Summary
在这里，我们描述了一种抗逆转录病毒过度表达和采用迁移的鼠B-1a细胞的方法，以检查体内B-1a细胞的迁移和定位。该协议可扩展到不同的下游功能检测，包括定量供体B-1a细胞定位或分析供体细胞衍生分泌因子的收养后转移。
Abstract
由于细胞功能受细胞微环境中利基特定因素的影响，剖析细胞定位和迁移的方法可以进一步洞察细胞功能。B-1a细胞是小鼠中一个独特的B细胞子集，在健康和疾病期间产生保护性天然IgM抗体，防止氧化特异性表皮。B-1a细胞IgM的产生因B-1a细胞位置而异，因此从治疗的角度来看，将B-1a定位目标定位到支持高抗体生产的利基领域变得有用。在这里，我们描述了一种方法，通过逆转录病毒介导的C-X-C图案化学酶受体4（CXCR4）的过度表达，将B-1a细胞迁移到骨髓。原鼠B细胞的基因诱导可能具有挑战性，通常根据技术产生10-20%的低转染效率。在这里，我们证明原鼠B-1a细胞的逆转录病毒转导可产生30-40%的转染效率。该方法利用转导B-1a细胞的采用细胞转移到B细胞缺陷受体小鼠中，使供体B-1a细胞迁移和定位得到可视化。该协议可用于其他逆转录病毒结构，可用于收养后转移后的各种功能检测，包括对供体细胞或宿主细胞表型和功能的分析，或B-1a细胞转移后分泌的可溶性因子的分析。使用以CD45.1和CD45.2等位类型区分的不同供体和受体小鼠，并在逆转录病毒质粒体内存在GFP报告器，还可以检测含有内源性B细胞群的其他免疫充足的小鼠模型中的供体细胞。
Introduction
最近的研究表明，相当多的免疫细胞，特别是B细胞，皮质和功能异质性取决于细胞定位11，2，3，4，5。2,3,4,5B-1a细胞是具有异质性产生保护性IgM抗体的杂质能力的一个群体;骨髓B-1a细胞分泌IgM，对血浆IgM成形10剂6有显著贡献，而心内性B-1a细胞在平衡性时具有低水平IgM分泌，而是可以通过先天多收费的受体（TLR）或细胞因子介导的信号激活，以迅速增殖、迁移和分泌IgM7、8、9。7,8,9,B-1a细胞IgM抗体可识别病原体、凋亡细胞和氧化LDL上存在的氧化特异性表皮（OSE），与OSE结合的IgM可以预防动脉粥样硬化11等疾病的炎症性下游信号。因此，通过增加对骨髓等部位的细胞迁移来增加IgM产量的策略可能具有治疗性。然而，这种策略必须针对和细胞类型特定，因为非目标效应可能对免疫功能或健康产生负面影响。
在这里，我们描述了一种在原鼠B-1a细胞中针对和长期过度表达CXCR4的方法，以及随后的采用转移，以可视化细胞迁移和功能IgM抗体的产生（图1）。与转化细胞系的转染相比，原发B细胞的基因操作受到转染效率低的限制。然而，由于转化的细胞系可以显著偏离原细胞1212，13，13使用原细胞可能会提供的结果，更紧密地配合正常生理。在原鼠B细胞的基因转移中，已经描述了几种技术，包括逆转录病毒转导、脱病毒转导、脂肪化或电穿孔型转染，其效率、转化性和对细胞健康的影响13、14、15。,1513,以下方法采用逆转录病毒转导，因为它产生了足够的基因转移效率>30%，同时对细胞生存能力的影响最小。CXCR4表达逆转录病毒是使用前面描述的逆转录病毒构造鼠干细胞-内部核糖体进入部位-绿色荧光蛋白（MSCV-IRES-GFP） 产生的;MigR1）16，其中小鼠CXCR4基因被子克隆4。MigR1（控制（Ctl）-GFP和CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒是使用磷酸盐钙转染产生的，如先前公布的协议44、1414所述。
成功转导的B-1a细胞随后被静脉注射转移到淋巴细胞缺乏的Rag1-/----小鼠中。供体小鼠和受体小鼠还含有对脂蛋白E（ApoE）基因的敲除，导致OSE积累和动脉粥样硬化增加，从而为体内B-1细胞活化和IgM生产提供了一个模型。此外，供体小鼠和受体小鼠在CD45等位型上有所不同;供体B-1细胞来自CD45.1+ApoE-/-----小鼠，并转移到Rag1-/- CD45.2+ApoE-/------受体。这允许在移植后将供体CD45.1与受体CD45.2 B细胞区分，而无需在流细胞测量分析期间为B细胞标记额外染色。这里提供的结果表明，B-1a细胞上的目标CXCR4过度表达与B-1a细胞迁移到骨髓的能力增强有关，骨髓与血浆抗OSE IgM增加有关。我们还提供了一种通过负选择来丰富圆锥体B-1细胞的方法，并演示了B-1细胞激活对有效转导的要求。该方法可应用于其他逆转录病毒构造，以研究蛋白质过度表达对B-1a细胞迁移、表型或功能的影响。此外，使用CD45.1与CD45.2等位基因区分理论上可以允许转移到含有内源性B细胞的其他免疫足够的鼠型。
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Protocol
所有动物协议都得到弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 圆锥形B-1细胞的磁分离和浓缩
- 使用 CO2对 12-14 周大、男性、CD45.1+ApoE-/-鼠标进行安乐死。
- 使用笔直的手术剪刀在腹部进行表面切割，并用弯曲的剪刀剥去皮肤，露出腹壁。使用 10 mL 注射器和 25 G 针，以 10 mL 37 °C RPMI-1640 介质的 10 mL 冲洗穿孔腔。摇动鼠标以分离细胞，抓住尾部，将鼠标侧完全移到一侧，进行 15~20 s。
注：按摩灭黄的围膜也可以最大化细胞恢复。 - 使用10 mL注射器和25 G针收集围锥液，在肠子正上方，靠近肠道的臀部水平上方抽取液体。避免破坏表皮脂肪库和基础器官。避免从鼠标左侧抽取液体，因为脂肪很容易被吸入注射器中。
- 收集约6~7mL的液体后，分配成放置在冰上的50mL锥形管。接下来，使用钳子将锥形上方的圆锥壁垂直抬起鼠标，使任何剩余的液体都留在圆锥腔的底部。使用肝脏上方的手术剪刀（确保不要割伤肝脏），并使用玻璃移液器和灯泡收集剩余的盘面液体，在围锥壁上做一个小切口。
- 池围锥洗涤细胞从所有CD45.1+ApoE-/- 小鼠（n = 15+20）到50mL锥形管，并储存在冰上。
注：用于计算所需的小鼠数量：B-1a细胞占总圆锥体总种群的5-10%，每只小鼠在作者手中的细胞中大约产生2.5×55 B-1a细胞。转导效率为±30~40%，如下所示。 - 使用活性染料（如锥菊蓝色和血细胞计）计算活细胞（在锥体蓝色中稀释样品 1：5，并将 10 μL 加载到血细胞计室）。每个管最多 1 x 108个单元的池细胞。离心细胞在400 x g下5分钟，在4°C下，然后吸气上清剂。
- 在1 mL的抗CD16/CD32抗体（材料表）中重新悬浮高达1 x 108细胞，稀释1：50在测定缓冲液（1x磷酸盐缓冲盐水[PBS]，0.5%牛血清白蛋白[BSA]，2 mM EDTA），以阻断Fc受体。根据需要缩放，具体取决于单元格计数。在4°C下在冰上孵育10分钟。
- 在测定缓冲液中制备生物微化抗体的2倍主混合物（表1）以进行耗竭。2x 主混合物占细胞在孵育抗 CD16/CD32 时已经处于的液体体积。例如，如果细胞在稀释的抗CD16/CD32500μL中孵育，则加入含有10μL生物微化Ter119、Gr-1、CD23和NK1.1抗体的200μL和25μL的生物微化F4/80抗体，以达到表1中给出的最终浓度。在4°C下，将2倍主混合物添加到细胞中，并在20分钟内染色。
- 用5 mL的测定缓冲液和离心机在4°C下用g5 mL的测定缓冲液和离心机清洗5分钟，并在4°C下吸气上清。
- 根据制造商建议的浓度和协议，在测定缓冲液中稀释了抗生物青珠（材料表）的悬浮和孵育细胞。
- 用5 mL的测定缓冲液和离心机在4°C下在400 x g下清洗5分钟。在500μL的测定缓冲液中吸气上清液并重新悬浮至1 x 108细胞。
- 带3 mL检测缓冲液的优质磁选柱（材料表）。将细胞转移到引物磁选择柱上，并在冰上15mL锥形管中收集含有富集B-1细胞的洗脱剂。使用额外的检测缓冲液清洗磁选柱，直到收集的总体积为 10 mL。
