en hypoxisk miljö i mitten av sfäroiden (figur 1A,C). Metaboliter är också mindre genomträngande genom cellskikten och kompensera metaboliska reaktioner sker5. När diametern på sfäroiden ökar, nekrotiska kärnor kan observeras, ytterligare härma egenskaper som finns i många fasta cancerformer, inklusive den aggressiva hjärncancer glioblastoma (GBM)6.

Flera 2D eller 3D invasion analyser för glioblastoma har rapporterats i litteraturen7,8. Tvådimensionella analyser är främst avsedda för att studera invasion i ett horisontellt plan på ett tunt matrisskikt eller i en Boyden kammare analys9. Tredimensionella analyser har beskrivits med 3D sfäroid kulturer med klassisk glioblastoma cellinjer10. Mer komplexa varianter representeras av invasion av hjärnan organoider av tumör sfäroider i konfrontation kulturer11. Det är dock fortfarande viktigt att utveckla en lätt att använda och reproducerbara analyser tillgängliga för alla laboratorium. Vi har utvecklat ett protokoll för att generera glioblastoma stamceller från patientprover. Kvantifieringen av dessa analyser är lätt hanterbar och kräver endast öppen online-programvara. Kortfattat skärs tumörbitar i små bitar och enzymmatiskt smält. Enstaka celler som härrör från matsmältningen odlas i neurobasal medium. Efter 4-7 dagar bildas sfäriska strukturer spontant. Vid intrakraniell implantation i möss modeller, de bildar tumörer uppvisar en nekrotisk kärna omgiven av pseudo-palisading celler12. Detta liknar nära de egenskaper som finns i GBM patienter.

I den här artikeln beskriver vi vårt protokoll för att producera sfäroider från ett fastställt antal celler för att säkerställa reproducerbarhet. Två kompletterande matriser kan användas för detta ändamål: Matrigel och kollagen typ I. Matrigel är berikad i tillväxtfaktorer och härmar däggdjur basala membran som krävs för cellen fastsättning och migration. Å andra sidan, kollagen typ I, ett strukturellt inslag av stroma, är den vanligaste fibrillary extracellulär matris och används i cell invasion analyser. Häri illustrerar vi vår GBM sfäroid modell genom att utföra migration och spridning analyser. Analys gjordes inte bara vid fasta tidpunkter utan också genom att övervaka sfäroid expansion och cell rörelse av levande bildbehandling. Dessutom gjordes elektronmikroskopi för att visualisera morfologiska detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informerat skriftligt medgivande erhölls från alla patienter (från Haukeland Hospital, Bergen, Norge enligt lokala etiska kommittébestämmelser). Vårt protokoll följer riktlinjerna i vår institutions kommitté för mänsklig forskningik.

1. Generering av enhetlig storlek tumör sfäroider

OBS: Stamceller-liknande celler odlas i neurobasal medium kompletteras med B27 tillägg, heparin, FGF-2, penicillin, och streptomycin, som beskrivs i tidigare artiklar12. Dessa celler bildar spontant sfäroider i kultur.

  1. Tvätta tumörcellerna med 5 ml fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS) och inkubera cellerna med 0,5-1 ml dissociation enzym (se Tabell över material) i 5 minuter vid 37 °C.
  2. Tvätta med 4-4,5 ml PBS och tillsätt 10 ml av hela tillväxtmediet (komplett neurobasalmedium, cNBM).
  3. Räkna cellerna med hjälp av en automatisk räkningsteknik med trypanblått och en cellräkningskammares bild.
  4. För att generera 100 sfäroider med 104 celler per sfäroid (enligt önskad storlek), blanda 106 celler i 8 ml NBM med 2 ml 2% metylcellulosa.
  5. Överför suspensionen till en steril systembehållare och fördela 100 μL/brunn med en flerkanalig pipett i en 96 väl rund bottenplatta.
  6. Inkubera plattan vid 37 °C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet. Lika stora sfäroider bildas och kan användas efter 3-4 dagar.

2. Tredimensionella experiment

  1. Spridning
    1. Förberedelser
      1. Suspendera hämmare (t.ex. rotenon som i figur 4A) och kemikalier i 100 μl medium och tillsätt till 100 μl medium i varje brunn (dvs. en sfäroid per brunn).
      2. Inkubera plattan vid 37 °C, 5% CO2och 95% luftfuktighet.
    2. Bildförvärv och analys
      1. Ta bilder med ett videomikroskop i brightfield för att skapa en serie villkor vid T0 och följande tider förväntas.
      2. Använd Fiji för att analysera bilder antingen manuellt eller på ett halvautomatiskt sätt. För att göra det manuellt, rita en cirkel runt sfäroidkärna med frihand valverktyget och mäta området för varje sfäroid. Om du vill analysera bilderna på ett halvautomatiskt sätt använder du makrot som visas i Tilläggsdokument 1 med //Core Area endast.
  2. Invasion
    1. Förberedelser
      1. Förbered kollagenmatrisen i ett rör på is med kollagen av typ I vid 1 mg/ml slutlig koncentration, 1x PBS, 0,023xVkollagen,1 M natriumhydroxid och steril H2O. Inkubera lösningen på is i 30 min.
      2. Samla sfäroider från den runda bottenbrunnen i 500 μL-rör och tvätta 2x med 200 μL 1x PBS.
      3. Pipett sfäroiderna försiktigt i 100 μL av kollagenmatrisen och sätt i mitten av en brunn i normala 96 brunnsplattor.
      4. Inkubera kollagengelen i 30 min vid 37 °C och tillsätt sedan cNBM ovanpå gelen. Hämmare eller aktivatorer (t.ex. väteklorid enligt figur 4B, 4C) kan tillsättas till mediet i detta steg.
    2. Bildförvärv och analys
      1. Ta bilder sekventiellt med ett videomikroskop i ljusfältsläge 24 h efter kollageninklusation.
      2. Använd Fiji för att analysera bilder antingen manuellt eller på ett halvautomatiskt sätt. För att göra det manuellt, rita runt kärnan och den totala ytan av sfäroiden med frihandurvalsverktyget och mät det invasiva området för varje sfäroid genom subtrahera total yta med kärnareal. Om du vill analysera bilderna på ett halvautomatiskt sätt använder du makrot enligt tilläggsdokument 1 för att bestämma det invasiva området.
  3. Migration
    1. Förberedelser
      1. Täck en 6 brunnsplatta med Matrigel (0,2 mg/ml) i NBM i 30 min vid 37 °C, ta sedan bort Matrigel och tillsätt 2 ml cNBM.
      2. Överför sfäroider till 50 μL cNBM från den runda bottenbrunnen till 6-brunnsplattan.
      3. Inkubera plattan vid 37 °C och vänta 30 minuter på att sfäroiderna ska fästas.
      4. Efter 24 timmars inkubation, fläck med 10 ng/ml Hoechst och inkubera 30 min vid 37 °C.
    2. Bildförvärv och analys
      1. Hämta bilder med hjälp av ett videomikroskop i ljusfält. En 405 nm laser används för visualisering av Hoechst färgning.
      2. Använd Fiji programvara för att analysera bilder och köra makrot som anges i tilläggsdokument 1.
        OBS: Vidröra botten av brunnen eller helt ta bort supernatant skadar sfäroider. För kollagen typ I gel hantering, hålla gelen på is för att undvika kollagen polymerisation, tillsätt inte en sur komponent eftersom förändringen i pH kommer att påverka kompaktheten i gelen, och pipettceller snabbt i kollagen för att förhindra celldöd och nedbrytning av gelen.

