Här karakteriserar vi cellulära proteotoxiska stresssvar i nematoden C. elegans genom att mäta aktiveringen av fluorescerande transkriptionella reportrar och analysera känslighet för fysiologisk stress.
Organismer utsätts ofta för fluktuerande miljöer och förändringar i intracellulära homeostas, vilket kan ha skadliga effekter på deras proteom och fysiologi. Således har organismer utvecklats riktade och specifika stressreaktioner avsedda för att reparera skador och upprätthålla homeostas. Dessa mekanismer inkluderar det ovikta proteinsvaret hos den endoplasmatiska reticulum (UPRER),mitokondriernas (UPRMT)utvecklade proteinrespons (HSR) och oxidativstressrespons (OxSR). De protokoll som presenteras här beskriver metoder för att upptäcka och karakterisera aktiveringen av dessa vägar och deras fysiologiska konsekvenser i nematoden, C. elegans. För det första beskrivs användningen av pathway-specifika fluorescerande transkriptionella reportrar för snabb cellulär karakterisering, läkemedelsscreening eller storskalig genetisk screening (t.ex. RNAi eller mutantbibliotek). Dessutom beskrivs kompletterande, robusta fysiologiska analyser, som kan användas för att direkt bedöma djurens känslighet för specifika stressfaktorer, vilket fungerar som funktionell validering av de transkriptionsreportrar. Tillsammans möjliggör dessa metoder snabb karakterisering av de cellulära och fysiologiska effekterna av interna och externa proteotoxiska störningar.
En organisms förmåga att reagera på förändringar i den intra- och extracellulära miljön är avgörande för dess överlevnad och anpassning. Detta sker på cellnivå genom många skyddande vägar som säkerställer integriteten i cellen. Medan många cellulära komponenter är föremål för stress-associerade skador, en stor inblandning av cellulära stress svar är att reparera och skydda homeostas av cellulära proteom. Men uppdelningen av proteiner i speciella strukturer, som kallas organeller, utgör en utmaning för cellen, eftersom den inte kan förlita sig på en centraliserad form av proteinkvalitetskontroll för att säkerställa att alla proteiner i cellen är ordentligt vikta och funktionella. Därför, för att hantera störningar i sina proteiner, organeller har utvecklats dedikerade mekanismer för kvalitetskontroll, som kan känna felvikta proteiner och aktivera en stressrespons i ett försök att lindra stress inom detta utrymme. Cytosolen förlitar sig till exempel på värmechocksvaret (HSR), medan det endoplasmatiska reticulum (ER) och mitokondrierna förlitar sig på sina fackspecifika ovikta proteinsvar (UPR). OxSR tjänar till att lindra de toxiska effekterna av reaktiva syrearter (ROS). Varje stressrespons utlöses i närvaro av cellulära utmaningar och miljöföreskrifter och inducerar ett skräddarsytt transkriptionellt svar. Kännetecknen för dessa svar inkluderar syntetiserande molekyler som åter vika felvikta proteiner (såsom förkläde) riktade till rätt organell, eller alternativt ta bort skadade proteiner genom proteinnedbrytning. Underlåtenhet att aktivera dessa stressreaktioner resulterar i ansamling av skadade proteiner, cellulär dysfunktion förökas till systemisk fel i vävnader, och så småningom död av organismen. Funktionen och regleringen av de olika stressreaktionerna ses över någon annanstans1.
Många insikter om reglering och aktivitet av cellulära stressreaktioner har tillskrivits nematoden, Caenorhabditis elegans, en flercellig modell organism i genetisk forskning. Nematoder tillåter inte bara att studera aktivering av stressreaktioner på cellnivå, men också på organismnivå; nematoder har använts för att studera effekterna av genetiska störningar eller exponering för läkemedel och föroreningar på deras tillväxt och överlevnad. Deras snabba generationstid, isogeny, öppenhet, genetisk tractability, och användarvänlighet under experiment gör dem idealiska för sådana studier. Dessutom, den relativt snabba fysiologiska svar på stress (mellan timmar och några dagar) och den evolutionära bevarande av cellulära vägar gör nematoder ett framträdande verktyg för att studera stresstålighet.
Det finns två vanliga E. coli stammar som används som en näringskälla för att odla C. elegans:standard OP50, en B-stam där de flesta experiment har historiskt utförts2 och HT115, en K-12 stam som används för nästan alla RNAi experiment3,4. Det är viktigt att notera att det finns betydande skillnader mellan OP50 och HT115 bakteriell kost. Tillväxt på dessa olika bakteriella källor har visat sig orsaka stora skillnader i metabolisk profil, mitokondriellt DNA-kopieringsnummer, och flera stora fenotyper, inklusive livslängd5. Några av dessa skillnader tillskrivs vitamin B12 brist i samband med tillväxt på OP50 bakterier, vilket kan resultera i defekter i mitokondriell homeostas och ökad känslighet för patogener och påfrestningar. Alla dessa fenotyper har visat sig lindras genom tillväxt på HT115 bakterier, som har högre nivåer av vitamin B126. Därför rekommenderas att alla experiment på fysiologiska stressreaktioner utförs på HT115-bakterier, oavsett nödvändigheten av RNAi-tillstånd. På grund av att djuren är lätta att underhålla op50 kan dock all standardtillväxt (dvs. underhåll och förstärkning av djur) utföras på OP50, eftersom betydande skillnader i de experimentella paradigm som beskrivs här inte upptäcktes i maskar som upprätthålls på OP50 så länge de flyttades till HT115 efter synkronisering (dvs. från kläckning efter blekning med eller utan L1 gripande) fram till experiment.
Här beskrivs karakteriseringen av aktiviteten hos cellulära stressreaktioner med hjälp av två funktionella metoder. Det bör noteras att de protokoll som presenteras är främst inriktade på cellulära stressreaktioner och deras inverkan på protein homeostas. Först används fluorescerande transkriptionsreportrar, som regleras av endogena genpromotorer som är specifikt aktiverade som svar på olika cellulära påfrestningar. Dessa fluorescerande transkriptionella reportrar är baserade på transkriptionell induktion av specifika gener som är inbyggt en del av stressresponsen. Till exempel, HSP-4, en värmechock protein orthologous till den mänskliga förkläde HSPA5/BiP, aktiveras vid ER-stress och lokaliserar till ER för att lindra stress. Under förhållanden av ER-stress (t.ex. syntetiseras exponering för tunicamycin), ett grönt fluorescerande protein (GFP), som placeras enligt hsp-4-promotorns reglering, i höga nivåer som kan bedömas genom fluorescerande mikroskopi eller kvantitativt mätas med hjälp av stor partikelflödescytometri av nematoder7. På samma sätt används promotorn för ett mitokondriellt förkläde, hsp-6 (ortos till däggdjurs-HSPA9), för att övervaka aktiveringen av UPRMT8, och promotorn av cytosolic förkläde hsp-16,2 (ortos till de mänskliga crystallin alfagener) används för att bedöma aktiviteten hos HSR9. Dessa reportrar möjliggör en snabb karakterisering av de vägar som aktiveras som svar på olika störningar.
Ofta är de reportrar som presenteras här avbildade med hjälp av mikroskopi, vilket ger en kvalitativ effekt av aktivering av stressreaktioner. Men medan bildframställning tekniker ger både information om intensitet och vävnad plats för reportrar som beskrivs ovan, är dess kvantifiering inte alltid korrekt eller robust. Även om det är möjligt att kvantifiera fluorescerande aktivering med hjälp av bildanalysverktyg, är dessa metoder relativt låga genomströmning och provstorleken är liten, på grund av det relativt låga antalet avbildade djur. Den lätthet och förmåga att få stora mängder djur snabbt göra C. elegans en idealisk modell system för att analysera aktivering av fluorescerande stress reportrar med hjälp av en stor partikel flöde cytometer. En stor partikelflödescytmeter kan registrera, analysera och sortera baserat på storlek och fluorescens från många levande djur. Med den här metoden är det möjligt att få fluorescerande intensitet, storlek och även rumslig (2D) information för tusentals maskar. Systemet styrs med FlowPilot, vilket möjliggör datainsamling och analys i realtid av de uppmätta parametrarna. Här erbjuds metoder för både mikroskopisk avbildning och kvantitativ analys med hjälp av en stor partikelflödescytometer som metoder för att mäta aktivering av stressreaktioner.
Utöver reporteranalys kan djurens känslighet eller motståndskraft mot stress mätas med hjälp av fysiologiska stressanalyser. Detta uppnås genom att utsätta djur för stressiga miljöer som aktiverar specifika cellulära stressvägar. Här finns flera metoder för att mäta hela djurs känslighet för specifika typer av stressfaktorer.
ER stress appliceras på C. elegans med hjälp av det kemiska medlet, tunicamycin, som blockerar N-linked glykosylering, orsakar ansamling av felvikta proteiner i ER10. I C. elegans, tillväxt vid exponering för tunicamycin resulterar i stora störningar i ER funktion, och en betydligt minskad livslängd11. Genom att mäta djurens överlevnad på tunicamycinhaltiga plattor kan ER-stresskänsligheten hos djur kvantifieras. Till exempel, djur med ectopic UPRER induktion och därmed ökad motståndskraft mot protein felvikning stress i ER har en ökad överlevnad vid tunicamycin exponering jämfört med vilda djur12.
Oxidativ och mitokondriell stress appliceras på C. elegans genom att utsätta djur för det kemiska medlet, parakvat. Parakvat är en vanligt förekommande herbicid, som orsakar superoxid bildning specifikt i mitokondrierna13. På grund av den specifika lokaliseringen av mitokondrierna-härledda reaktiva syrearter (ROS), parakvat analyser används ofta som en “mitokondriell” stressanalys. Superoxid omvandlas dock snabbt till väteperoxid genom mitokondriell superoxiddismutaser (SODs)14. Väteperoxid kan därefter sprida sig ur mitokondrierna och orsaka oxidativ stress i andra delar av cellen. Därför beskriver vi parakvat överlevnadsanalyser som mätkänslighet för både mitokondriell och oxidativ stress (andra oxidativa stressanalyser kan hittas15).
Termotolerance analyser utförs i C. elegans genom att placera djur i förhöjda temperaturer. Omgivningstemperaturen för nematoder är ~15-20 °C och termisk stress framkallas vid temperaturer över 25 °C16,17. Termotolerance analyser utförs i allmänhet vid temperaturer från 30-37 °C, eftersom djur uppvisar stora cellulära defekter vid denna temperatur, och överlevnadsanalyser slutförs inom 24 timmar16,18. Här finns två alternativa metoder för att utföra termotoleranceanalyser: tillväxt vid 34 °C och tillväxt vid 37 °C. Tillsammans kan de protokoll som presenteras här användas för att utföra storskaliga skärmar i kombination med standardgen knock-down med RNA-interferens eller kemiska läkemedelsbibliotek.
Protokollet kan delas upp i 4 breda förfaranden- tillväxt av C. elegans och förberedelse för bildbehandling (avsnitt 1 och 2), avbildning av transkriptionella reportrar med fluorescerande mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitativa mätningar av reportrar med hjälp av en stor partikelflödescytometer (avsnitt 6) och fysiologiska analyser för att mäta stresskänslighet i C. elegans (avsnitt 7).
Här beskrivs metoder för att förhöra cellulära stressreaktioner i C. elegans– med hjälp av fluorescerande transkriptionsreportrar och fysiologiska stressöverlevnadsanalyser. Reportrarna använder alla GFP uttryck drivs under initiativtagare till en nedströms transkriptionella mål för transkription faktorer som är inblandade i montering cellulära stressreaktioner. Användningen av hsp-4p::GFP moduleras av XBP-1s-medierad UPRER, hsp-6p::GFP kontrolleras av ATFS-1-medierad…
The authors have nothing to disclose.
R.BZ. stöds av EMBO:s långsiktiga stipendium och Larry L. Hillbloms stiftelse. R.H.S stöds av bidrag 5F32AG032023-02 genom National Institute of Aging (NIA) och Glenn Foundation for Medical Research Postdoc Fellowship. A.F. stöds genom bidrag F32AG0513555 genom NIA. H.K.G. stöds av grant DGE1752814 genom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. stöds av 1F31AG060660-01 genom NIA. AD stöds av Thomas och Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, och 4R01AG042679-04 och 5R01AG055891-02 från NIA, och 5R01ES021667-09 från NIEHS. Vi tackar Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet och Anel Esquivel för betydande tekniskt stöd. Vi tackar Morimoto labbet och CGC (finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) för stammar.
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |