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Immunology and Infection

मूत्र बी-1ए कोशिकाओं पर CXCR4 का रेट्रोवायरल अतिअभिव्यक्ति और बोन मैरो और आईजीएम उत्पादन के लिए लक्षित बी-1ए सेल माइग्रेशन के लिए दत्तक हस्तांतरण

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61003
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

Summary

यहां हम वीवो बी-1ए सेल माइग्रेशन और स्थानीयकरण में जांच करने के लिए रेट्रोवायरल अतिअभिव्यक्ति और मूत्र बी-1ए कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को विविध डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परखों के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसमें दाता बी-1ए सेल स्थानीयकरण या दाता सेल-व्युत्पन्न गुप्त कारकों के विश्लेषण के बाद दत्तक हस्तांतरण शामिल हैं।

Abstract

चूंकि सेल फ़ंक्शन सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट में आला-विशिष्ट कारकों से प्रभावित होता है, इसलिए सेल स्थानीयकरण और माइग्रेशन को विच्छेदन करने के तरीके सेल फ़ंक्शन पर आगे की जानकारी प्रदान कर सकते हैं। बी-1ए कोशिकाएं चूहों में एक अद्वितीय बी सेल सबसेट हैं जो स्वास्थ्य और रोग के दौरान उत्पन्न होने वाले ऑक्सीकरण-विशिष्ट एपिटोप के खिलाफ सुरक्षात्मक प्राकृतिक आईजीएम एंटीबॉडी का उत्पादन करती हैं। बी-1ए सेल आईजीएम उत्पादन बी-1 ए सेल स्थान के आधार पर अलग है, और इसलिए यह उच्च एंटीबॉडी उत्पादन के सहायक निकस के लिए बी-1ए स्थानीयकरण को लक्षित करने के लिए एक चिकित्सीय दृष्टिकोण से उपयोगी हो जाता है। यहां हम सी-एक्स-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 4 (CXCR4) के रेट्रोवायरल-मध्यस्थता अतिअभिव्यक्ति द्वारा बोन मैरो में बी-1ए सेल माइग्रेशन को लक्षित करने की विधि का वर्णन करते हैं। प्राथमिक मूत्र बी कोशिकाओं में जीन प्रेरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है और आम तौर पर तकनीक के आधार पर 10-20% की कम ट्रांसफेक्शन क्षमता पैदा करता है। यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि प्राथमिक मूत्र बी-1ए कोशिकाओं के रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन के परिणामस्वरूप 30-40% ट्रांसड्यूक्शन दक्षता होती है। यह विधि बी सेल-कमी प्राप्तकर्ता चूहों में ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं के दत्तक सेल हस्तांतरण का उपयोग करती है ताकि दाता बी-1ए सेल माइग्रेशन और स्थानीयकरण की कल्पना की जा सके। इस प्रोटोकॉल को अन्य रेट्रोवायरल निर्माणों के लिए संशोधित किया जा सकता है और इसका उपयोग विभिन्न कार्यात्मक परखों के बाद दत्तक हस्तांतरण में किया जा सकता है, जिसमें दाता सेल या मेजबान सेल फेनोटाइप और फ़ंक्शन का विश्लेषण, या बी-1ए सेल हस्तांतरण के बाद स्रावित घुलनशील कारकों का विश्लेषण शामिल है। सीडी 45.1 और सीडी45.2 एलोटाइप द्वारा अलग-अलग दाता और प्राप्तकर्ता चूहों का उपयोग और रेट्रोवायरल प्लाज्मिड के भीतर एक जीएफपी रिपोर्टर की उपस्थिति भी एंडोजेनस बी सेल आबादी वाले अन्य, प्रतिरक्षा-पर्याप्त माउस मॉडल में दाता कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम हो सकती है।

Introduction

हाल के अध्ययनों ने काफी प्रतिरक्षा कोशिका का प्रदर्शन किया है, और विशेष रूप से बी सेल, फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विषमता सेल स्थानीयकरण1,,2,,3,,4,,5के आधार पर। बी-1ए कोशिकाएं सुरक्षात्मक आईजीएम एंटीबॉडी का उत्पादन करने की विषम क्षमता वाली ऐसी आबादी हैं; बोन मैरो बी-1ए कोशिकाएं आईजीएम को संविलियन रूप से स्रावित करती हैं और प्लाज्मा आईजीएम टिटर6में महत्वपूर्ण योगदान देती हैं, जबकि पेरिटोनियल बी-1ए कोशिकाओं में होमोस्टोसिस में निम्न स्तर का आईजीएम स्राव होता है और इसके बजाय सहज टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) या साइटोकिने-मध्यस्थता संकेत के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है। माइग्रेट, और स्राव IgM7,8,9,10. बी-1ए सेल आईजीएम एंटीबॉडी ऑक्सीकरण-विशिष्ट एपिटोप (ओएसई) को पहचानते हैं जो रोगजनकों, अपोप्टिक कोशिकाओं और ऑक्सीकृत एलडीएल पर मौजूद हैं, और ओएसई के लिए आईजीएम बाध्यकारी एथेरोस्क्लेरोसिस11जैसी बीमारियों में भड़काऊ डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को रोक सकता है। इसलिए, अस्थि मज्जा जैसी साइटों के लिए पेरिटोनियल बी-1ए सेल माइग्रेशन बढ़ाने के माध्यम से आईजीएम उत्पादन बढ़ाने की रणनीतियां चिकित्सकीय रूप से उपयोगी हो सकती हैं। हालांकि, ऐसी रणनीतियों को लक्षित और सेल-प्रकार विशिष्ट होना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऑफ-टारगेट प्रभाव प्रतिरक्षा कार्य या स्वास्थ्य को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं।

यहां हम प्राथमिक मूत्र बी-1 ए कोशिकाओं में सीएक्ससीआर 4 के लक्षित और दीर्घकालिक अतिअभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और सेल माइग्रेशन और कार्यात्मक आईजीएम एंटीबॉडी उत्पादन(चित्रा 1)की कल्पना करने के लिए बाद में दत्तक हस्तांतरण करते हैं। प्राथमिक बी कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर बदल सेल लाइनों के ट्रांसफेक्शन की तुलना में कम ट्रांसफेक्शन क्षमता से सीमित है। हालांकि, के रूप में बदल सेल लाइनों काफी प्राथमिक कोशिकाओं12,,13से विचलित कर सकते हैं, प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के परिणाम है कि अधिक बारीकी से सामांय शरीर विज्ञान के लिए संरेखित प्रदान करने की संभावना है । प्राथमिक मूत्र बी कोशिकाओं में जीन हस्तांतरण के लिए कई तकनीकों का वर्णन किया गया है, जिनमें रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन, एडेनोवायरल ट्रांसड्यूक्शन, लिपोफेक्शन, या इलेक्ट्रोपोराशन-आधारित ट्रांसफेक्शन शामिल हैं, जिनमें दक्षता, क्षणिकता और कोशिका स्वास्थ्य13,,14,,15पर प्रभाव के स्तर अलग-अलग होते हैं। निम्नलिखित विधि ने रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग किया क्योंकि इसमें सेल व्यवहार्यता को कम से कम प्रभावित करते हुए और 30% की पर्याप्त जीन हस्तांतरण दक्षता मिली। CXCR4-व्यक्त रेट्रोवायरस पहले वर्णित रेट्रोवायरल निर्माण मूत्र स्टेम सेल वायरस-आंतरिक राइबोसोमल प्रवेश साइट-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (MSCV-IRES-GFP) का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था; MigR1)16,जिसमें माउस CXCR4 जीन उप क्लोन4था । मिगआर1 (नियंत्रण (सीटीएल) जीएफपी) और सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरल कण कैल्शियम फॉस्फेट ट्रांसफेक्शन का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे जैसा कि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल4,,14में वर्णित है।

सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं को नसों में लिम्फोसाइट-कमी वालेRag1-/-चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया । दाता और प्राप्तकर्ता चूहों दोनों ने अतिरिक्त रूप से एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) जीन के नॉकआउट को शामिल किया, जिसके परिणामस्वरूप ओएसई संचय और एथेरोस्क्लेरोसिस में वृद्धि होती है, जिससे वीवो बी-1 सेल सक्रियण और आईजीएम उत्पादन में एक मॉडल प्रदान होता है। इसके अलावा, दाता और प्राप्तकर्ता चूहों CD45 allotype में मतभेद; दाता बी-1 कोशिकाएं CD45.1 +ApoE-/-चूहों से आई थीं और उन्हेंRag1-/-CD45.2 + ApoE-/-प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित कर दिया गया था ।-/- इसने प्राप्तकर्ता CD45.2 बी कोशिकाओं से दाता CD45.1 के अंतर की अनुमति दी, जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के दौरान बी सेल मार्कर के लिए अतिरिक्त दाग की आवश्यकता के बिना स्थानांतरण किया गया था। यहां प्रदान किए गए परिणाम ों से पता चलता है कि बी-1ए कोशिकाओं पर लक्षित CXCR4 अतिअभिव्यक्ति बी-1ए कोशिकाओं की बढ़ी हुई क्षमता के साथ बोन मैरो में स्थानांतरित करने के लिए, जो बढ़ी हुई प्लाज्मा एंटी-ओएसई आईजीएम के साथ संबद्ध है । हम इसके अतिरिक्त नकारात्मक चयन के माध्यम से पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक विधि प्रदान करते हैं और कुशल ट्रांसड्यूक्शन के लिए बी-1 सेल सक्रियण की आवश्यकता को प्रदर्शित करते हैं। बी-1ए सेल माइग्रेशन, फेनोटाइप या फ़ंक्शन पर प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस विधि को अन्य रेट्रोवायरल निर्माणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, CD45.1 बनाम CD45.2 एलोटाइप भेद का उपयोग सैद्धांतिक रूप से एंडोजेनस बी कोशिकाओं वाले अन्य प्रतिरक्षा-पर्याप्त मूत्र मॉडल में हस्तांतरण की अनुमति दे सकता है।

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Protocol

वर्जीनिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी पशु प्रोटोकॉल को मंजूरी दी गई थी ।

1. चुंबकीय पृथक्करण और पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं का संवर्धन

  1. एक 12−14 सप्ताह पुराने, पुरुष, CD45.1+ApoE-/-माउस सीओ2का उपयोग कर इच्छामृत्यु ।-/-
  2. सीधे सर्जिकल कैंची का उपयोग करपेट में एक सतही कटौती करें और पेरिटोनियल दीवार का पर्दाफाश करने के लिए घुमावदार कैंची का उपयोग करके त्वचा को छील दें। 10 मिलीग्राम सिरिंज और 25 जी सुई का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस आरपीएमआई-1640 मध्यम के 10 मिलील के साथ फ्लश पेरिटोनियल गुहा। पूंछ लोभी द्वारा कोशिकाओं को छुड़ाने के लिए माउस को हिलाएं और माउस पक्ष को 15−20 एस के लिए अच्छी तरह से साइड में ले जाएं।
    नोट: लैवएज पेरिटोनम की मालिश करने से सेल रिकवरी को भी अधिकतम किया जा सकता है।
  3. आंतों के पास, कूल्हे के स्तर के ठीक ऊपर पेरिटोनम के निचले दाईं ओर तरल पदार्थ खींचकर 10 मिलीग्राम सिरिंज और 25 जी सुई का उपयोग करके पेरिटोनियल तरल पदार्थ एकत्र करें। एपीडिडिल फैट डिपो और अंतर्निहित अंगों को बाधित करने से बचें। माउस की बाईं ओर से तरल पदार्थ खींचने से बचें क्योंकि ओमेंटल फैट आसानी से सिरिंज में खींचा जा सकता है।
  4. एक बार ~ 6−7 मिलीकर तरल पदार्थ एकत्र किया जाता है, बर्फ पर रखे 50 मिलील शंकुट्यूब में बांटें। इसके बाद, माउस को संदंश का उपयोग करके डायाफ्राम के ऊपर पेरिटोनियल दीवार पकड़कर खड़ी करें ताकि कोई भी शेष तरल पदार्थ पेरिटोनियल गुहा के तल पर बना रहे। जिगर के ऊपर सर्जिकल कैंची का उपयोग करपेरिनल दीवार में एक छोटा सा कट बनाओ (जिगर को काटने के लिए सुनिश्चित करें) और एक गिलास पाइप और बल्ब का उपयोग कर किसी भी शेष पेरिटोनियल तरल पदार्थ इकट्ठा करें।
  5. सभी CD45.1+ApoE-/-चूहों-/- (n = 15−20) से 50 मीटर शंकुट्यूब में पूल पेरिटोनियल वॉशआउट कोशिकाएं, और बर्फ पर स्टोर करें।
    नोट: आवश्यक चूहों की संख्या की गणना के लिए: बी-1ए कोशिकाओं में कुल पेरिटोनियल आबादी का 5−10% शामिल है और लेखकों के हाथों में प्रति माउस लगभग 2.5−5 x 105 बी-1ए कोशिकाओं की उपज होती है। ट्रांसडक्शन दक्षता ~ 30−40% है, जैसा कि नीचे दिखाया गया है।
  6. ट्राइपैन ब्लू और हीमोसाइटोमीटर (ट्राइपैन ब्लू में 1:5 के नमूने को पतला करके और हीमोसाइटोमीटर कक्ष में 10 माइक्रोन लोड) जैसे व्यवहार्यता डाई का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें। ट्यूब प्रति 1 x 108 कोशिकाओं पर पूल कोशिकाओं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं, फिर एस्पिरेट सुपरनेटेंट।
  7. एंटी-सीडी16/सीडी32 एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)के 1 mL में 1 x 108 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, परख बफर (1x फॉस्फेट बफर ्ड खारा [पीबीएस], ०.५% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए], 2 मीटर EDTA) में एफसी रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए पतला 1:50 । सेल काउंट के आधार पर आवश्यक पैमाने पर। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
  8. कमी के लिए परख बफर में बायोटिनेटेड एंटीबॉडी(टेबल 1)का 2x मास्टर मिश्रण तैयार करें। 2x मास्टर मिक्स तरल की मात्रा के लिए खातों कोशिकाओं में पहले से ही कर रहे है जब विरोधी CD16/CD32 के साथ इनक्यूबेटिंग । उदाहरण के लिए, यदि कोशिकाएं पतला एंटी-सीडी16/सीडी32 के 500 माइक्रोन में इनक्यूबेटिंग कर रही हैं, तो टेबल 1 में दी गई अंतिम सांद्रता को प्राप्त करने के लिए 2x मास्टर मिक्स के 500 माइक्रोन जोड़ें, जिसमें बायोटिनेटेड टेर119, जीआर-1, सीडी23 और एनके 1.1 एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन शामिल हैं, और तालिका 1में दिए गए अंतिम सांद्रता को प्राप्त करने के लिए बायोटिनेटेड F4/80 एंटीबॉडी के 25 μL। कोशिकाओं में 2x मास्टर मिक्स जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए दाग करें।
  9. परख बफर के 5 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस और एस्पिरेट सुपरनेटेंट पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  10. निर्माता द्वारा अनुशंसित एकाग्रता और प्रोटोकॉल के अनुसार परख बफर में पतला एंटी-बायोटिन माइक्रोमोतियों(सामग्री की तालिका)के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और इनक्यूबेट करें।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर परख बफर और अपकेंद्रित्र के 5 mL के साथ धोलें। Aspirate supernatant और परख बफर के 500 μL में 1 x 108 कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  12. परख बफर के 3 mL के साथ प्राइम मैग्नेटिक चयन कॉलम(सामग्रीकी तालिका) । प्राइमेड चुंबकीय चयन स्तंभों पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और बर्फ पर 15 मिलील शंकुई ट्यूब में समृद्ध बी-1 कोशिकाओं वाले एलुएंट एकत्र करें। चुंबकीय चयन कॉलम को अतिरिक्त परख बफर के साथ धोएं जब तक कि एकत्र की गई समग्र मात्रा 10 मिलीएल न हो।
    नोट: पूर्व-शुद्ध और बाद के शुद्ध सेल अंशों का एक बहाना सीडी 19 + बी कोशिकाओं, F480 + मैक्रोफेज, और CD5 + टी कोशिकाओं के लिए धुंधला द्वारा शुद्धि दक्षता के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है।
  13. 1.6 चरण में लाइव कोशिकाओं की गिनती करके पोस्ट-शुद्ध सेल अंश (समृद्ध बी-1 कोशिकाओं वाले एलुएंट) की गणना करें, और बी सेल कल्चर मीडियम (आरपीएमआई-1640, 10% हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 10 एमएम हेप्स, 1x गैर-जरूरी अमीनो एसिड, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM-mercaptoथेनॉल) में 1 x 106 कोशिकाओं/mL पर फिर से निलंबित करें।

2. पेरिटोनियल बी-1 सेल उत्तेजना

  1. दो ट्रांसड्यूड स्थितियों (सीटीएल-जीएफपी और सीएक्ससीआर4-जीएफपी) के लिए विभाजित कोशिकाओं को विभाजित करें, जबकि एक गैर-ट्रांसड्यूड नियंत्रण के लिए कम से कम 10 x 106 कोशिकाओं को अलग और चढ़ाना।
  2. 96-अच्छी तरह से गोल-बॉटम प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 150 माइक्रोन (150,000 कोशिकाओं) तक प्लेट करें।
  3. सेल प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए सभी कुओं में 100 एनएम टीएलआर9 एगोनिस्ट ODN1668 जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 16−18 घंटे के लिए इनक्यूबेट।

3. पेरिटोनियल बी कोशिकाओं का रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन

  1. कैल्शियम फॉस्फेट ट्रांसफेक्शन का उपयोग करके सीटीएल-जीएफपी (मिगआर1) और सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरल कणउत्पन्न करें जैसा कि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल14में वर्णित है।
    नोट: इसप्रोटोकॉल को शुरू करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर तैयार और टिटर रेट्रोवायरल स्टॉक और स्टोर एलिकोट्स तैयार और स्टोर करें।
  2. बर्फ पर गल रेट्रोवायरस स्टॉक्स । तुरंत उपयोग करें और वायरस टिटर के रूप में फिर से फ्रीज नहीं है काफी फ्रीज गल चक्र के दौरान घटता है । 55 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता पर 8 μg/mL पॉलीब्रेन और ताजा-मर्काप्टोथेनॉल की उपस्थिति में कोशिकाओं में 20:1 बहुलता (एमओआई) पर सीटीएल-जीएफपी या सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरल सुपरनेटेंट जोड़ें । गैर-ट्रांसड्यूड नियंत्रण के लिए अलग से निर्धारित कोशिकाओं में वायरल स्टॉक न जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान पर 90 मीटर के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्री प्लेटों द्वारा स्इन्फेक्शन करें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर रेट्रोवायरस के साथ इनक्यूबेट प्लेटें, अतिरिक्त 3 घंटे के लिए 5% सीओ2।
  5. ताजा बी सेल माध्यम में फसल और रीप्लेट कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 रात भर।

4. ट्रांसड्यूड पेरिटोनियल बी-1ए कोशिकाओं की सेल छंटाई

  1. फसल सुसंस्कृत कोशिकाओं और पूल प्रत्येक हालत के लिए तीन अलग-अलग 50 मिलीएल शंकुट्यूब में: गैर-ट्रांसड्यूड, सीटीएल-जीएफपी ट्रांसड्यूड, और सीएक्ससीआर4-जीएफपी ट्रांसड्यू किया गया।
  2. 1.6 चरण के रूप में लाइव कोशिकाओं की गणना करें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस और एस्पिरेट सुपरनेट ेंट पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  3. एफसी रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए 1:50 एंटी-सीडी16/सीडी32 एंटीबॉडी(टेबल ऑफ मैटेरियल)युक्त सॉर्ट बफर (पीबीएस + 1% बीएसए) में 100,000 कोशिकाओं/μL पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
  4. मुआवजा नियंत्रण के लिए अलीकोट कोशिकाएं (प्रति मुआवजा नियंत्रण ~ 30,000 कोशिकाएं): गैर-ट्रांसड्यूड नमूने से और जीएफपी एकल दाग नियंत्रण के लिए ट्रांसड्यूड नमूनों से अरंजित और एकल दाग नियंत्रण के लिए।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मुआवजा मोती वैकल्पिक रूप से एकल दाग नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर गैर ट्रांसड्यूसेल संख्या कम है ।
  5. सॉर्ट बफर(टेबल 1)में फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेटेड एंटीबॉडी युक्त 2x एंटीबॉडी मास्टर मिक्स तैयार करें। नॉन-ट्रांसड्यूड, सीटीएल-जीएफपी ट्रांसड्यूड और सीएक्ससीआर4-जीएफपी ट्रांसड्यूड नमूनों में 2x मास्टर मिक्स जोड़ें। एकल दाग नियंत्रण के लिए व्यक्तिगत एंटीबॉडी जोड़ें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: 2x मास्टर मिश्रण तरल की मात्रा के लिए खातों कोशिकाओं में पहले से ही कर रहे है जब विरोधी CD16/CD32 के साथ इनक्यूबेटिंग, के रूप में कदम १.८ में । प्रत्येक स्थिति से कोशिकाओं का एक aliquot अलग से CXCR4 के लिए दाग किया जा सकता है CXCR4 अतिअभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए ।
  6. पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबमें 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सॉर्ट बफर के 1 mL के साथ नमूने धोएं और तनाव करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस और एस्पिरेट सुपरनेटेंट पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सॉर्ट बफर में 50,000 कोशिकाओं/μL पर नमूनों को फिर से निलंबित करें।
  8. सेल छंटाई से पहले संग्रह माध्यम (RPMI-1640) के 1 मिलील युक्त लेबल फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) संग्रह ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक आबादी को हल करने के लिए 20% हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस, 10 एमएम एचईपीईएस, 1x नॉन-जरूरी अमीनो एसिड, 1 एमएम सोडियम पायरुवेट, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM-मर्काप्टोथेनॉल) ।
  9. सेल सॉर्टर पर नमूने चलाने से पहले मृत सेल भेदभाव के लिए 2x DAPI (सॉर्ट बफर में 1:5000 कमजोर पड़ने के रूप में तैयार) जोड़ें।
  10. डीएपीआई के रूप में संग्रह माध्यम युक्त FACS ट्यूबों में GFP + बी-1ए कोशिकाओं को सॉर्ट करें- सीडी19+ जीएफपी+ बी 220मिड-लो सीडी23- सीटीएल-जीएफपी और सीएक्ससीआर4-जीएफपी नमूनों से आईजीएम+ सीडी5+ कोशिकाएं। जीएफपी + गेट सेट करने और डीएपीआई को सॉर्ट करने के लिए गैर-ट्रांसड्यूड नमूने का उपयोग करें- सीडी19+ जीएफपी- बी 220मिड-लो सीडी23- आईजीएम+ सीडी5+ गैर-ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाएं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, गैर-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को सीएफपी-अंश के भीतर अलग से गेटिंग बी-1ए कोशिकाओं द्वारा सीटीएल-जीएफपी और सीएक्ससीआर4-जीएफपी नमूनों से भी हल किया जा सकता है। ट्रांसड्यूड या नॉन-ट्रांसड्यूड बी-1बी कोशिकाओं को डीपीआई- सीडी19+ जीएफपी+/- बी 220मिड-लो सीडी23- आईजीएम+ सीडी 5- कोशिकाओं के रूप में इस तरह की रणनीति का उपयोग करके भी हल किया जा सकता है।

5. दत्तक स्थानांतरण

  1. सेल छंटाई के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और ध्यान से aspirate supernatant।
  2. 1,000 कोशिकाओं/μL पर ठंड बाँझ 1x पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. एनेस्थेटाइज़ पुरुषRag1-/-Apoe-/-आइसोफ्लोरीन का उपयोग कर चूहों और नसों में रेट्रो कक्षीय या पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से प्रति माउस १०० μL (१००,००० कोशिकाओं) सुई एक अल्ट्रा ठीक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर ।-/- नियंत्रण के रूप में 1x पीबीएस के साथ कुछ चूहों को इंजेक्ट करें।

6. दाता कोशिकाओं और प्लाज्मा आईजीएम का परिमाणीकरण

  1. वांछित समय के बाद दत्तक हस्तांतरण पर, अस्थि मज्जा और तिल्ली ऊतक फसल4 और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कोशिकाओं का विश्लेषण करें । सीडी45.1, सीडी45.2 और सीएक्ससीआर4 के लिए धुंधला करके दाता सेल स्थानीयकरण और सीएक्ससीआर 4 अतिअभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें और फ्लोजो जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों का विश्लेषण करें।
    नोट: इस चरण में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए टेबल 1 देखें। सुनिश्चित करें कि एक एंटीबॉडी का उपयोग न करें कि जीएफपी के रूप में एफएफसी चैनल में फ्लोरेसकास ट्रांसड्यूड दाता कोशिकाओं पर मौजूद होगा।
  2. पशु बलि के समय कार्डियक पंचर के माध्यम से एकत्र किए गए पूरे रक्त में 0.5 मीटर ईटीए के 10 माइक्रोन जोड़कर प्लाज्मा को अलग करें। 7,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज साबुत रक्त और अलग 1.5 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में एलिकोट प्लाज्मा। एलिसा4द्वारा आईजीएम जैसे स्रावित कारकों का विश्लेषण करने तक - 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

प्रोटोकाल का अवलोकन चित्र 1में दिया गया है । चित्रा 2 अन्य पेरिटोनियल सेल प्रकारों की चुंबकीय कमी के बाद पेरिटोनियल बी-1ए कोशिकाओं का संवर्धन प्रदर्शित करता है। बाद के लक्षण में लाइव सिंगलट कोशिकाओं में F4/80+ मैक्रोफेज की तुलना में CD19 + बी कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात होता है, सीडी 5हाय सीडी19 की कमी होती है- टी कोशिकाएं, और पूर्व-कमी अंश की तुलना में सीडी 19+ सीडी5मध्य बी-1 ए कोशिकाओं की बढ़ी हुई आवृत्ति होती है। चित्रा 3 सफल रेट्रोवायरल बी सेल ट्रांसड्यूक्शन के लिए बी सेल सक्रियण की आवश्यकता को प्रदर्शित करता है, और सीटीएल-जीएफपी रेट्रोवायरस का उपयोग करके वायरस एमओआई बढ़ाने के साथ सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड जीएफपी + बी सेल सबसेट की आवृत्ति में खुराक-निर्भर वृद्धि। तालिका 2 24-अच्छी तरह से या 6-अच्छी प्लेटों की तुलना में 96 अच्छी तरह से गोल-बॉटम प्लेटों का उपयोग करके बढ़ी हुई ट्रांसडक्शन दक्षता प्रदर्शित करता है। चित्रा 4 प्रदर्शित करता है सफल CXCR4 अतिअभिव्यक्ति (>40%) बी-1 कोशिकाओं पर और बी सेल व्यवहार्यता पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना, CXCR4-GFP रेट्रोवायरस के साथ ट्रांसड्यूक्शन के बाद सीएक्ससीएल12 इन विट्रो की ओर बी-1 सेल माइग्रेशन में वृद्धि हुई। चित्रा 5 लाइव, सिंगलट, सीडी19 + सीडी 23- आईजीएम + सीडी5 + बी-1ए कोशिकाओं को एक गैर-ट्रांसड्यूड स्थिति (जीएफपी-), या दो ट्रांसड्यूड शर्तों (जीएफपी +) की छंटाई के लिए गेटिंग रणनीति प्रदर्शित करता है। ध्यान दें कि पूर्व चुंबकीय कमी के कारण इन नमूनों में CD23+ बी-2 कोशिकाएं मौजूद नहीं हैं। ट्रांसड्यूड लाइव, सिंगल, सीडी19 + सीडी23- आईजीएम + सीडी 5- बी-1 बी कोशिकाओं को भी इस गेटिंग रणनीति का उपयोग करके हल किया जा सकता है। चित्रा 6 प्रदर्शित करता है सीडी 45.1 + दाता कोशिकाओं और दाता कोशिकाओं पर निरंतर CXCR4 अतिअभिव्यक्ति अस्थि मज्जा और CD45.2 प्राप्तकर्ता चूहों की तिल्ली से बरामद 17 सप्ताह के बाद सेल हस्तांतरण । तालिका 3 अस्थि मज्जा के लिए CXCR4 अभिव्यक्ति और दाता सेल स्थानीयकरण के बीच एक सकारात्मक संबंध प्रदर्शित करता है, लेकिन तिल्ली नहीं । तालिका 4 एंटी-एमडीए-एलडीएल आईजीएम की बोन मैरो और प्लाज्मा राशि में डोनर सेल नंबर के बीच एक सकारात्मक संबंध प्रदर्शित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन और दत्तक हस्तांतरण के लिए प्रायोगिक डिजाइन की योजनाबद्ध। सीडी 45.1 एलोटाइप चूहों से अलग पेरिटोनियल कोशिकाओं को बायोटिनी एंटीबॉडी और एंटी-बायोटिन माइक्रोमोतियों का उपयोग करके चुंबकीय कमी के माध्यम से बी-1 कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया जाता है। टीएलआर9 एगोनिस्ट सीपीजी ओलिगोडेऑक्सीक्लियोटाइड के साथ सेल प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए समृद्ध पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं को सक्रिय किया जाता है। सक्रिय कोशिकाओं को सीटीएल-जीएफपी या सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरल कणों के साथ ट्रांसड्यू किया जाता है। सफलतापूर्वक ट्रांसड्यू किए गए जीएफपी + बी-1ए कोशिकाओं को एफएसीएस का उपयोग करके हल किया जाता है और सीडी 45.2 एलोटाइप होस्ट चूहों में दत्तक रूप से स्थानांतरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं के लिए संवर्धन। सीडी 19 + बी कोशिकाओं के लिए पेरिटोनियल कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड पूर्व चुंबकीय संवर्धन (शीर्ष) और पोस्ट-मैग्नेटिक संवर्धन (नीचे) । CD19+ F4/80- कोशिकाएं बी कोशिकाएं हैं, सीडी 19- F4/80 + कोशिकाएं मैक्रोफेज हैं, सीडी 19 + सीडी 5मध्य कोशिकाएं बी-1ए कोशिकाएं हैं, और सीडी 19- सीडी 5हाय कोशिकाएं टी कोशिकाएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन के लिए बी सेल एक्टिवेशन की आवश्यकता होती है। पेरिटोनियल बी कोशिकाओं को सीटीएल-जीएफपी रेट्रोवायरस के साथ 5:1, 10:1, या 25:1 MOI पर स्थानांतरित किया गया था या टीएलआर9 एगोनिस्ट सीपीजी ओडीएन 1668 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में गैर-ट्रांसड्यूड किया गया था। सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड जीएफपी + बी 2, बी 1, बी-1ए या बी-1 बी कोशिकाओं की आवृत्ति प्रवाह साइटोमेट्री 18 एच पोस्ट-ट्रांसड्यूक्शन द्वारा निर्धारित की गई थी। त्रुटि सलाखों का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: CXCR4 अतिअभिव्यक्ति की पुष्टि और विट्रो में बी-1ए माइग्रेशन में वृद्धि हुई है। CXCR4 की बी सेल-विशिष्ट कमी के साथएपीओई-/-चूहों से पेरिटोनियल बी कोशिकाओं को सीटीएल-जीएफपी या सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरस के साथ अलग-थलग और स्थानांतरित किया गया था, या ट्रांसड्यूक्शन के बिना सुसंस्कृत किया गया था । (क)गैर-ट्रांसड्यूड (ऊपरी बाएं), सीटीएल-जीएफपी ट्रांसड्यूड (लोअर लेफ्ट), या सीएक्ससीआर4-जीएफपी ट्रांसड्यूड (लोअर राइट) स्थितियों से बी-1 कोशिकाओं पर सीएक्ससीआर4 और जीएफपी अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड। FMO-CXCR4 (ऊपरी दाएं) CXCR4 सकारात्मक फाटक सेट करने के लिए इस्तेमाल किया । (ख)जीएफपी + बी-1 कोशिकाओं पर सीएक्ससीआर 4 के एमएफआई का गैर-ट्रांसड्यूड (एन = 1), सीटीएल-जीएफपी ट्रांसड्यू (एन = 2), या सीएक्ससीआर4-जीएफपी ट्रांसड्यूड (एन = 2) स्थितियों से परिमाणीकरण । (ग)ट्रांसवेल में भरी गई बी-1 कोशिकाओं की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में सीएक्ससीएल12 की ओर चले गए गैर-ट्रांसड्यूड (एन = 1), सीटीएल-जीएफपी ट्रांसड्यूड (एन = 2), या सीएक्ससीआर4-जीएफपी ट्रांसड्यूड (एन = 2) बी-1 कोशिकाओं की आवृत्ति । (d)सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड बी सेल आबादी (सीडी19+जीएफपी +) के भीतर व्यवहार्य कोशिकाओं के परिमाणीकरण के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। (ई)सीटीएल-जीएफपी (एन = 2) या सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरस (एन = 2) के साथ ट्रांसड्यूक्शन के बाद लाइव बी कोशिकाओं की आवृत्ति। त्रुटि सलाखों का मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को हमारे पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ट्रांसड्यूड जीएफपी + बी-1ए कोशिकाओं को छांटने के लिए गेटिंग रणनीति। एक गैर-ट्रांसड्यूड नमूना (शीर्ष), सीटीएल-जीएफपी ट्रांसड्यूड नमूना (मध्य) और सीएक्ससीआर4-जीएफपी ट्रांसड्यूड नमूना (नीचे) से जीएफपी + या जीएफपी-बी-1ए कोशिकाओं को छांटने के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड। बी-1ए कोशिकाओं को लाइव, सिंगलट, सीडी19 + सीडी23- आईजीएम + सीडी5 + कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: स्थानांतरित दाता कोशिकाओं की मात्रा । प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों CD45.1 + CD45.2-एक पीबीएस नियंत्रण (शीर्ष), एक सीटीएल-GFP + बी-1ए सेल प्राप्तकर्ता (मध्य), और एक CXCR4-GFP + बी-1ए सेल प्राप्तकर्ता (नीचे), और अस्थि मज्जा में दाता कोशिकाओं पर CXCR4 अभिव्यक्ति के बाद विश्लेषण(एक),या तिल्ली(बी)से दाता कोशिकाओं । बोन मैरो(सी)या तिल्ली(डी)से दाता कोशिकाओं पर CXCR4 अभिव्यक्ति (मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता, एमएफआई) का परिमाणीकरण। प्राप्तकर्ताओं के अस्थि मज्जा(ई)या तिल्ली(एफ)में बरामद दाता कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। * पी एंड एलटी; 0.05 या **पी एंड एलटी; 0.01 मान-व्हिटनी टेस्ट द्वारा। त्रुटि सलाखों का मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को हमारे पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटोकॉल कदम एंटीबॉडी अंतिम एकाग्रता
चरण 1.8 Ter119 बायोटिन 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
सीडी3ई बायोटिन 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
जीआर-1 बायोटिन 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
सीडी23 बायोटिन 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
एनके1.1 बायोटिन 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
F4/80 बायोटिन 2.5 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
एंटीबॉडी अंतिम एकाग्रता
चरण 4.5 सीडी5 पीई 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
आईजीएम पीईएफ594 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
सीडी23 पीईसाइ7 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
B220 एपीसी 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
CD19 APCef780 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
एंटीबॉडी अंतिम एकाग्रता
चरण 6.1 सीडी45.1 परसीपी Cy5.5 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
सीडी45.2 BV421 1 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा
CXCR4 एपीसी 2.5 μL प्रति 100 μL अंतिम मात्रा

तालिका 1: एंटीबॉडी और प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली उनकी अंतिम सांद्रता।

हालत कुल आबादी का %GFP + CD19 + बी कोशिकाओं का %GFP +
९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट 30.9% 52.7%
24-अच्छी तरह से प्लेट 8.4% 21.2%
6-अच्छी तरह से प्लेट 16.2% 27.3%

तालिका 2: प्लेट अनुकूलन। 6 x 106 समृद्ध पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं के ट्रांसड्यूक्शन के बाद सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड कुल जीएफपी + कोशिकाओं या जीएफपी + सीडी19 + बी कोशिकाओं की आवृत्ति या तो 96-अच्छी तरह से गोल-बॉटम प्लेट (150,0 पर 40 कुएं प्रति अच्छी तरह से 00 कोशिकाएं), सीटीएल-जीएफपी रेट्रोवायरस के साथ 20:1 MOI पर 24-अच्छी तरह से प्लेट (1 x 106 कोशिकाओं पर 6 कुएं), या एक 6-अच्छी प्लेट (2 x 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 3 कुएं) ।

चर दाता बी-1ए कोशिकाओं पर CXCR4 की MFI
आर-वैल्यू पी-वैल्यू
# बोन मैरो में डोनर बी-1ए कोशिकाओं की 0.71 *0.014
# तिल्ली में दाता बी-1ए कोशिकाओं की 0.43 0.18

तालिका 3: दाता कोशिकाओं और दाता सेल स्थानीयकरण पर CXCR4 अभिव्यक्ति के बीच एसोसिएशन । दाता बी-1ए कोशिकाओं पर CXCR4 की मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) अस्थि मज्जा या Rag1 की तिल्ली में दाता बी-1ए कोशिकाओं की संख्या के साथसहसंबद्ध-//प्राप्तकर्ता चूहों 17 सप्ताह के बाद दत्तक हस्तांतरण ।-/- सहसंबंध गुणांक (आर) और सांख्यिकीय महत्व (पी) के रूप में प्रस्तुत डेटा। इस तालिका को हमारे पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है ।

चर अस्थि मज्जा में दाता कोशिकाओं की #
आर-वैल्यू पी-वैल्यू
प्लाज्मा एंटी-एमडीए-एलडीएल आईजीएम 0.67 *0.028
प्लाज्मा E06/T15 IgM 0.56 0.076
प्लाज्मा 1,3-dextran IgM 0.29 0.39

तालिका 4: एंटी-ओएसई आईजीएम के डोनर सेल स्थानीयकरण और प्लाज्मा राशि के बीच एसोसिएशन। Rag1 के अस्थि मज्जा में दाता बी-1ए कोशिकाओं कीसंख्या-/-ApoE-/-प्राप्तकर्ता चूहों 17 सप्ताह के बाद दत्तक हस्तांतरण विरोधी एमडीए-एलडीएल आईजीएम, E06/T15 IgM, या विरोधी १,३-dextran IgM की परिसंचारी राशि के साथ सहसंबद्ध ।-/- सहसंबंध गुणांक (आर) और सांख्यिकीय महत्व (पी) के रूप में प्रस्तुत डेटा। इस तालिका को हमारे पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

यहां प्रदान की गई विधि वीवो दत्तक हस्तांतरण में स्थिर और अपेक्षाकृत कुशल प्राथमिक बी-1ए सेल जीन डिलीवरी, और इंजेक्शन कोशिकाओं की पहचान और स्थानीयकरण को सक्षम बनाती है। कोशिकाओं को 17 सप्ताह के बाद सेल हस्तांतरण का पता लगाया जा करने में सक्षम थे और वृद्धि हुई CXCR4 अभिव्यक्ति बनाए रखा । रेट्रोवायरस-मध्यस्थता वितरण हमारे हाथों में सेल व्यवहार्यता पर ंयूनतम प्रभाव के साथ प्राथमिक मूत्र बी-1ए कोशिकाओं की 30-40% ट्रांसड्यूक्शन दक्षता(चित्रा 4e)मिले । यह मोघुमी और सहयोगियों द्वारा पिछले अध्ययन के परिणामों के अनुरूप है, जिसने रेट्रोवायरल संक्रमण, एडेनोवायरल संक्रमण, न्यूक्लियोफेक्शन, या लिपोफेक्टामाइन15सहित प्राथमिक मूत्र बी कोशिकाओं में जीन हस्तांतरण की तकनीकों की तुलना की । हालांकि, हमने पाया कि CXCR4 अतिअभिव्यक्ति की सीमा CXCR4-GFP प्राप्त प्राप्तकर्ताओं के भीतर काफी विविध बी-1a कोशिकाओं(चित्रा 6सी, डी)। इसलिए, हमने यह प्रदर्शित करने के लिए साहचर्य विश्लेषण का उपयोग किया कि बढ़ी हुई सीएक्ससीआर 4 अभिव्यक्ति बढ़ी हुई बी-1 ए माइग्रेशन और बोन मैरो में स्थानीयकरण के साथ सहसंबद्ध है, जो बढ़ी हुई प्लाज्मा आईजीएम(टेबल 3 और टेबल 4)से जुड़ी है।

इस विधि की सीमाओं में सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक चूहों की बड़ी संख्या और एक प्रयोग से दूसरे में ट्रांसड्यूक्शन दक्षता में परिवर्तनशीलता शामिल है। ट्रांसड्यूक्शन दक्षता में वायरल स्टॉक के उच्च टिटर द्वारा सुधार किया जाता है, जो कम से कम 2 x 107 संक्रामक कण/mL14होना चाहिए । 12−16 सप्ताह की आयु के पुराने चूहों के उपयोग से पेरिटोनियल बी-1 सेल यील्ड में भी सुधार हो सकता है, क्योंकि पेरिटोनियल बी-1 सेल की संख्या17वर्ष की आयु के साथ बढ़ जाती है।

यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दत्तक हस्तांतरण के बाद ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं द्वारा स्रावित आईजीएम की मात्रा एक ही Rag1 में दत्तक हस्तांतरण के बाद गैर-ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं द्वारा स्रावित राशि से ~ 5 गुना कम थी-/-ApoE-/-मॉडल (डेटा नहीं दिखाया गया) ।-/- -/- यह रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन(चित्रा 3)से पहले टीएलआर9 एगोनिस्ट के साथ बी-1 सेल सक्रियण की आवश्यकता के कारण हो सकता है, जो वीवो पोस्ट-दत्तक हस्तांतरण में ओएसई के जवाब में माध्यमिक सक्रियण और आईजीएम उत्पादन को सीमित कर सकता है। इसलिए, उन अध्ययनों के लिए जिन्हें बी-1ए कोशिकाओं को स्थानांतरित करके मजबूत आईजीएम उत्पादन की आवश्यकता होती है, वैकल्पिक जीन हस्तांतरण तकनीकों को पूर्व बी-1ए सेल सक्रियण की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे लेंटिवायरल डिलीवरी18,,19,उपयोगी साबित हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रोटोकॉल में संशोधन जिसमें प्रसार को प्रेरित करने के लिए सक्रियण रणनीतियों को शामिल किया गया है, लेकिन आईजीएम-स्राव कोशिकाओं में बी-1ए भेदभाव भी माध्यमिक बी सेल सक्रियण को प्रभावित किए बिना सफल रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन के लिए पर्याप्त हो सकता है। आईएल-5 बी-1 ए सेल प्रसार और अस्तित्व में मध्यस्थता करने वाला एक महत्वपूर्ण साइटोकिन है, और TLR9 उत्तेजना20,,21के लिए एक प्रभावी विकल्प हो सकता है।

पूर्व अध्ययनों में बी 220 (बी सेल मार्कर) या Thy1.2 (टी सेल मार्कर)13,,14के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर सकारात्मक या नकारात्मक चयन रणनीतियों के माध्यम से अलग प्लीनिक बी कोशिकाओं का उपयोग किया है । हालांकि, B220+ प्लीनिक बी कोशिकाएं बी-1 और बी-2 सेल सबसेट वाली विषम आबादी हैं। इसके अलावा, कुल प्लीनिक सीडी19 + बी सेल आबादी के भीतर बी-1 सेल आवृत्ति कम (1−2%) है। इसके विपरीत, यह विधि ट्रांसड्यूक्शन के लिए बी-1 सेल स्रोत के रूप में पेरिटोनियल गुहा का उपयोग करती है, क्योंकि बी-1 कोशिकाओं में इस डिब्बे22में कुल CD19 + बी कोशिकाओं का 60−70% शामिल है, और पेरिटोनियल बी-2 कोशिकाओं को कम करने के लिए एक मार्कर के रूप में CD23 का उपयोग करता है। जीएफपी, सीडी19, बी 220, सीडी23, आईजीएम और सीडी 5 अभिव्यक्ति के आधार पर सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं की बाद की छंटाई से अधिक विशेष रूप से परिभाषित सेल प्रकार के हस्तांतरण की अनुमति मिलती है। पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए चुंबकीय कमी रणनीति प्रभावी रूप से टी कोशिकाओं को समाप्त कर दिया, और हमारे हाथों में ~५०% से F4/80 peritoneal मैक्रोफेज आवृत्ति कम(चित्रा 2),हालांकि आगे अनुकूलन और इस महत्वपूर्ण कदम की समस्या निवारण ट्रांसडक्शन दक्षता में वृद्धि हो सकती है । उदाहरण के लिए, बेहतर मैक्रोफेज की कमी के लिए बायोटिनीटेड F4/80 एंटीबॉडी की उच्च एकाग्रता का उपयोग करने से बी-1ए सेल ट्रांसड्यूक्शन दक्षता में और वृद्धि हो सकती है, क्योंकि अन्य सेल प्रकारों का कम "ऑफ-टारगेट" रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन होगा। ट्रांसड्यूक्शन के लिए 96-अच्छी तरह से गोल-बॉटम प्लेटों का उपयोग, फ्लैट-बॉटम 24-वेल या 6-वेल प्लेट्स के बजाय इसके अतिरिक्त काफी बेहतर ट्रांसड्यूक्शन दक्षता(टेबल 2),हालांकि हैंडलिंग और पाइपिंग समय बढ़ जाता है।

कुल मिलाकर, यह विधि यह निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी प्रमाण-अवधारणा दृष्टिकोण प्रदान करती है कि बी-1ए कोशिकाओं को लक्षित जीन वितरण बी-1ए सेल स्थानीयकरण और कार्यात्मक आईजीएम उत्पादन को बदल सकता है या नहीं। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में अन्य प्रोटीन को लक्षित करने वाले रेट्रोवायरल निर्माण ों की पूर्व वीवो डिलीवरी और सेल अस्तित्व, प्रवासन, प्रसार या कार्य सहित वीवो में दाता या मेजबान सेल प्रक्रियाओं पर इसके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए दत्तक हस्तांतरण शामिल हो सकता है। लिंफोसाइट-कमी वाले मेजबानों के बजाय इम्यूनोसक्षम मेजबानों में दत्तक हस्तांतरण, इस तकनीक के साथ भी संभव होगा क्योंकि दाता कोशिकाओं (सीडी45.1+ जीएफपी +) को मेजबान कोशिकाओं (सीडी45.2 + जीएफपी-) से अलग किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग कर अन्य केमोकिन रिसेप्टर्स को लक्षित करने से इस परिकल्पना का समर्थन हो सकता है कि उच्च आईजीएम उत्पादन के निकस की ओर बी-1ए सेल माइग्रेशन को लक्षित करना सुरक्षात्मक आईजीएम के स्तर को प्रभावी ढंग से बढ़ावा दे सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), और R01GM100776 (T.P. शराबी) के प्रोजेक्ट 3 द्वारा समर्थित किया गया था । A. Upadhye अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप 16PRE30300002 और 5T32AI007496-20 द्वारा समर्थित था । हम जोऐन लैनिगन, माइक सोल्गा और क्लाउड चबाना वर्जीनिया विश्वविद्यालय के फ्लो साइटोमेट्री कोर से उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 micron filter caps Falcon 352235
anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block Life Technologies MFCR00
B220 APC eBioscience 17-0452-83 Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
CD19 APCef780 eBioscience 47-0193-82 Clone: eBio1D3
CD23 biotin eBioscience 13-0232-81 Clone: B3B4
CD23 PECy7 eBioscience 25-0232-82 Clone: B3B4
CD3e biotin eBioscience 13-0033-85 Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560580 Clone: A20
CD45.2 BV421 BD Biosciences 562895 Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD5 PE eBioscience 12-0051-83 Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC eBioscience 17-9991-82 Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin Life Technologies MF48015 Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6 Treestar Inc. License required
Gentamicin Gibco 15710-064
Gr-1 biotin eBioscience 13-5931-82 Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum Gibco 16000-044
HEPES Gibco 15630-080
IgM PECF594 BD Biosciences 562565 Clone: R6-60.2
Insulin syringes BD Biosciences 329461
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405
Live/Dead Yellow Life Technologies L34968
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NK1.1 biotin BD Biosciences 553163 Clone: PK136
Non-essential amino acids Gibco 11140-050
ODN 1668 InvivoGen tlrl-1668
PBS Gibco 14190-144
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Ter119 biotin eBioscience 13-5921-82 Clone: Ter119

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References

  1. Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
  2. Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
  3. Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
  4. Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
  6. Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
  7. Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
  8. Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
  9. Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
  10. Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
  11. Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
  14. Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
  15. Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
  16. DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
  17. Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
  18. Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
  19. Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
  20. Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
  21. Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
  22. Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).

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मूत्र बी-1ए कोशिकाओं पर CXCR4 का रेट्रोवायरल अतिअभिव्यक्ति और बोन मैरो और आईजीएम उत्पादन के लिए लक्षित बी-1ए सेल माइग्रेशन के लिए दत्तक हस्तांतरण
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Upadhye, A., Marshall, M., Garmey,… More

Upadhye, A., Marshall, M., Garmey, J. C., Bender, T. P., McNamara, C. Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production. J. Vis. Exp. (159), e61003, doi:10.3791/61003 (2020).

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