3. Fiji Makro

Obs: Fiji är en bild analys program som utvecklats i det offentliga rummet som gör det möjligt att utveckla makron för att påskynda bildanalys. Manuell analys är också möjligt, men detta är en långsam process och kan införa fördomar. Bilder kan importeras genom att dra och släppa i programvaran och kvantifieras med ROI Manager Tools plugin. Det förfarande som används i denna studie beskrivs nedan:

  1. Öppna makrofönstret: Plugins | Makron | Interaktiv tolk.
  2. Kopiera och klistra in följande anpassade lila slinga. Behåll de lila meningarna och lägg till gröna meningar(tilläggsdokument 1).
  3. Om du vill analysera hela serien justerar du parametrarna i rött för en viss kvantifiering och kör makrot med makron | Kör makro eller trycka på Ctrl+R.
  4. Kontrollera och vid behov manuellt anpassa området av intresse (ROI).

4. Elektronmikroskopi av sfäroider

OBS: De flesta av följande steg måste göras i en kemisk huva.

  1. Fixeringssteg
    1. Samla sfäroiden med en skuren pipettspets, lägg den i ett 1,5 ml-rör och tvätta 1x med 0,1 M fosfatbuffert (PB).
    2. Fixa sfäroiden över natten vid 4 °C i 2% glutaraldehyd/2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB.
    3. Byt ut fixeringslösningen mot en lösning på 1 % PFA i 0,1 M PB följt av provberedning.
  2. Provberedning
    1. Överför sfäroiderna till en sil och lägg dem i en glasbägare för att undvika sfärisk skada.
    2. Tvätta försiktigt 3x med 0,1 M PB.
    3. Inkubera med osmium i 2 h i mörker. Späd osmium till 4% i 1% 0,1 M PB buffert.
    4. Tvätta försiktigt 3x med 0,1 M PB.
      1. Torka enligt följande: blötlägg i 50% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, 2x 90% etanol för 15 min, 2x 100% etanol för 20 min och 2x aceton i 30 min.
    5. Inkubera proverna i en 50/50 blandning av aceton/harts i 2 h. Under detta steg, förbereda EPON harts (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Kassera aceton/hartsblandningen, byt ut den mot nyberedd harts och inkubera över natten.
    7. Byt ut hartset med en ny och inkubera mellan 2-6 h.
    8. Tillsätt sfäroiderna i harts i en form vid 60 °C för 48-72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sfäroider utarbetades som beskrivs i protokoll avsnitt och observationer gjordes om migration, invasion, spridning och mikroskopi. För att mäta hypoxi i olika områden av sfärisk struktur användes karboxad anhydras IX-färgning för att bestämma hypoxisk aktivitet (figur 1A-C). Fler CAIX-positiva celler observerades i sfäroidcentrum (figur 1A-C). Hypoxiska celler som ligger i sfäroidkärnan tenderar att vara mer glykolytiska än de omgivande. Mitokondrierna kan avbildas för ytterligare analyser som visas av elektronmikroskopi (Figur 1Ba-1Bb). Sfäroider som består av 2,5 x 103,5 x 103,104eller 2 x 104 celler uppvisar en sfäroiddiameter på cirka 350, 400, 500 respektive 650 μm (figur 2A). Sfäroider kan användas inom 4 dagar efter att experimentet påbörjats (figur 2B). Kvantifieringen av varje analys (dvs. spridning, invasion, migration) visas i figur 3. Fiji makron har utvecklats för att kvantifiera spridning, invasion eller migration (figur 3 och kompletterande dokument 1).