注：预纯化和纯化后细胞分数的分配额应通过流细胞测定单独分析，通过染色CD19+B细胞、F480+巨噬细胞和CD5+T细胞，实现纯化效率，如图2所示。 - 计算后纯化细胞分数（含有富集B-1细胞的洗脱剂），计算像步骤1.6那样的活细胞， 在B细胞培养基中重新悬浮在1 x 106细胞/mL（RPMI-1640，10%热灭活胎儿牛血清[FBS]，10 mM HEPES，1倍非必需氨基酸，1 mM丙酮酸钠，50微克/mL根氨基素，55 μMβ-甲醇）。
2. 围肠B-1细胞刺激
- 为两个传感器条件（Ctl-GFP 和 CXCR4-GFP）分离池细胞，同时为非转导控制留出并电镀至少 10 x 106个单元。
- 每口板高达 150 μL（150，000 个细胞），放入 96 孔圆底板中。
- 在所有孔中加入 100 nM TLR9 激动剂 ODN1668，以刺激细胞增殖。
- 在37°C下孵育16~18小时，CO25% 。
3. 腹围B细胞的逆转录病毒转导
- 使用磷酸盐转染钙产生Ctl-GFP（MigR1）和CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒，如先前公布的协议14所述。
注：这将需要几天，所以准备和脚点逆转录病毒储存和存储等号在-80°C之前，开始此协议。 - 解冻冰上的逆转录病毒种群。立即使用，并且不重新冻结，因为病毒点位在冻结-解冻周期期间显著减少。在55μM最终浓度下，在8μg/mL聚苯乙烯和新鲜β-甲醇的情况下，在20：1多种感染（MOI）的细胞中加入Ctl-GFP或CXCR4-GFP逆转录病毒超级发电机。不要向为非转导控制而预留的细胞添加病毒储存。
- 在室温下，在 800 x g下通过离心板进行 90 分钟的分蒸。
- 在37°C下孵育带逆转录病毒的板，再孵育3小时，再孵育5%的CO2。
- 在新鲜的B细胞介质中收获和重新镀细胞，并在37°C下孵育，5%CO2过夜。
4. 转导性圆锥体B-1a细胞的细胞分拣
- 收获培养细胞和池成三个单独的50mL锥形管为每个条件：非转导，Ctl-GFP转送，和CXCR4-GFP转送。
- 将活细胞数为步骤 1.6 中，然后在 400 x g 下以 400 x g的离心机在 4 °C 下 5 分钟，然后吸气上清。
- 在含有1：50抗CD16/CD32抗体（材料表）的100，000个细胞/μL的排序缓冲液（PBS = 1% BSA）上重新悬浮细胞，以阻止Fc受体。在4°C下在冰上孵育10分钟。
- 用于补偿控制的无分量细胞（每次补偿控制约30，000细胞）：用于非转导样品的未染色和单染色控制等值，以及来自转导样品的 GFP 单染色控制等值。
注：如果非转导细胞数较低，商业上可用的补偿珠也可以用于单染色控制。 - 准备含有类缓冲液的氟磷联体抗体的2倍抗体母体混合物（表1）。将 2 倍主混合添加到非转导、CTL-GFP 转导和 CXCR4-GFP 转导样品中。将单个抗体添加到单个污渍对照组。在黑暗中4°C孵育20分钟。
注：2x 主混合物占细胞在用抗 CD16/CD32 孵育时已经处于的液体量，如步骤 1.8 中。CXCR4 可以单独染色每个条件的细胞等号，以确认 CXCR4 过度表达。 - 用 1 mL 的排序缓冲液清洗样品，并通过 70 μm 过滤器将菌株放入聚丙烯管中。
- 在 4°C 下在 400 x g下离心 5 分钟，吸气上清。在排序缓冲器中以 50，000 个单元/μL 重新挂起样本。
- 在细胞分拣之前，制备标有荧光活性细胞分拣（FACS）的收集管，含有1 mL的收集介质（RPMI-1640，20%热灭活FBS，10 mM HEPES，1倍非必需氨基酸，1 mM丙酸钠，50微克/mL根氨基胺，55 μM β-汞酮乙醇），每个种群要分类。
- 在细胞分拣机上运行样本之前，添加 2x DAPI（准备为 1：5000 分液缓冲液稀释），用于死细胞歧视。
- 将 GFP® B-1a 细胞分类到包含 DAPI 采集介质的 FACS 管中， CD19+ GFP+ B220中洛CD23- IgM+ CD5= CTL-GFP 和 CXCR4-GFP 样品中的细胞。使用非转导样品设置 GFP® 栅极，并排序 DAPI- CD19+ GFP- B220中洛CD23- IgM+ CD5+非转导 B-1a 电池。
注：或者，通过单独在GFP-分数内对B-1a细胞进行浇注，也可以从CTL-GFP和CXCR4-GFP样品中对非转导细胞进行排序。转导或非转导B-1b细胞也可以使用这种策略作为DAPI- CD19+ GFP+/- B220中洛CD23- IgM+ CD5-细胞排序。
5. 收养转移
- 细胞分拣后，在4°C下以400 x g的离心细胞5分钟，并小心吸气上清剂。
- 在1，000个细胞/μL下重新悬浮冷无菌1xPBS中的细胞。
- 使用同氟拉涅麻醉雄性Rag1-/-----------/----------小鼠，并使用超细胰岛素注射器通过静脉追溯轨道或尾静脉注射每只小鼠注射100μL（100，000个细胞）。-/-注射几只小鼠，用1xPBS作为对照。
6. 供体细胞和血浆IgM的定量化
- 在收养后转移后的预期时间，通过骨髓和脾组织收获4和流动细胞测定分析受体小鼠的转移细胞。通过染色 CD45.1、CD45.2 和 CXCR4 来量化供体细胞定位和 CXCR4 过度表达，并使用 Flowjo 等软件分析流细胞测定结果。
注： 有关此步骤中使用的抗体，请参阅表 1。确保不使用抗体结合，氟在FITC通道中，因为GFP将存在于转导的供体细胞。 - 通过在动物牺牲时通过心脏穿刺采集的全血中加入10μL0.5M EDTA来分离血浆。将全血在 7，000 x g下，将血浆离心到单独的 1.5 mL 离心机管中。储存在-80°C，直到通过ELISA4对分泌因子（如IgM）进行分析。
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Representative Results
图 1给出了协议的概述。图 2显示了其他锥形细胞类型的磁耗竭后，圆锥形 B-1a 细胞的富集。与F4/80+ 巨噬细胞相比，后耗尽分数中的活单细胞的CD19+B细胞比例+更高，缺乏CD5HI CD19- T细胞，并且与预耗尽分数相比，CD19+ CD5中B-1a细胞的频率增加。图 3显示了 B 细胞激活对成功逆转录病毒 B 细胞转导的要求，以及使用 Ctl-GFP 逆转录病毒成功转导 GFP+ B 细胞子集的频率与增加病毒 MOI 的频率相关增加。表 2显示了使用 96 个井圆底板与 24 孔或 6 孔板相比的转导效率提高。图 4显示了成功的 CXCR4 过度表达 （>40%）在B-1细胞上，在CXCR4-GFP逆转录病毒转染后，B-1细胞在体外向CXCL12迁移，对B细胞生存能力无显著影响。图 5显示了从非转换条件 （GFP-） 或两个传感器条件 （GFP+） 中分拣活、单体、CD19+ CD23+ CD23+ CD5+ B-1a 细胞的浇注策略。请注意，由于以前的磁耗竭，这些样品中不存在 CD23+ B-2 细胞。可转导活、单片、CD19+ CD23-IgM+ CD5-B-1b细胞也可使用此浇注策略进行排序。图6显示转移的CD45.1+供体细胞和持续的CXCR4在从骨髓和CD45.2受体小鼠脾脏中恢复的供体细胞在细胞转移后17周进行过度表达。表 3显示了 CXCR4 表达和骨髓供体细胞定位之间的正关联，但不包括脾脏。表4显示了骨髓中的供体细胞数与抗MDA-LDL IgM血浆量之间的正关联。
图1：逆转录病毒转导和采用转移实验设计的原理图。从CD45.1异体小鼠分离的围锥细胞，利用生物微化抗体和抗生物青珠，通过磁耗竭为B-1细胞丰富。浓缩的围锥B-1细胞被激活，用TLR9激动剂CpG寡氧核苷酸刺激细胞增殖。活性细胞通过Ctl-GFP或CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒进行转导。成功转导的GFP®B-1a细胞使用FACS进行分拣，并采用移植到CD45.2等位宿主小鼠中。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：圆锥体B-1细胞的浓缩。CD19+ B 细胞的圆锥体细胞预磁浓缩（顶部）和磁后富集（底部）的代表性流细胞学图。CD19+ F4/80- 细胞为B细胞，CD19-F4/80+细胞为巨噬细胞，CD19+CD5中细胞为B-1a细胞，CD19-CD5高细胞为T细胞。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：逆转录病毒转导需要B细胞激活。腹膜B细胞在5：1、10：1或25：1 MOI时与Ctl-GFP逆转录病毒发生音译，或在TLR9激动剂CpG ODN1668存在或缺席的情况下进行非转导。成功转导GFP+ B2、B1、B-1a或B-1b细胞的频率通过流细胞学18 h转染后进行量化。误差条表示均值 = SEM。请单击此处查看此图形的较大版本。
图 4：确认 CXCR4 过度表达和增加的 B-1a 体外迁移。来自ApoE-/--小鼠的腹膜B细胞细胞与CXCR4的B细胞特异性缺陷被分离和转导为Ctl-GFP或CXCR4-GFP逆转录病毒，或培养无转导。（a） 来自非转导（左上）、Ctl-GFP 传感器（左下）或 CXCR4-GFP 传感器（右下角）条件下的 B-1 细胞上的 CXCR4 和 GFP 表达的代表性流图。FMO-CXCR4（右上）用于设置 CXCR4 正门。（b） 从非转导（n = 1）、Ctl-GFP 转导（n = 2）或 CXCR4-GFP 传感器（n = 2）条件下对 GFP+ B-1 细胞的 CXCR4 MFI 进行定量。（c） 非转导（n = 1）、Ctl-GFP 转导（n = 2）或 CXCR4-GFP 转导 （n = 2） B-1 单元的频率，这些细胞迁移到 CXCL12 的频率占在转井中加载的 B-1 细胞总数的百分比。（d） 在成功转导的B细胞群（CD19_GFP+）内量化活细胞的代表性浇注策略。（e） 转染后使用 Ctl-GFP （n = 2） 或 CXCR4-GFP 逆转录病毒 （n = 2） 转染后活 B 细胞的频率。误差条表示均值 = SEM。这个数字已经从我们以前的出版物4中修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5：用于对转换的 GFP+ B-1a 细胞进行排序的浇注策略。用于从非转导样品（顶部）、Ctl-GFP 传感器样品（中间）和 CXCR4-GFP 转导样品（底部）对 GFP® 或 GFP-B-1a 细胞进行分型的代表性流细胞谱图。B-1a 细胞定义为活的、单的、CD19+ CD23- IgM+ CD5+ 细胞。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：转移供体细胞的定量化。代表流动细胞测量图显示CD45.1+CD45.2-供体细胞从一个PBS控制（顶部），一个Ctl-GFP+B-1a细胞受体（中），和一个CXCR4-GFP+ B-1a细胞受体（底部），并随后分析CXCR4表达在骨髓（a）或脾脏（b）。从骨髓（c） 或脾脏 （d） 对供体细胞的 CXCR4 表达（平均荧光强度，MFI）的定量。量化在受助人的骨髓（e） 或脾脏 （f） 中恢复的供体细胞数量。*P < 0.05 或 +P < 0.01 通过曼-惠特尼测试。误差条表示均值 = SEM。这个数字已经从我们以前的出版物4中修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 协议步骤 | 抗体 | 最终浓度 |
| 步骤 1.8 | 泰尔119生物体 | 每 100 μL 最终体积 1 μL |
| CD3e 生物群 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| Gr-1 生物型 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| CD23 生物群 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| NK1.1 生物体 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| F4/80 生物体 | 每 100 μL 最终体积 2.5 μL | |
| 抗体 | 最终浓度 | |
| 步骤 4.5 | CD5 PE | 每 100 μL 最终体积 1 μL |
| IgM PECF594 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| CD23 PECy7 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| B220 APC | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| CD19 APCef780 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| 抗体 | 最终浓度 | |
| 步骤 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 每 100 μL 最终体积 1 μL |
| CD45.2 BV421 | 每 100 μL 最终体积 1 μL | |
| CXCR4 APC | 每 100 μL 最终体积 2.5 μL |
表1：协议中使用的抗体及其最终浓度。
| 条件 | 占总人口的百分比 GFP* | CD19+ B 细胞的 %GFP* |
| 96 孔圆底板 | 30.9% | 52.7% |
| 24 孔板 | 8.4% | 21.2% |
| 6 孔板 | 16.2% | 27.3% |
表 2：板优化。在96孔圆底板（40孔，150，00）中6 x 106浓缩环锥B-1细胞转导后，成功转导总GFP+细胞或GFP+CD19+B细胞的频率 0 细胞每孔），24 孔板（6 孔，每口 1 x 106细胞），或 6 孔板（3 孔，每口 2 x 106细胞），在 20：1 MOI 与 Ctl-GFP 逆转录病毒。
| 变量 | 供体B-1a细胞上的CXCR4MFI | |
| r 值 | p 值 | |
| 骨髓中供体B-1a细胞的* | 0.71 | *0.014 |
| 脾脏中供体B-1a细胞的 * | 0.43 | 0.18 |
表3：供体细胞的CXCR4表达与供体细胞定位的关系。供体B-1a细胞CXCR4的平均荧光强度（MFI）与拉格1-/-----ApoE-//受体小鼠在收养后17周的骨髓或脾脏中的供体B-1a细胞数量相关。数据以相关系数（r）和统计显著性（p）的形式呈现。此表已从我们以前的出版物4中修改。
| 变量 | 骨髓中供体细胞的* | |
| r 值 | p 值 | |
| 等离子抗MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| 等离子 E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| 等离子体 1，3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
表4：供体细胞定位与抗OSEIgM血浆量之间的关联。Rag1-/- ApoE-/-受体小鼠在收养后17周的骨髓中供体B-1a细胞数量与抗MDA-LDL IgM、E06/T15 IgM或抗1，3-dextran IgM的循环量相关。数据以相关系数（r）和统计显著性（p）的形式呈现。此表已从我们以前的出版物4中修改。
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Discussion
此处提供的方法可实现稳定且相对高效的原发B-1a细胞基因传递、体内采用转移以及注射细胞的识别和定位。细胞在细胞转移后17周被检测到，并保留增加的CXCR4表达。逆转录病毒介导的传递使原鼠B-1a细胞的转导效率为30-40%，对我们手中的细胞生存能力的影响最小（图4e）。这与Moghimi及其同事先前的一项研究的结果一致，该研究将基因转移技术与原发性鼠B细胞（包括逆转录病毒感染、脱毛病毒感染、核素或叶小体素15）进行比较。然而，我们发现，CXCR4过度表达的范围在接收CXCR4-GFP传感器B-1a细胞的接收者中差异很大（图6c，d）。因此，我们利用关联分析来证明增加的CXCR4表达与增加的B-1a迁移和骨髓的定位相关，这与血浆IgM的增加有关（表3和表4）。
该方法的局限性包括获得足够数量的成功转导B-1a细胞所需的大量小鼠，以及转导效率从一个实验到另一个实验的变异性。病毒种群的分量较高，应至少为2×107传染性颗粒/mL14，提高了转染效率。使用12~16周的老小鼠也可以提高围锥性B-1细胞的收率，因为围锥B-1细胞数量随着17岁而增加。
还必须注意的是，通过转导B-1a细胞在收养后转移分泌的IgM量比采用后非转导B-1a细胞分泌的量少5倍，并进入相同的Rag1-/- ApoE-/--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------这可能是由于在逆转录病毒转导之前使用TLR9激动剂激活TLR9的细胞（图3），这可能限制二次激活和IgM生产，以回应OSE在收养后转移。因此，对于需要通过转移的B-1a细胞产生健壮IgM的研究，不需要先前B-1a细胞激活的替代基因转移技术，如扁病毒传递18，19，可能证明有用。18,或者，修改该协议，涉及激活策略，诱导增殖，但B-1a分化到IgM分泌细胞可能也足以成功逆转录病毒转导，而不影响继B细胞激活。IL-5是一种重要的细胞因子，能促进B-1a细胞增殖和存活，可能是TLR9刺激20、21,21的有效替代品。
先前的研究已经利用通过正或阴性选择策略分离的杂物B细胞，使用抗体对抗B220（B细胞标记）或Thy1.2（T细胞标记）13，14。,14然而，B220+杂量B细胞是一个异质种群，包含B-1和B-2细胞子集。此外，B-1细胞频率在总杂性CD19+B细胞群中较低（1⁄2%）。与此相反，该方法利用圆锥体腔作为B-1细胞源进行转导，因为B-1细胞占该隔间22中CD19+B细胞总数的60~70%，并使用CD23作为消耗光度B-2细胞的标记。基于 GFP、CD19、B220、CD23、IgM 和 CD5 表达式的成功转换 B-1a 细胞的后续排序进一步允许传输更明确定义的单元类型。磁耗竭策略，以丰富圆锥体B-1细胞，有效地耗尽T细胞，并将F4/80围锥形巨噬细胞的频率降低50%（图2），但进一步优化和故障排除这一关键步骤可提高转导效率。例如，使用更高浓度的生物微化F4/80抗体来改善巨噬细胞消耗可能会进一步提高B-1a细胞转导效率，因为其他细胞类型的"偏离目标"逆转录病毒转导量将减少。使用96孔圆底板进行转导，而不是平底24孔或6孔板，从而大大提高了转染效率（表2），但增加了处理和移液时间。
总体而言，此方法提供了一种有用的概念验证方法，用于确定针对 B-1a 细胞的基因传递是否可以改变 B-1a 细胞的定位和功能 IgM 生产。该技术的未来应用可能包括针对其他蛋白质的逆转录病毒结构的活体传递，以及通过转移来确定其对体内供体或宿主细胞过程的影响，包括细胞存活、迁移、增殖或功能。采用这种技术也是可能的免疫能力宿主，而不是淋巴细胞缺乏宿主，因为供体细胞（CD45.1+GFP+）可以从宿主细胞（CD45.2+GFP-）中区分。使用这种方法瞄准其他化学素受体可以进一步支持这样的假设，即针对B-1a细胞向高IgM生产的利基迁移，可以有效地提高保护性IgM水平。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 1R01 HL107490、1R01 HL136098、P01 HL055798 项目 3、P01 HL136275-01（C.A. McNamara）和 R01GM100776（T.P. Bender）的支持。A. Upadhye 由美国心脏协会博士后奖学金 16PRE3030002 和 5T32AI007496-20 提供支持。我们感谢弗吉尼亚大学流细胞测量核心的乔安妮·兰尼根、迈克·索尔加和克劳德·丘的出色技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
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