Summary
ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。
Abstract
二次元(2D)細胞培養は生体内腫瘍増殖を良好に模倣しない。そこで、3次元(3D)培養スフェロイドモデルが開発された。これらのモデルは、神経腫瘍学の分野で特に重要である可能性があります。確かに、脳腫瘍は健康な脳環境に侵入する傾向があります。我々は、腫瘍の浸潤を研究するために開発した理想的な3D神経膠芽腫スフェロイドベースのアッセイをここに記載する。このアッセイを成功させるために、技術的な詳細と分析ツールをすべて提供しています。
Introduction
一次または市販の細胞株を用いたほとんどの研究では、単層培養物としてプラスチック表面上で増殖した細胞に対してアッセイが行われる。2Dで細胞培養を管理することは、生体内3D細胞環境を模倣しないため、欠点を表します。2D培養では、細胞表面全体が培地に直接接触し、細胞の成長を変化させ、薬物の入手可能性を改変する。さらに、非生理学的プラスチック表面は細胞分化をトリガする1。これらの困難を克服するために三次元の文化モデルが開発されました。彼らは腫瘍2の多細胞アーキテクチャと異質性を模倣するという利点を有し、したがって、固形腫瘍3のより関連性の高いモデルであると考えることができる。スフェロイドの複雑な形態は、薬物浸透および耐性をより良く評価するのに寄与する。スフェロイドにおける腫瘍不均一性は、酸素および栄養素の拡散に影響を及ぼし、薬理学的薬剤に対する応答を示す(図1A)。スフェロイドサイズが300μmに達すると酸素の拡散が変化し、スフェロイドの中心に低酸素環境を誘導する(図1A、C)。代謝産物はまた、細胞層を通して浸透が少なく、代謝反応を補償する5が起こる。スフェロイドの直径が大きくなると、壊死コアが観察され、積極的な脳癌神経膠芽腫(GBM)6を含む多くの固形癌に見られる更なる模倣6特性が観察される。
神経膠芽腫に関するいくつかの2Dまたは3Dの浸潤アッセイが文献77,88で報告されている。二次元アッセイは、主に薄いマトリックス層の水平面またはボイデンチャンバーアッセイ9での侵略を研究するためのものである。三次元アッセイは、古典的な神経膠芽腫細胞株10を用いた3Dスフェロイド培養液で記載されている。より複雑な変異体は、対立培養11における腫瘍スフェロイドによる脳オルガノイドの侵入によって表される。しかし、どんな研究室でも使いやすく再現可能なアッセイを開発することは、依然として重要です。我々は、患者のサンプルから神経膠芽腫幹細胞を生成するプロトコルを開発した。これらのアッセイの定量化は容易に管理可能であり、オープンアクセスオンラインソフトウェアだけを必要とする。簡単に言えば、腫瘍片を小さく切り、酵素的に消化する。消化から誘導される単一細胞は、神経基底培地で培養される。4〜7日後、スフェロイド構造は自発的に形成される。マウスモデルで頭蓋内移植を行う際に、擬似接触形成細胞12に囲まれた壊死コアを示す腫瘍を形成する。これは、GBM患者に見られる特性によく似ています。
この記事では、再現性を確保するために、特定の数のセルからスフェロイドを生成するプロトコルについて説明します。この目的には、マトリゲルとコラーゲンタイプI.Matrigelが増殖因子に富み、細胞の取り付けと移動に必要な哺乳類の基底膜を模倣する2つの相補行列を使用できます。一方、間質の構造要素であるコラーゲンタイプIは、最も一般的な線維体細胞外マトリックスであり、細胞浸潤アッセイに使用されています。本明細書において、我々は、移行および増殖アッセイを行うことにより、我々のGBMスフェロイドモデルを説明する。解析は、固定された時点だけでなく、ライブイメージングによるスフェロイド膨張と細胞の動きを監視することによっても行った。さらに、電子顕微鏡検査を行い、形態学的詳細を可視化した。
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Protocol
インフォームド・コンセントは、すべての患者(地元の倫理委員会の規則に従ってノルウェーのベルゲンのハウケランド病院から)から得られました。当社の議定書は、当社の機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。
1. 均一なサイズの腫瘍スフェロイドの生成
注:ステム様細胞は、前の記事12に記載されているように、B27サプリメント、ヘパリン、FGF-2、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補完する神経基底培地で培養される。これらの細胞は、培養中に自発的にスフェロイドを形成する。
- 5 mL リン酸緩衝塩基食 (PBS) で腫瘍細胞を洗浄し、37 °C で 5 分間 0.5-1 mL 解離酵素 (材料表を参照) で細胞をインキュベートします。
- 4-4.5 mL PBSで洗浄し、完全な成長培地(完全な神経基底培地、cNBM)の10 mLを追加します。
- トリパンブルーとセルカウントチャンバースライドを使用して自動カウント技術を使用してセルをカウントします。
- 104個のセルを含む100個のスフェロイドを生成するには(好ましいサイズに従って)、2%メチルセルロースの2mLでNBMの8 mLに106細胞を混合する。
- サスペンションを無菌システムコンテナに移し、マルチチャンネルピペットで100 μL/wellを96ウェルラウンドボトムプレートに分配します。
- プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。2等しいサイズの回転楕円体が形成され、3〜4日後に使用することができます。
2. 三次元実験
- 増殖
- 準備
- 懸濁剤(例えば、図4AAのようにロテノン)および化学物質を100μLの培地に加え、各ウェル内の培地の100μL(すなわち、ウェルあたり1つのスフェロイド)に加える。
- プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。2
- 画像の取得と解析
- 明視野でビデオ顕微鏡で写真を撮って、T0で一連の条件を作成し、次の時間を予想します。
- 手動または半自動で画像を分析するには、フィジーを使用します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円コアの周りに円を描き、各回転楕円体の面積を測定します。半自動化された方法で画像を分析するには、補足文書 1に示されているマクロを //Core 領域のみで使用します。
- 準備
- 侵略
- 準備
- 1 mg/mL最終濃度のI型コラーゲン、1x PBS、0.023xVコラーゲン、1M水酸化ナトリウム、滅菌H2O.30分間氷上で溶液をインキュベートして、氷の上のチューブにコラーゲンマトリックスを準備します。
- 500 μL チューブの丸底ウェルプレートからスフェロイドを回収し、200 μL 1x PBS で 2x を洗浄します。
- スピペットは、通常の96ウェルプレートのウェルの中央に慎重に100 μLのコラーゲンマトリックスの100 μLにスプヘロイドを挿入します。
- コラーゲンゲルを37°Cで30分間インキュベートし、ゲルの上にcNBMを加えます。阻害剤または活性化剤(例えば、図4B、4Cに示すような塩化水素)は、この工程で培地に添加することができる。
- 画像の取得と解析
- コラーゲンを含み込んだ後、明視野モード24時間でビデオ顕微鏡で連続して写真を撮る。
- 手動または半自動で画像を分析するには、フィジーを使用します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円体のコアと総面積を中心に描画し、コア領域を持つ総面積を減算して各スフェロイドの侵襲領域を測定します。半自動化された方法で画像を分析するには、補足文書 1に示されているマクロを使用して、侵襲的領域を判別します。
- 準備
- 移行
- 準備
- 6ウェルプレートにマトリゲル(0.2 mg/mL)を37°Cで30分間NBMに塗り、マトリゲルを取り除き、2 mLのcNBMを加えます。
- スフェロイドを丸底ウェルプレートから6ウェルプレートに50 μLのcNBMに移します。
- プレートを37°Cでインキュベートし、スフェロイドが付着するまで30分待ちます。
- 24時間のインキュベーションの後、10 ng/mLのHoechstで染色し、37°Cで30分インキュベートする。
- 画像の取得と解析
- 明視野のビデオ顕微鏡を使用して画像を取得します。405 nmレーザーは、Hoechst染色の可視化に使用されます。
- フィジーのソフトウェアを使用して画像を分析し、補足文書 1に示すようにマクロを実行します。
注:ウェルの底部に触れたり、上澄み物を完全に取り除いたりすると、回転楕円体に損傷を与えます。コラーゲンタイプIゲル処理の場合、コラーゲン重合を避けるためにゲルを氷上に保ち、pHの変化がゲルのコンパクトさに影響を与えるので酸性成分を添加せず、ピペット細胞をコラーゲンに急速に加えて細胞死やゲルの分解を防ぎます。
- 準備
3. フィジーマクロ
注:フィジーは、画像解析を高速化するマクロの開発を可能にするパブリックドメインで開発された画像分析プログラムです。手動分析も可能ですが、これは遅いプロセスであり、バイアスを引き起こす可能性があります。イメージはソフトウェアのドラッグアンドドロップでインポートし、ROIマネージャーツールプラグインで定量化することができます。この研究で使用される手順は、以下のとおりです。
- マクロウィンドウを開く:プラグイン |マクロ |インタラクティブインタプリタ.
- 次の紫色のループをコピーして貼り付けます。紫色の文章を保持し、関心のある緑色の文を追加します (補足文書 1)。
- シリーズ全体を分析するには、特定の定量化に合わせてパラメータを赤色で調整し、マクロ|マクロを実行するか、Ctrl キーを押しながら Rキーを押します。
- 必要に応じて、対象領域 (ROI) を手動で調整します。
4. スフェロイドの電子顕微鏡
注:次の手順のほとんどは、化学フードで行う必要があります。
- 固定ステップ
- 切り取ったピペットチップでスフェロイドを回収し、1.5mLチューブに入れ、0.1Mリン酸緩衝液(PB)で1倍洗います。
- スフェロイドを2%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩0.1M PBで固定します。
- 0.1 M PBの1%PFAの溶液に置換し、次にサンプル調製物を置き換えます。
- サンプル準備
- ストレーナーにスフェロイドを移し、スフェロイドの損傷を避けるためにガラスビーカーに入れます。
- 0.1 M PBで3倍丁寧に洗います。
- 暗闇の中でオスミウムを2時間インキュベートする。1%0.1 M PBの緩衝液の4%にオスミウムを希釈する。
- 0.1 M PBで3倍丁寧に洗います。
- 脱水乾燥:50%エタノールを10分間、70%エタノールで10分間、2x90%エタノールで15分間、2x100%エタノール20分間、2xアセトンを30分間に浸します。
- アセトン/樹脂の混合物を50/50で2時間インキュベートします。このステップの間に、EPON樹脂を準備する(埋め込み-812:11.25グラム;DDSA: 9 g;NMA: 4.5 g)。
- アセトン/樹脂混合物を捨て、作りたての樹脂に交換し、一晩インキュベートします。
- 樹脂を新しいものに交換し、2~6時間の間にインキュベートします。
- 樹脂中のスフェロイドを60°Cの金型に48-72時間加えます。
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Representative Results
スフェロイドはプロトコルセクションに記載されているように調製し、移行、浸潤、増殖、顕微鏡観察に関する観察を行った。球状構造の異なる領域における低酸素症を測定するために、低酸素活性を決定するためにカルボキシ性無水酵素IX染色を用いた(図1A-C)。スフェロイド中心では、より多くのCAIX陽性細胞が観察された(図1A-C)。スフェロイドコアに位置する低酸素細胞は、周囲の細胞よりも解糖性が高い傾向がある。ミトコンドリアは、電子顕微鏡で示すように、さらなる分析のために画像化することができます(図1Ba-1Bb)。2.5 x 103、5x 10 3、104、または2 x 104細胞から構成されるスフェロイドは、それぞれ約350、400、500、または650μmの回転楕円体径を示す(図2A)。34回転楕円体は、実験開始後4日以内に使用することができる(図2B)。各アッセイの定量化(すなわち、増殖、浸潤、移動)を図3に示す。フィジーマクロは、拡散、侵入、または移行を定量化するために開発されました (図 3および補足文書 1)。
スフェロイドコアの増加は細胞増殖の刺激を反映した(図4A)。ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Iの確立された阻害剤であるロテノンによる阻害により、ミトコンドリアにおけるATP産生の大部分が損なわれた。その結果、72時間後に増殖が20%減少した(図4A)。コラーゲン型Iの浸潤は、コア領域からの総面積の減算によって算出した。酸性処理は24時間の期間にわたって浸潤を増強した(図4B)。さらに、塩化水素処理は、コントロールと比較してスフェロイドの回遊面積を1.5倍に減少させることがわかりました(図4C)。回転楕円体力学は、UniverSlide13でライブイメージング用マウントによって研究された。スフェロイドは内部ダイナミクスが高く、素早く移動しました(図4Dのムービー1とトラッキング分析)。
図1:スフェロイドは固形腫瘍を模倣する関連モデルである。(A) 異なる領域を持つ円形の 3D 構造として回転楕円体。()P3回転楕円体の明視野画像は、中央の密集した丸い外観を示します。スケール=100μm(b)ヒルシュハウザーらから適応した模式表現は、回転楕円体におけるO2、CO2、代謝物、およびカタボライトの勾配を示す。b2(c)左パネル: DAPI(青)とカルボキシ性無水酵素IX(緑色)に対する抗体で染色されたスフェロイドの共焦点像。右パネル:破線領域からの蛍光の定量化。スケール = 100 μm(B) 線分のミトコンドリア(破線)を用いた電子顕微鏡画像。大きなミトコンドリアは静止領域で見られ、増殖領域では小さくなります。スケール = 250 nm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:全体的な回転楕円体調製手順。(A)ヒトP3神経膠芽腫回転楕円体の生成代表的な画像は左側のパネルにあり、右側のパネルで対応する拡散解析を行います。24時間で、P3細胞は密な回転楕円体を形成した。細胞の初期数は、回転楕円体のサイズを決定しました。スケールバー = 250 μm(B) 拡散、侵入、または移行を研究するための簡単なプロトコルの概略図。様々な条件下でのスフェロイド: (a) 腫瘍増殖のための無血清培地中、単細胞浸潤を促進するためのコラーゲンマトリックス中、および(c)細胞遊離用のマトリゲルコーティングについて。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: フィジーソフトウェアによるインビトロアッセイの定量化フィジーを使用して取得した対象地域 (ROI) の表現。コア領域は赤で表示され、コア領域を含む合計領域は黄色で表示されます。侵襲領域は、コア領域からの総面積の減算に対応します。(A) 増殖アッセイ.(B) ブライトフィールド獲得におけるコラーゲンゲルの浸潤アッセイ(C)蛍光集録によるマトリゲルコーティングのマイグレーションアッセイ。核は、青色でDAPIで染色した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:増殖、浸潤、または移行アッセイにおけるP3スフェロイドの神経膠芽腫。(A) 増殖アッセイ.左パネル:DMSOをコントロールとして、または20μMのロテノン(呼吸鎖複合体I阻害剤)を持つ代表的な写真を、時間0または72時間で行う。右パネル: 画像の破線で表される回転楕円体領域の定量。スケール = 250 μm(B) コラーゲンマトリックス中の浸潤アッセイ。左パネル:20mM塩化水素の有無にかかわらず、時間0または24時間の代表的な写真。右パネル: 侵襲領域の定量化。スケール = 100 μm(C) マトリゲルコーティング上のマイグレーションアッセイ。左パネル: 時間 0 または 24 時間の明視野モードの代表的な画像. 拡大された領域は下部のパネルに表されます。右パネル: 移動領域の定量化。スケール= 250 μm(D) Zスタック図でスフェロイドの表現 (40 μm ステップ) で(a)スフェロイド動的に18時間(3 h間隔の画像)で(b))。細胞は核mCherry(オレンジ)および細胞質GFP(青)を安定して発現した。スケール = 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:P3スフェロイド動動が18時間(30分毎に撮影)を記録した。スケールバー= 100 μmこの映画は、Zステップ5μmのZステップで経時にマージされたZスタックを表し、およその総体積150μmを有する細胞は、NLS:mCherry(核はオレンジ色)および細胞質GFP(青色)を発現するためにレンチウイルスに感染した。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
補足文書1:3Dスフェロイドの浸潤、増殖、移行を分析するためのフィジーマクロ。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
腫瘍スフェロイドアッセイは、増殖、浸潤、および移動、ならびに細胞死および薬物応答を含む腫瘍特性を研究するのに適している。癌細胞は、図4B,Cに見られるように、侵襲的な微小腫瘍を形成する3Dマトリックスに侵入する。侵襲的プロセス中、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、腫瘍細胞13を取り囲むマトリックスを消化し、MMP阻害剤(例えば、GM6001またはレビマスタット)は細胞浸潤を損なうが、移行しない14。移動と侵入は、重複するが、別々の分子事象15を伴い、これは我々のスフェロイドアッセイで研究することができる。これを行うには、特定のシグナル経路を遺伝的レベルまたは薬理学的阻害を介して標的とすることができる。
神経膠芽腫は、さまざまなプロセスによって周囲の組織を広範囲に侵襲することが知られている(例えば、共オプション、白質管の侵入、間質侵襲)16。我々は最近、神経膠芽腫の侵略99、12、1712,17の2つの新しいメカニズムを説明した。特に、母細胞血栓ポンド-1(TSP1)を研究し、腫瘍細胞12におけるCD47の活性化を通じて腫瘍細胞浸潤に関与していることを示した。さらにプロテオミクスアプローチを用いて、GBMの浸潤17においてPLP1とDNM1の予期せぬ役割を発見した。これらの研究では、3D浸潤アッセイは、TSP1、PLP1、またはDNM1の薬理学的障害の有無にかかわらず、正常に使用された。また、薬理学的閉塞に加えて、塩化水素による酸処理が3Dアッセイの浸潤に影響を与えることも示した。腫瘍アシドーシスは、代謝経路(解糖)を含む多くのシグナル伝達経路を活性化し、TGFβとしての成長因子、及び免疫応答を阻害することが知られている。
三次元培養は、2D培養よりも生理学的に関連する環境を提供し、多くの分子および代謝パラメータは異なる調節を行う可能性がある。したがって、薬理学的変調は異なる影響を及ぼす可能性がある。その結果、標準的な免疫学的研究に加えて、代謝事象は、2-DG-IRなどのプローブを用いて3D培養で研究することもできる。これらの知見を裏付けるために、電子輸送鎖複合体I阻害剤もこの文脈で使用され得る。
さらに、3D培養システムは、基底条件下でのライブイメージングを用いた、または刺激や薬理学的手掛かりの存在下での動的プロセスの研究にも適しています。
この資料に記載されている手順を実行する際に、次の重要な手順を考慮する必要があります: 1) 球体の直径は壊死を避けるために 400 μm を超えてはならない;2)フィジーのソフトウェアを使用して侵略の定量化は慎重に較正され、手順の詳細な説明に示すように実行されなければなりません。3)ゲル剛性は安定した構成で回転楕円体を保持するのに適している必要があります。4) 非常に酸性のpHが浸潤プロセスを妨げるので、pH値を制御する必要があります。
本稿で説明するスフェロイド系の1つの制限は、完全な腫瘍微小環境の欠如である。我々は、使用されるマトリックスが神経膠芽腫に見られる間質を完全に表していないことを認める。しかし、コラーゲンは脳マトリックスの一部であり、どんな実験室でも使用できる準備ができて使いやすいアッセイを開発したいと考えていました。それにもかかわらず、将来の実験には、増設マトリックス成分と細胞要素、ならびに間質および免疫細胞を含むことも含まれる。もう一つの複雑さのレベルは、神経細胞成分の含みであるが、これらの実験は慎重に較正され、設計されなければならない。
結論として、私たちのスフェロイド3Dシステムとこの記事で提供する分析ツールは、特に脳腫瘍の発達を研究する研究者にとって有用であると考えています。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この作品は、トランスカン2017、ARC 2017、リーグ・コントル・ル・ガン(コミテ・ド・ラ・ジロンド・エ・ド・ラ・シャラント・マリタイム)によってサポートされました。ジョリス・ギヨンはトゥールーズ大学病院(CHUトゥールーズ)からフェローシップを受けています。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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