Ökningen av sfäroidkärna återspeglade stimulering av cellproliferation (figur 4A). Vid hämning av rotenone, en etablerad hämmare av komplexa I av mitokondriellt luftvägarna kedjan, den stora majoriteten av ATP produktion i mitokondrierna äventyrades. Som en följd av detta minskade spridningen med 20 % efter 72 timmar (figur 4A). Invasion av kollagen typ I beräknades genom subtraktion av den totala ytan från kärnområdet. Sur behandling förbättrad invasion under en period av 24 h (Figur 4B). Dessutom fann vi att vätekloridbehandling minskade spheroidernas flyttande område med 1,5 gånger jämfört med kontroll (figur 4C). Sfäroiddynamiken studerades genom montering för levande avbildning i UniverSlide13. Sfäroider hade hög intern dynamik och rörde sig snabbt (Film 1 och spårning analys i figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Sfäroiden är en relevant modell för att efterlikna solida tumörer. (A)Sfäroid som en rund 3D-struktur med olika områden. (a)En ljusfältsbild av en P3-sfäroid visar ett runt utseende med ett tätt centralt område. Skala = 100 μm. (b)Schematisk representation anpassad från Hirschhaeuser et al.6 visar O2,CO2,metabolit och katabolit gradienter i sfäroiden. c)Vänsterpanel: konfokal bild av en sfäroid som färgats med DAPI (blå) och med antikroppar mot karboxisk anhydras IX (grön). Höger panel: kvantifiering av fluorescensen från det streckade området. Skala = 100 μm. (B) Elektronmikroskopibilder med avgränsade mitokondrier (streckade linjer). Stora mitokondrier ses i quiescentarea medan de är mindre i spridningsområdet. Skala = 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Övergripande sfäriska förberedelsesteg. (A)Generation av mänskliga P3 glioblastoma sfäroider. Representativa bilder finns på den vänstra panelen och motsvarande spridningsanalys på den högra panelen. Vid 24 h bildade P3-cellerna täta sfäroider. Det ursprungliga antalet celler bestäms storleken på sfäroider. Skala bar = 250 μm. (B) Schematisk illustration av de enkla protokollen för att studera spridning, invasion eller migration. Sfäroider under olika förhållanden: (a) I serumfritt medium för tumörtillväxt, (b) I kollagenmatris för att underlätta encellig invasion, och (c) På Matrigel beläggning för cellmigration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Kvantifiering av in vitro-analyser med Fiji-programvara. Representation av de regioner av intresse (ROI) som erhållits med hjälp av Fiji. Kärnområdet är representerat i rött och den totala ytan, som innehåller kärnområdet, i gult. Det invasiva området motsvarar subtraktionen av den totala arealen från kärnområdet. A)Spridningsanalys. (B)Invasion analys i kollagen gel i brightfield förvärv. CMigrationsanalys på Matrigelbeläggning genom fluorescensanskaffning. Kärnor var färgade med DAPI, i blått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Glioblastoma P3 sfäroid i spridning, invasion, eller migration analyser. A)Spridningsanalys. Vänster panel: Representativa bilder med DMSO som kontroll eller med 20 μM rotenon (andningskedjan komplex I-hämmare) vid tiden 0 eller 72 h. Höger panel: Sfäroid område kvantifiering representeras som streckade linjer i bilderna. Skala = 250 μm. (B) Invasionsanalys i kollagenmatris. Vänster panel: Representativa bilder med eller utan 20 mM väteklorid, vid tiden 0 eller 24 h. Höger panel: Kvantifiering av invasiva områden. Skala = 100 μm.(C)Migrationsanalys på Matrigel beläggning. Vänster panel: Representativa bilder i ljusfältsläge vid tiden 0 eller 24 h. Förstorade områden finns representerade i de nedre panelerna. Högerpanel: Kvantifiering av migrationsområden. Skala = 250 μm. (D) Z-stack representation av sfäroiden (40 μm steg) i (a) sfäroid dynamisk spåras över 18 h (bild med 3 h intervall) i( b). Celler stabilt uttryckt nukleära mCherry (orange) och cytoplasmatiska GFP (blå). Skala = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Film 1: P3 sfäroid dynamisk inspelad över 18 h (bilden varje 30 min). Skalstång = 100 μm. Filmen representerar en sammanslagen Z-stack över tiden med ett Z-steg på 5 μm för en ungefärlig total volym på 150 μm. Celler smittades med lentivirus för att uttrycka NLS:mCherry (kärnor är orange) och med cytoplasmatisk GFP (blå färg). Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Tilläggsdokument 1: Fiji makro för att analysera invasion, spridning och migration av 3D-sfäroid. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tumör sfäroid analyser är väl anpassade för att studera tumör egenskaper inklusive spridning, invasion, och migration, samt celldöd och läkemedelsrespons. Cancerceller invaderar 3D-matrisen och bildar en invasiv mikrotumör, vilket ses i figur 4B,C. Under den invasiva processen kan matrismetalloproteinaser (MMP) smälta matriser kring tumörceller13och MMP-hämmare (t.ex.14 Migration och invasion innebär överlappande men separata molekylära händelser15, som kan studeras i vår sfäroid analys. För att göra detta kan specifika signalvägar riktas antingen på genetisk nivå eller genom farmakologisk hämning.

Glioblastomas är kända för att i stor utsträckning invadera de omgivande vävnaderna genom olika processer (t.ex. co-option, white matter tract invasion, interstitiell invasion)16. Vi beskrev nyligen två nya mekanismer för glioblastoma invasion9,12,17. I synnerhet studerade vi matricellular thrombospondin-1 (TSP1) och visade att det är involverat i tumörcellinvasion genom aktivering av CD47 i tumörceller12. Dessutom, med hjälp av en proteomisk metod, upptäckte vi den oväntade rollen av PLP1 och DNM1 i GBM invasion17. I dessa studier, 3D invasion analyser användes framgångsrikt med eller utan farmakologisk obstruktion av TSP1, PLP1 eller DNM1. Förutom farmakologisk obstruktion visade vi också att syra behandling med väteklorid påverkar invasionen i 3D-analysen. Det är känt att tumör acidos aktiverar ett antal signalering vägar, inklusive metaboliska vägar (glykolys), tillväxtfaktorer som TGFβ, och hämmarimmunsvaret 5.

Tredimensionella kulturer ger en mer fysiologisk relevant miljö än 2D-kulturer, och många molekylära och metaboliska parametrar kan regleras på olika sätt. Således kan farmakologisk modulering ha en annan inverkan. Följaktligen, förutom standard immunohistologi, metaboliska händelser kan också studeras i 3D-kultur med hjälp av sonder såsom 2-GD-IR. För att bekräfta dessa fynd kan elektrontransportkedjan komplexa I-hämmare också användas i detta sammanhang.

Dessutom är 3D-odlingssystemet också väl lämpad för studier av dynamiska processer med hjälp av levande avbildning under basala förhållanden eller i närvaro av stimuli eller farmakologiska signaler.

Följande kritiska steg bör beaktas vid genomförandet av de förfaranden som beskrivs i denna artikel: 1) Sfäroiddiametern bör inte överstiga 400 μm för att undvika nekros. 2) Kvantifieringen av invasionen med fijiisk programvara måste noggrant kalibreras och utföras på det sätt som anges i den detaljerade beskrivningen av förfarandet.; 3) Gelstyheten måste vara lämplig för att hålla sfäroiden i en stabil konfiguration; 4) PH-värdet måste kontrolleras, eftersom ett mycket surt pH-värde kommer att hindra invasionsprocessen.

En begränsning av sfäroid systemet som beskrivs i denna artikel är bristen på den fullständiga tumör mikromiljön. Vi erkänner att matrisen som används inte helt representerar stroma finns i glioblastoma. Men kollagen är en del av hjärnan matrisen och vi ville utveckla en färdig- och lättanvänd analys som kan användas i alla laboratorium. Ändå, framtida experiment kan också innehålla ytterligare matris komponenter samt cellulära element, inklusive stromal och immunceller. En annan nivå av komplexitet är införandet av neuronala komponenter, men dessa experiment måste noggrant kalibreras och utformas.

Sammanfattningsvis tror vi att vår sfäroid 3D-system och de analytiska verktyg vi tillhandahåller i denna artikel kan vara användbara för utredare, särskilt i att studera hjärnan tumör utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon är en mottagare av stipendium från Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

Cancerforskning glioblastom patient-härledda cell sfäroid invasion migration spridning in vitro-modeller
En 3D sfäroid modell för Glioblastoma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter