Summary

Mätningar av fysiologiska stressreaktioner i C. Elegans

Published: May 21, 2020
doi:

Summary

Här karakteriserar vi cellulära proteotoxiska stresssvar i nematoden C. elegans genom att mäta aktiveringen av fluorescerande transkriptionella reportrar och analysera känslighet för fysiologisk stress.

Abstract

Organismer utsätts ofta för fluktuerande miljöer och förändringar i intracellulära homeostas, vilket kan ha skadliga effekter på deras proteom och fysiologi. Således har organismer utvecklats riktade och specifika stressreaktioner avsedda för att reparera skador och upprätthålla homeostas. Dessa mekanismer inkluderar det ovikta proteinsvaret hos den endoplasmatiska reticulum (UPRER),mitokondriernas (UPRMT)utvecklade proteinrespons (HSR) och oxidativstressrespons (OxSR). De protokoll som presenteras här beskriver metoder för att upptäcka och karakterisera aktiveringen av dessa vägar och deras fysiologiska konsekvenser i nematoden, C. elegans. För det första beskrivs användningen av pathway-specifika fluorescerande transkriptionella reportrar för snabb cellulär karakterisering, läkemedelsscreening eller storskalig genetisk screening (t.ex. RNAi eller mutantbibliotek). Dessutom beskrivs kompletterande, robusta fysiologiska analyser, som kan användas för att direkt bedöma djurens känslighet för specifika stressfaktorer, vilket fungerar som funktionell validering av de transkriptionsreportrar. Tillsammans möjliggör dessa metoder snabb karakterisering av de cellulära och fysiologiska effekterna av interna och externa proteotoxiska störningar.

Introduction

En organisms förmåga att reagera på förändringar i den intra- och extracellulära miljön är avgörande för dess överlevnad och anpassning. Detta sker på cellnivå genom många skyddande vägar som säkerställer integriteten i cellen. Medan många cellulära komponenter är föremål för stress-associerade skador, en stor inblandning av cellulära stress svar är att reparera och skydda homeostas av cellulära proteom. Men uppdelningen av proteiner i speciella strukturer, som kallas organeller, utgör en utmaning för cellen, eftersom den inte kan förlita sig på en centraliserad form av proteinkvalitetskontroll för att säkerställa att alla proteiner i cellen är ordentligt vikta och funktionella. Därför, för att hantera störningar i sina proteiner, organeller har utvecklats dedikerade mekanismer för kvalitetskontroll, som kan känna felvikta proteiner och aktivera en stressrespons i ett försök att lindra stress inom detta utrymme. Cytosolen förlitar sig till exempel på värmechocksvaret (HSR), medan det endoplasmatiska reticulum (ER) och mitokondrierna förlitar sig på sina fackspecifika ovikta proteinsvar (UPR). OxSR tjänar till att lindra de toxiska effekterna av reaktiva syrearter (ROS). Varje stressrespons utlöses i närvaro av cellulära utmaningar och miljöföreskrifter och inducerar ett skräddarsytt transkriptionellt svar. Kännetecknen för dessa svar inkluderar syntetiserande molekyler som åter vika felvikta proteiner (såsom förkläde) riktade till rätt organell, eller alternativt ta bort skadade proteiner genom proteinnedbrytning. Underlåtenhet att aktivera dessa stressreaktioner resulterar i ansamling av skadade proteiner, cellulär dysfunktion förökas till systemisk fel i vävnader, och så småningom död av organismen. Funktionen och regleringen av de olika stressreaktionerna ses över någon annanstans1.

Många insikter om reglering och aktivitet av cellulära stressreaktioner har tillskrivits nematoden, Caenorhabditis elegans, en flercellig modell organism i genetisk forskning. Nematoder tillåter inte bara att studera aktivering av stressreaktioner på cellnivå, men också på organismnivå; nematoder har använts för att studera effekterna av genetiska störningar eller exponering för läkemedel och föroreningar på deras tillväxt och överlevnad. Deras snabba generationstid, isogeny, öppenhet, genetisk tractability, och användarvänlighet under experiment gör dem idealiska för sådana studier. Dessutom, den relativt snabba fysiologiska svar på stress (mellan timmar och några dagar) och den evolutionära bevarande av cellulära vägar gör nematoder ett framträdande verktyg för att studera stresstålighet.

Det finns två vanliga E. coli stammar som används som en näringskälla för att odla C. elegans:standard OP50, en B-stam där de flesta experiment har historiskt utförts2 och HT115, en K-12 stam som används för nästan alla RNAi experiment3,4. Det är viktigt att notera att det finns betydande skillnader mellan OP50 och HT115 bakteriell kost. Tillväxt på dessa olika bakteriella källor har visat sig orsaka stora skillnader i metabolisk profil, mitokondriellt DNA-kopieringsnummer, och flera stora fenotyper, inklusive livslängd5. Några av dessa skillnader tillskrivs vitamin B12 brist i samband med tillväxt på OP50 bakterier, vilket kan resultera i defekter i mitokondriell homeostas och ökad känslighet för patogener och påfrestningar. Alla dessa fenotyper har visat sig lindras genom tillväxt på HT115 bakterier, som har högre nivåer av vitamin B126. Därför rekommenderas att alla experiment på fysiologiska stressreaktioner utförs på HT115-bakterier, oavsett nödvändigheten av RNAi-tillstånd. På grund av att djuren är lätta att underhålla op50 kan dock all standardtillväxt (dvs. underhåll och förstärkning av djur) utföras på OP50, eftersom betydande skillnader i de experimentella paradigm som beskrivs här inte upptäcktes i maskar som upprätthålls på OP50 så länge de flyttades till HT115 efter synkronisering (dvs. från kläckning efter blekning med eller utan L1 gripande) fram till experiment.

Här beskrivs karakteriseringen av aktiviteten hos cellulära stressreaktioner med hjälp av två funktionella metoder. Det bör noteras att de protokoll som presenteras är främst inriktade på cellulära stressreaktioner och deras inverkan på protein homeostas. Först används fluorescerande transkriptionsreportrar, som regleras av endogena genpromotorer som är specifikt aktiverade som svar på olika cellulära påfrestningar. Dessa fluorescerande transkriptionella reportrar är baserade på transkriptionell induktion av specifika gener som är inbyggt en del av stressresponsen. Till exempel, HSP-4, en värmechock protein orthologous till den mänskliga förkläde HSPA5/BiP, aktiveras vid ER-stress och lokaliserar till ER för att lindra stress. Under förhållanden av ER-stress (t.ex. syntetiseras exponering för tunicamycin), ett grönt fluorescerande protein (GFP), som placeras enligt hsp-4-promotorns reglering, i höga nivåer som kan bedömas genom fluorescerande mikroskopi eller kvantitativt mätas med hjälp av stor partikelflödescytometri av nematoder7. På samma sätt används promotorn för ett mitokondriellt förkläde, hsp-6 (ortos till däggdjurs-HSPA9), för att övervaka aktiveringen av UPRMT8, och promotorn av cytosolic förkläde hsp-16,2 (ortos till de mänskliga crystallin alfagener) används för att bedöma aktiviteten hos HSR9. Dessa reportrar möjliggör en snabb karakterisering av de vägar som aktiveras som svar på olika störningar.

Ofta är de reportrar som presenteras här avbildade med hjälp av mikroskopi, vilket ger en kvalitativ effekt av aktivering av stressreaktioner. Men medan bildframställning tekniker ger både information om intensitet och vävnad plats för reportrar som beskrivs ovan, är dess kvantifiering inte alltid korrekt eller robust. Även om det är möjligt att kvantifiera fluorescerande aktivering med hjälp av bildanalysverktyg, är dessa metoder relativt låga genomströmning och provstorleken är liten, på grund av det relativt låga antalet avbildade djur. Den lätthet och förmåga att få stora mängder djur snabbt göra C. elegans en idealisk modell system för att analysera aktivering av fluorescerande stress reportrar med hjälp av en stor partikel flöde cytometer. En stor partikelflödescytmeter kan registrera, analysera och sortera baserat på storlek och fluorescens från många levande djur. Med den här metoden är det möjligt att få fluorescerande intensitet, storlek och även rumslig (2D) information för tusentals maskar. Systemet styrs med FlowPilot, vilket möjliggör datainsamling och analys i realtid av de uppmätta parametrarna. Här erbjuds metoder för både mikroskopisk avbildning och kvantitativ analys med hjälp av en stor partikelflödescytometer som metoder för att mäta aktivering av stressreaktioner.

Utöver reporteranalys kan djurens känslighet eller motståndskraft mot stress mätas med hjälp av fysiologiska stressanalyser. Detta uppnås genom att utsätta djur för stressiga miljöer som aktiverar specifika cellulära stressvägar. Här finns flera metoder för att mäta hela djurs känslighet för specifika typer av stressfaktorer.

ER stress appliceras på C. elegans med hjälp av det kemiska medlet, tunicamycin, som blockerar N-linked glykosylering, orsakar ansamling av felvikta proteiner i ER10. I C. elegans, tillväxt vid exponering för tunicamycin resulterar i stora störningar i ER funktion, och en betydligt minskad livslängd11. Genom att mäta djurens överlevnad på tunicamycinhaltiga plattor kan ER-stresskänsligheten hos djur kvantifieras. Till exempel, djur med ectopic UPRER induktion och därmed ökad motståndskraft mot protein felvikning stress i ER har en ökad överlevnad vid tunicamycin exponering jämfört med vilda djur12.

Oxidativ och mitokondriell stress appliceras på C. elegans genom att utsätta djur för det kemiska medlet, parakvat. Parakvat är en vanligt förekommande herbicid, som orsakar superoxid bildning specifikt i mitokondrierna13. På grund av den specifika lokaliseringen av mitokondrierna-härledda reaktiva syrearter (ROS), parakvat analyser används ofta som en “mitokondriell” stressanalys. Superoxid omvandlas dock snabbt till väteperoxid genom mitokondriell superoxiddismutaser (SODs)14. Väteperoxid kan därefter sprida sig ur mitokondrierna och orsaka oxidativ stress i andra delar av cellen. Därför beskriver vi parakvat överlevnadsanalyser som mätkänslighet för både mitokondriell och oxidativ stress (andra oxidativa stressanalyser kan hittas15).

Termotolerance analyser utförs i C. elegans genom att placera djur i förhöjda temperaturer. Omgivningstemperaturen för nematoder är ~15-20 °C och termisk stress framkallas vid temperaturer över 25 °C16,17. Termotolerance analyser utförs i allmänhet vid temperaturer från 30-37 °C, eftersom djur uppvisar stora cellulära defekter vid denna temperatur, och överlevnadsanalyser slutförs inom 24 timmar16,18. Här finns två alternativa metoder för att utföra termotoleranceanalyser: tillväxt vid 34 °C och tillväxt vid 37 °C. Tillsammans kan de protokoll som presenteras här användas för att utföra storskaliga skärmar i kombination med standardgen knock-down med RNA-interferens eller kemiska läkemedelsbibliotek.

Protokollet kan delas upp i 4 breda förfaranden- tillväxt av C. elegans och förberedelse för bildbehandling (avsnitt 1 och 2), avbildning av transkriptionella reportrar med fluorescerande mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitativa mätningar av reportrar med hjälp av en stor partikelflödescytometer (avsnitt 6) och fysiologiska analyser för att mäta stresskänslighet i C. elegans (avsnitt 7).

Protocol

1. Standardtillväxtförhållanden för temperaturer och OP50 vs HT115 Standardtillväxt och expansion Odla en odling av OP50 i LB(tabell 1)eller motsvarande media val för 24-48 h vid rumstemperatur (~ 22-25 °C). Odla bakterier i rumstemperatur eftersom OP50 är en uracil auxotroph och det finns en högre incidens av revertants (t.ex. suppressor mutanter) när de odlas vid 37 °C. Långtidslagring av OP50-kulturer rekommenderas inte (max 1 vecka vid 4 °C). Sådd en volym a…

Representative Results

Använda transkriptionella reportrar för att mäta aktivering av stressreaktionerHär används fluorescerande transkriptionsreportrar, som fungerar som robusta verktyg för att mäta aktivering av de flesta stressreaktioner i C. elegans. GFP-uttrycket drivs under initiativtagare till kanoniska mål för master transkriptionella tillsynsmyndigheter som arbetar med att reagera på fackspecifika påfrestningar. En omfattande förteckning över vanliga transkrip…

Discussion

Här beskrivs metoder för att förhöra cellulära stressreaktioner i C. elegans– med hjälp av fluorescerande transkriptionsreportrar och fysiologiska stressöverlevnadsanalyser. Reportrarna använder alla GFP uttryck drivs under initiativtagare till en nedströms transkriptionella mål för transkription faktorer som är inblandade i montering cellulära stressreaktioner. Användningen av hsp-4p::GFP moduleras av XBP-1s-medierad UPRER, hsp-6p::GFP kontrolleras av ATFS-1-medierad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ. stöds av EMBO:s långsiktiga stipendium och Larry L. Hillbloms stiftelse. R.H.S stöds av bidrag 5F32AG032023-02 genom National Institute of Aging (NIA) och Glenn Foundation for Medical Research Postdoc Fellowship. A.F. stöds genom bidrag F32AG0513555 genom NIA. H.K.G. stöds av grant DGE1752814 genom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. stöds av 1F31AG060660-01 genom NIA. AD stöds av Thomas och Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, och 4R01AG042679-04 och 5R01AG055891-02 från NIA, och 5R01ES021667-09 från NIEHS. Vi tackar Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet och Anel Esquivel för betydande tekniskt stöd. Vi tackar Morimoto labbet och CGC (finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) för stammar.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

References

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011 (2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37 (2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792 (2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762 (2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466 (2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701 (2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177 (2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Play Video

Cite This Article
Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).

View Video