Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En 3D Sfæroide model for Glioblastoma

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

Her beskriver vi en nem at bruge invasion ssay for glioblastoma. Denne analyse er velegnet til glioblastoma stamceller-lignende celler. En Fiji makro for nem kvantificering af invasion, migration og spredning er også beskrevet.

Abstract

To-dimensionelle (2D) cellekulturer ikke efterligne in vivo tumor vækst tilfredsstillende. Derfor blev der udviklet tredimensionelle (3D) kultursfæroide modeller. Disse modeller kan være særligt vigtige inden for neuro-onkologi. Faktisk, hjernetumorer har tendens til at invadere den sunde hjerne miljø. Vi beskriver heri en ideel 3D glioblastoma sfæoid-baserede analyse, som vi udviklede til at studere tumor invasion. Vi leverer alle tekniske detaljer og analytiske værktøjer til at udføre denne analyse med succes.

Introduction

I de fleste undersøgelser, hvor der foretages primære eller kommercielt tilgængelige cellelinjer, udføres analyser på celler, der dyrkes på plastoverflader som monolagskulturer. Håndtering af cellekultur i 2D repræsenterer ulemper, da det ikke efterligner et in vivo 3D-cellemiljø. I 2D-kulturer er hele celleoverfladen direkte i kontakt med mediet, hvilket ændrer cellevækst og ændrer tilgængeligheden af lægemidler. Desuden udløser den ikke-fysiologiske plastoverflade celledifferentiering1. Der er udviklet tredimensionelle kulturmodeller for at overvinde disse vanskeligheder. De har den fordel at efterligne den multicellulære arkitektur og heterogenitet af tumorer2, og dermed kunne anses for at være en mere relevant model for solide tumorer3. Den komplekse morfologi af sfæroider bidrager til bedre at evaluere lægemiddelpenetreance og resistens4. Tumoren heterogenitet i sfæroide påvirker diffusion af ilt og næringsstoffer, og reaktionen på farmakologiske agenser (Figur 1A). Spredning af ilt ændres, når sfæroidens størrelse når 300 μm, hvilket fremkalder et hypoxisk miljø i midten af sfæroiden (figur 1A,C). Metabolitter trænger også mindre ind gennem cellelagene, og der foretages kompenserende metaboliske reaktioner5. Når diameteren af sfæroide stiger, nekrotiske kerner kan observeres, yderligere efterligne egenskaber findes i mange solide kræftformer, herunder den aggressive hjernekræft glioblastoma (GBM)6.

Flere 2D- eller 3D-invasionsanalyser for glioblastom er blevet rapporteret i litteraturen7,8. To-dimensionelle analyser er primært til at studere invasion i et vandret plan på en tynd matrix lag eller i en Boyden kammer analyse9. Tre-dimensionelle analyser er blevet beskrevet med 3D sfæroide kulturer ved hjælp af klassiske glioblastomcellelinjer10. Mere komplekse varianter er repræsenteret ved invasion af hjernen organoider af tumor sfæroider i konfrontation kulturer11. Det er dog stadig vigtigt at udvikle en let anvendelig og reproducerbar analyse, der er tilgængelig for ethvert laboratorium. Vi har udviklet en protokol til at generere glioblastoma stamceller-lignende celler fra patientprøver. Kvantificeringen af disse analyser er let håndterbar og kræver kun onlinesoftware med åben adgang. Kort, tumor stykker skæres i små stykker og enzymatisk fordøjet. Enkelte celler stammer fra fordøjelsen dyrkes i neurobasalmedium. Efter 4-7 dage dannes sfænodestrukturer spontant. Ved intrakraniel implantation i mus modeller, de danner tumorer udviser en nekrotisk kerne omgivet af pseudo-palisading celler12. Dette ligner de egenskaber, der findes i GBM patienter.

I denne artikel beskriver vi vores protokol til at producere sfæroider fra et bestemt antal celler for at sikre reproducerbarhed. To komplementære matricer kan anvendes til dette formål: Matrigel og kollagen type I. Matrigel er beriget med vækstfaktorer og efterligner pattedyr basal membran kræves for celle vedhæftet fil og migration. På den anden side, kollagen type I, et strukturelt element i stroma, er den mest almindelige fibrillary ekstracellulære matrix og bruges i celle invasion assays. Heri illustrerer vi vores GBM sfæroide model ved at udføre migration og spredning assays. Analysen blev udført ikke kun på faste tidspunkter, men også ved at overvåge sfælleide ekspansion og celle bevægelse ved levende billeddannelse. Desuden blev elektronmikroskopi gjort for at visualisere morfologiske detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle patienter (fra Haukeland Hospital, Bergen, Norge i henhold til lokale etiske komité forordninger). Vores protokol følger retningslinjerne fra vores institutions etiske komité for human forskning.

1. Generation af ensartet størrelse tumor sfæroider

BEMÆRK: Stem-lignende celler dyrkes i neurobasalmedium suppleret med B27 supplement, heparin, FGF-2, penicillin, og streptomycin, som beskrevet i tidligere artikler12. Disse celler danner spontant sfæroider i kulturen.

  1. Tumorcellerne vaskes med 5 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) og cellerne inkuberes med 0,5-1 ml dissociationsenzym (se Materialetabel)i 5 minutter ved 37 °C.
  2. Vask med 4-4,5 ml PBS og tilsæt 10 ml af det komplette vækstmedium (komplet neurobasalmedium, cNBM).
  3. Tæl cellerne ved hjælp af en automatisk tælleteknik med trypanblå og et celletællekammerdias.
  4. For at generere 100 sfæroider med 104 celler pr. sfæroide (i henhold til foretrukken størrelse) blandes 106 celler i 8 ml NBM med 2 ml 2% methylcellulose.
  5. Suspensionen overføres til en steril systembeholder, og 100 μL/brønden dispenseres med en multikanalpipette til en 96 brøndrund bundplade.
  6. Inkuber pladen ved 37 °C, 5% CO2 og 95% fugtighed. Lige størrelse sfæroider vil danne og kan bruges efter 3-4 dage.

2. Tredimensionelle eksperimenter

  1. Spredning
    1. Under forberedelse
      1. Ophænghæmmere (f.eks. rotenon som i figur 4A) og kemikalier i 100 μL medium og tilsættes til de 100 μL medium i hver brønd (dvs. en sfæroide pr. brønd).
      2. Inkuber pladen ved 37 °C, 5% CO2og 95% fugtighed.
    2. Erhvervelse og analyse af billeder
      1. Tag billeder med et videomikroskop i brightfield for at skabe en række forhold på T0 og følgende forventede tidspunkter.
      2. Brug Fiji til at analysere billeder enten manuelt eller halvautomatisk. For at gøre dette manuelt skal du tegne en cirkel rundt om sfæroide kernen med frihåndsmarkeringsværktøjet og måle området for hver sfæroide. Hvis du vil analysere billederne på en halvautomatisk måde, skal du bruge den makro, der vises i Supplerende dokument 1 med //Core Area.
  2. Invasion
    1. Under forberedelse
      1. Kollagenmatrixen fremstilles i et rør på is med type I-kollagen ved 1 mg/ml slutkoncentration, 1x PBS, 0,023xVkollagen,1 M natriumhydroxid og steril H2O. Inkuber opløsningen på is i 30 min.
      2. Sfæroider opsamles fra den runde bundbrøndplade i 500 μL-rør, og 2x vaskes med 200 μL 1x PBS.
      3. Pipetter sfænoiderne forsigtigt i 100 μL af kollagenmatrixen og indsættes i midten af en brønd i normale 96 brøndplader.
      4. Kollagengelen inkuberes i 30 minutter ved 37 °C, og tilsæt derefter cNBM oven på gelen. Inhibitorer eller aktivatorer (f.eks. hydrogenchlorid som vist i figur 4B, 4C)kan tilsættes mediet ved dette trin.
    2. Erhvervelse og analyse af billeder
      1. Tag billeder sekventialt med et videomikroskop i brightfield mode 24 h efter kollagen optagelse.
      2. Brug Fiji til at analysere billeder enten manuelt eller halvautomatisk. For at gøre dette manuelt, tegne omkring kernen og det samlede areal af sfæroide med frihåndsmarkeringsværktøjet og måle det invasive område af hver sfæroide ved at trække det samlede areal med kernearealet. Hvis du vil analysere billederne på en halvautomatisk måde, skal du bruge makroen som angivet i supplerende dokument 1 til at bestemme det invasive område.
  3. Migration
    1. Under forberedelse
      1. Coat en 6 brønd plade med Matrigel (0,2 mg / ml) i NBM i 30 min ved 37 °C, derefter fjerne Matrigel og tilsæt 2 ml cNBM.
      2. Sfæroider overføres til 50 μL cNBM fra den runde bundbrøndplade til 6 brøndpladen.
      3. Inkuber pladen ved 37 °C og vent 30 min for sfæroider at overholde.
      4. Efter 24 timers inkubation pletten med 10 ng/ml Hoechst og inkubere 30 min ved 37 °C.
    2. Erhvervelse og analyse af billeder
      1. Få billeder ved hjælp af en video mikroskop i brightfield. En 405 nm laser bruges til visualisering af Hoechst farvning.
      2. Brug Fiji-software til at analysere billeder og køre makroen som angivet i supplerende dokument 1.
        BEMÆRK: Berøring af bunden af brønden eller helt at fjerne supernatanten beskadiger sfænoiderne. For kollagen type I gel håndtering, holde gel på is for at undgå kollagen polymerisering, ikke tilføje en sur komponent, fordi ændringen i pH vil påvirke kompakthed af gel, og pipette celler hurtigt ind i kollagen for at forhindre celledød og nedbrydning af gelen.

3.

BEMÆRK: Fiji er et billedanalyseprogram udviklet i det offentlige rum, der gør det muligt at udvikle makroer for at fremskynde billedanalyse. Manuel analyse er også muligt, men dette er en langsom proces og kan indføre bias. Billeder kan importeres ved træk og slip i softwaren og kvantificeres med ROI Manager Tools plugin. Den procedure, der anvendes i denne undersøgelse er beskrevet nedenfor:

  1. Åbn makrovinduet: Plugins | Makroer | Interaktiv tolk.
  2. Kopier og indsæt følgende tilpassede lilla løkke. Behold de lilla sætninger og tilsæt de grønne sætninger af interesse (supplerende dokument 1).
  3. Hvis du vil analysere hele serien, skal du justere parametrene med rødt for en bestemt kvantificering og køre makroen ved hjælp af makroer | Afspil makro, eller tryk på Ctrl+R.
  4. Kontroller og om nødvendigt manuelt tilpasser interesseregionen.

4. Elektronmikroskopi af sfæroider

BEMÆRK: De fleste af følgende trin skal udføres i en kemisk hætte.

  1. Trin for fiksering
    1. Indsaml sfænoden med en skåret pipettespids, anbringes i et 1,5 ml rør, og 1x vaskes med 0,1 M fosfatbuffer (PB).
    2. Sfæroiden natten over anbrings ved 4 °C i 2% glutaraldehyd/2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB.
    3. Fikseringsopløsningen udskiftes med en opløsning på 1% PFA i 0,1 M PB efterfulgt af prøveforberedelse.
  2. Forberedelse af prøver
    1. Overfør sfænoiderne til en si og læg dem i et glasbæger for at undgå sfæroide skader.
    2. Vask forsigtigt 3x med 0,1 M PB.
    3. Inkuber med osmium i 2 timer i mørke. Fortyndes osmium til 4% i 1% 0,1 M PB buffer.
    4. Vask forsigtigt 3x med 0,1 M PB.
      1. Dehydrere som følger: lægges i blød i 50% ethanol i 10 min, 70% ethanol i 10 min, 2x 90% ethanol i 15 min, 2x 100% ethanol i 20 min, og 2x acetone i 30 min.
    5. Prøverne inkuberes i en 50/50 blanding af acetone/harpiks i 2 timer. I løbet af dette trin forberedeeponharpiksen (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Acetone/harpiksblandingen kasseres med friskfremstillet harpiks, og inkuber natten over.
    7. Udskift harpiksen med en ny og inkuber mellem 2-6 timer.
    8. Tilsæt sfænoider i harpiks i en støbeform ved 60 °C for 48-72 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sfæroider blev udarbejdet som beskrevet i afsnittet protokoller og observationer blev foretaget vedrørende migration, invasion, spredning og mikroskopi. For at måle hypoxi i forskellige områder af den sfæriske struktur blev carboxic anhydrase IX-farvning anvendt til bestemmelse af hypoxisk aktivitet (figur 1A-C). Der blev observeret flere CAIX-positive celler i sfænodecentret (Figur 1A-C). Hypoxiske celler placeret i sfæroide kerne tendens til at være mere glymolytisk end de omkringliggende. Mitokondrier kan afbildes til yderligere analyser som vist ved elektronmikroskopi (figur 1Ba-1Bb). Sfæroider, der består af 2,5 x 103,5 x 103,104eller 2 x 104 celler, har en sfæroide diameter på henholdsvis ca. 350, 400, 500 eller 650 μm (figur 2A). Sfæroider kan anvendes inden for 4 dage efter forsøgets start (figur 2B). Kvantificeringen af hver analyse (dvs. spredning, invasion, migration) er vist i figur 3. Der blev udviklet makroer fra Fiji for at kvantificere spredning, invasion eller migration (figur 3 og supplerende dokument 1).

Stigningen i sfæroide kerne afspejlede stimulering af celleproliferation (Figur 4A). Ved hæmning af rotenon, en etableret hæmmer af komplekse I af mitokondrielle respiratoriske kæde, langt størstedelen af ATP produktion i mitokondrier blev kompromitteret. Som følge heraf blev spredningen reduceret med 20 % efter 72 timer (figur 4A). Invasion af kollagen type I blev beregnet ved subtraktion af det samlede areal fra kerneområdet. Syrkt behandling forstærket invasion over en periode på 24 timer (Figur 4B). Desuden konstaterede vi, at hydrogenchloridbehandling reducerede migrationsområdet for sfænoiderne med 1,5 gange sammenlignet med kontrol (figur 4C). Sfæroide dynamik blev undersøgt ved montering for levende billeddannelse i UniverSlide13. Sfæroider havde høj intern dynamik og bevægede sig hurtigt (Movie 1 og sporinganalyse i figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Sfæroiden er en relevant model til at efterligne solide tumorer. (A) Sfæroide som en rund 3D-struktur med forskellige områder. aa) Et brightfield-billede af en P3-sfæroide viser et rundt udseende med et tæt centralt område. Skala = 100 μm. (b) Skemalig repræsentation tilpasset fra Hirschhaeuser et al.6 viser O2,CO2,metabolit og katabolitgradienter i sfæroiden. cc) Venstre panel: konfokalbillede af en sfæroide, der er plettet med DAPI (blå) og med antistoffer mod carboxic anhydrase IX (grøn). Højre panel: kvantificering af fluorescens fra det stiplede område. Skala = 100 μm. (B) Elektronmikroskopibilleder med afgrænset mitokondrier (stiplede linjer). Store mitokondrier ses i quiescentarea, mens de er mindre i spredningsområdet. Skala = 250 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Samlet sfæroide forberedelsestrin. (A) Generation af humane P3 glioblastoma sfæroider. Repræsentative billeder er på venstre panel og tilsvarende spredning analyse på højre panel. Ved 24 timer dannede P3-cellerne tætte sfæroider. Det oprindelige antal celler bestemmes størrelsen af sfæroider. Skalabar = 250 μm. (B) Skematisk illustration af de nemme protokoller til undersøgelse af spredning, invasion eller migration. Sfæroider under forskellige forhold:a) I serumfrit medium for tumorvækst, (b) I kollagenmatrix til fremme af enenkelt celleinvasion og (c) På Matrigel-belægning til cellemigration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af in vitro-analyser med Fiji-software. Repræsentation af de interesseregioner, der er opnået ved hjælp af Fiji. Kerneområdet er repræsenteret i rødt, og det samlede areal, som indeholder kernearealet, i gult. Det invasive område svarer til subtraktionen af det samlede areal fra kerneområdet. AA) Spredningsanalyse. (B) Invasion assay i kollagen gel i brightfield opkøb. CC) Migrationsanalyse om Matrigel-belægning ved erhvervelse af fluorescens. Kerner blev plettet med DAPI, i blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Glioblastoma P3 sfæroide i spredning, invasion, eller migration assays. AA) Spredningsanalyse. Venstre panel: Repræsentative billeder med DMSO som kontrol eller med 20 μM rotenon (respiratorisk kæde kompleks Jeg hæmmer) på tidspunktet 0 eller 72 h. Højre panel: Sfæroide område kvantificering repræsenteret som stiplede linjer i billederne. Skala = 250 μm. (B) Invasionsanalyse i kollagenmatrix. Venstre panel: Repræsentative billeder med eller uden 20 mM hydrogenchlorid på tidspunktet 0 eller 24 timer. Højre panel: Kvantificering af invasive områder. Skala = 100 μm. (C) Migrationsanalyse på Matrigel-belægning. Venstre panel: Repræsentative billeder i brightfield mode på tid 0 eller 24 h. Forstørrede områder er repræsenteret i de nederste paneler. Højre panel: Kvantificering af migrationsområder. Skala = 250 μm. (D) Z-stack repræsentation af sfæroiden (40 μm trin) i (a) sfæroide dynamisk spores over 18 timer (billede med 3 h interval) i (b). Celler har stabilt udtrykt nuklearmCherry (orange) og cytoplasmatisk GFP (blå). Skala = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Film 1: P3 sfæroide dynamisk optaget over 18 timer (afbildet hver 30 min). Skalabar = 100 μm. Filmen repræsenterer en fusioneret Z-stack over tid med et Z-trin på 5 μm for et omtrentligt samlet volumen på 150 μm. Celler blev inficeret med lentivirus for at udtrykke NLS:mCherry (kerner er orange) og med cytoplasmatisk GFP (blå farve). Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende dokument 1: Fiji makro til analyse invasion, spredning og migration af 3D sfæroide. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tumor sfæroide analyser er godt tilpasset til at studere tumor egenskaber, herunder spredning, invasion, og migration, samt celledød og narkotika respons. Kræftceller invadere 3D-matrix danner en invasiv mikrotumor, som det ses i figur 4B, C. Under den invasive proces, matrix metalloproteinaser (MMP) fordøje matricer omkring tumorceller13, og MMP-hæmmere (f.eks GM6001 eller Rebimastat) kan forringe celle invasion, men ikke migration14. Migration og invasion indebærer overlappende, men separate molekylære begivenheder15, som kan studeres i vores sfæroide assay. For at gøre dette, specifikke signalering veje kan målrettes enten på det genetiske niveau eller gennem farmakologisk hæmning.

Glioblastomer er kendt for i udstrakt grad at invadere det omgivende væv ved forskellige processer (f.eks co-option, hvide stof tarmkanalen invasion, interstitiel invasion)16. Vi har for nylig beskrevet to nye mekanismer glioblastoma invasion9,12,17. Især studerede vi matricellulær trombose-1 (TSP1) og viste, at det er involveret i tumorcelle invasion gennem aktivering af CD47 i tumorceller12. Desuden ved hjælp af en proteomisk tilgang, opdagede vi den uventede rolle PLP1 og DNM1 i GBM invasion17. I disse undersøgelser blev 3D-invasionsanalyser med succes anvendt med eller uden farmakologisk obstruktion af TSP1, PLP1 eller DNM1. Udover farmakologisk obstruktion viste vi også, at syrebehandling med hydrogenchlorid påvirker invasionen i 3D-analysen. Det er kendt, at tumoracidose aktiverer en række signalering veje, herunder metaboliske veje (glykolyse), vækstfaktorer som TGFβ, og hæmmer immunrespons5.

Tredimensionelle kulturer giver et mere fysiologisk relevant miljø end 2D-kulturer, og mange molekylære og metaboliske parametre kan reguleres forskelligt. Farmakologisk graduering kan således have en anden virkning. Ud over standardimmunhistologi kan metaboliske hændelser derfor også undersøges i 3D-kultur ved hjælp af sonder som 2-DG-IR. For at underbygge disse fund kan elektrontransportkædekomplekset I inhibitor også anvendes i denne sammenhæng.

Derudover er 3D-kultursystemet også velegnet til undersøgelse af dynamiske processer ved hjælp af levende billeddannelse under basale forhold eller i nærvær af stimuli eller farmakologiske signaler.

Følgende kritiske trin bør tages i betragtning, når de procedurer, der er beskrevet i denne artikel: 1) Sfæroidendiameter må ikke overstige 400 μm for at undgå nekrose; 2) Kvantificeringen af invasionen ved hjælp af Fiji-software skal kalibreres omhyggeligt og udføres som angivet i den detaljerede beskrivelse af proceduren.; 3) Gelstivheden skal være egnet til at holde sfæroiden i en stabil konfiguration. 4) PH-værdien skal kontrolleres, da en meget sur pH vil hindre invasionsprocessen.

En begrænsning af sfæroide system, der er beskrevet i denne artikel er manglen på den komplette tumor mikromiljø. Vi anerkender, at den anvendte matrix ikke fuldt ud repræsenterer stroma fundet i glioblastoma. Men kollagener er en del af hjernen matrix, og vi ønskede at udvikle en klar- og nem at bruge analyse, der kan bruges i ethvert laboratorium. Ikke desto mindre, fremtidige eksperimenter kan også omfatte yderligere matrix komponenter samt cellulære elementer, herunder stromale og immunceller. Et andet niveau af kompleksitet er inddragelsen af neuronale komponenter, men disse eksperimenter skal omhyggeligt kalibreres og designes.

Afslutningsvis mener vi, at vores sfæroide 3D-system og de analytiske værktøjer, vi leverer i denne artikel kan være nyttige for efterforskere, især i at studere hjernetumor udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har modstridende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon er en modtager af stipendium fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

Kræftforskning glioblastoma patient-afledte celle sfæroide invasion migration spredning in vitro modeller
En 3D Sfæroide model for Glioblastoma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter