Summary
Här beskriver vi en metod för retroviral överuttryck och adoptivöverföring av murine B-1a celler för att undersöka in vivo B-1a cell migration och lokalisering. Detta protokoll kan förlängas för olika nedströms funktionella analyser inklusive kvantifiering av givaren B-1a cell lokalisering eller analys av givaren cell-härledda utsöndrade faktorer post-adoptivöverföring.
Abstract
Eftersom cellfunktionen påverkas av nischspecifika faktorer i den cellulära mikromiljön kan metoder för att dissekera celllokalisering och migrering ge ytterligare insikt om cellfunktionen. B-1a celler är en unik B-cell delmängd hos möss som producerar skyddande naturliga IgM antikroppar mot oxidation-specifika epitoper som uppstår under hälsa och sjukdom. B-1a cell IgM produktion skiljer sig beroende på B-1a cell plats, och därför blir det användbart ur terapeutisk synvinkel att rikta B-1a lokalisering till nischer som stöder hög antikroppsproduktion. Här beskriver vi en metod för att rikta B-1a cell migration till benmärgen genom retroviral-medierad överuttryck av C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninduktion i primära murine B-celler kan vara utmanande och ger vanligtvis låg känsveffektivitet på 10-20% beroende på teknik. Här visar vi att retroviral transduktion av primära murine B-1a celler resulterar i 30-40% transduktion effektivitet. Denna metod använder adoptivcellöverföring av transducerade B-1a-celler till B-cell-saknas mottagare möss så att givaren B-1a cellmigrering och lokalisering kan visualiseras. Detta protokoll kan ändras för andra retrovirala konstruktioner och kan användas i olika funktionella analyser post-adoptivöverföring, inklusive analys av givaren cell eller värdcell fenotyp och funktion, eller analys av lösliga faktorer utsöndras efter B-1a cell överföring. Användningen av olika donator- och mottagarmöss som differentieras med CD45.1 och CD45.2 allotyp och förekomsten av en GFP-reporter inom den retrovirala plasmid kan också möjliggöra detektion av givarceller i andra, immun-tillräckliga musmodeller som innehåller endogena B-cellpopulationer.
Introduction
Nyligen genomförda studier har visat betydande immuncell, och specifikt B-cell, fenotypisk och funktionell heterogenitet beroende på celllokalisering1,,2,,3,,4,5. B-1a celler är en sådan population med heterogen kapacitet att producera skyddande IgM antikroppar; Benmärg B-1a celler utsöndrar IgM constitutively och bidrar avsevärt till plasma IgM titers6, medan peritoneal B-1a celler har låg nivå IgM sekretion på homeostasis och istället kan aktiveras genom medfödda vägtull-liknande receptor (TLR) eller cytokin-medierad signalerar att snabbt föröka sig, migrera och utsöndra IgM7,,8,9,10. B-1a cell IgM antikroppar känner igen oxidation-specifika epitoper (OSE) som finns på patogener, apoptotiska celler, och oxiderad LDL, och IgM bindning till OSE kan förhindra inflammatoriska nedströms signalering i sjukdomar som åderförkalkning11. Därför kan strategier för att öka IgM-produktionen via ökande peritoneal B-1a cellmigration till platser som benmärgen vara terapeutiskt användbara. Emellertid, Det är viktigt för sådana strategier som skall riktas och cell-typ specifika, som off-target effekter kan negativt påverka immunförsvaret eller hälsa.
Här beskriver vi en metod för riktad och långsiktig överuttryck av CXCR4 i primära murine B-1a celler och efterföljande adoptivöverföring för att visualisera cellmigration och funktionell IgM-antikroppsproduktion (figur 1). Genetisk manipulation av primära B-celler begränsas av låg transfection effektivitet jämfört med transfection av transformerade cellinjer. Men eftersom transformerade cellinjer kan avvika avsevärt från primära celler12,13, är användningen av primära celler sannolikt att ge resultat som närmare anpassar sig till normal fysiologi. Flera tekniker har beskrivits för genöverföring i primära murine B-celler, inklusive retroviral transduktion, adenoviral transduktion, lipofection, eller elektroporation-baserade transfection, som har varierande nivåer av effektivitet, transience, och inverkan på cellhälsa13,14,15. Följande metod utnyttjade retroviral transduktion eftersom det gav tillräcklig genöverföring effektivitet på >30% medan minimalt påverkar cellens livskraft. CXCR4-uttryck retrovirus genererades med hjälp av den tidigare beskrivna retrovirala konstruktionen murine stamceller virus-inre ribosomal posten webbplats-gröna fluorescerande protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, i vilken musen CXCR4 genen var sub-klonade4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) och CXCR4-GFP retrovirala partiklar genererades med kalciumfosfattransfection enligt beskrivningen i tidigare publicerade protokoll4,14.
Framgångsrikt transduced B-1a celler överfördes sedan intravenöst till lymfocyter-saknas Rag1-/- möss. Både givare och mottagare möss innehöll dessutom knockout av apolipoprotein E (ApoE) genen, vilket resulterar i ökad OSE ackumulering och åderförkalkning, vilket ger en modell för in vivo B-1 cell aktivering och IgM produktion. Dessutom skilde sig donator- och mottagarmöss i cd45 allotyp. givaren B-1 celler kom från CD45.1+ ApoE-/- möss och överfördes till Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- mottagare. Detta möjliggjorde differentiering av givaren CD45.1 från mottagaren CD45.2 B-celler efter överföringen utan att behöva ytterligare fläck för B-cell markörer under flöde cytometri analys. De resultat som anges här visar att riktade CXCR4 överuttryck på B-1a celler associerar med ökad förmåga B-1a celler att migrera till benmärgen, som associerar med ökad plasma anti-OSE IgM. Vi tillhandahåller dessutom en metod för anrikning av bukhinnans B-1 celler genom negativt urval och visa kravet på B-1 cell aktivering för effektiv transduktion. Denna metod kan anpassas för andra retrovirala konstruktioner för att studera effekten av proteinöveruttryck på B-1a cellmigration, fenotyp eller funktion. Dessutom skulle användningen av CD45.1 jämfört med CD45.2 allotype skillnad teoretiskt tillåta överföring till andra immun-tillräckliga murine modeller som innehåller endogena B-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur protokoll godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of Virginia.
1. Magnetisk separation och anrikning av peritoneal B-1 celler
- Avliva en 12−14 veckor gammal, manlig, CD45.1+ApoE-/- mus med CO2.
- Gör ett ytligt snitt i buken med rak kirurgisk sax och skala tillbaka huden med böjd sax för att exponera peritoneal väggen. Spola bukhinnans hålighet med 10 ml 37 °C RPMI-1640 medium med en 10 ml spruta och 25 G nål. Skaka musen för att koppla ur cellerna genom att ta tag i svansen och flytta musen sida till sida noggrant i 15−20 s.
OBS: Massera lavaged bukhinnan kan också maximera cellåtervinning. - Samla peritoneal vätska med hjälp av en 10 ml spruta och 25 G nål genom att dra upp vätska på den nedre högra sidan av bukhinnan strax ovanför höftnivån, nära tarmarna. Undvik att störa epidydimal fett depåer och underliggande organ. Undvik att dra vätska från musens vänstra sida eftersom omentalfettet lätt kan dras in i sprutan.
- När ~6−7 ml vätska har samlats in, fördela i ett koniskt rör på 50 ml som placeras på is. Därefter höja musen vertikalt genom att hålla peritoneal väggen ovanför membranet med pincett så att eventuella återstående vätska kvar i botten av bukhålan. Gör ett litet snitt i bukhinnan väggen med kirurgisk sax ovanför levern (se till att inte skära levern) och samla eventuella återstående peritoneal vätska med hjälp av ett glas pipet och glödlampa.
- Pool peritoneal washout celler från alla CD45.1+ApoE-/- möss (n = 15−20) i 50 ml koniska rör, och förvara på is.
OBS: För beräkning av antalet möss som behövs: B-1a celler utgör 5−10% av den totala bukhinnan befolkningen och ger ungefär 2,5−5 x 105 B-1a celler per mus i författarnas händer. Transduktionseffektiviteten är ~30−40%, som visas nedan. - Räkna levande celler med hjälp av ett vibilitetsfärgämne som trypanblå och en hemocytometer (spädprover 1:5 i trypanblå och lasta 10 μL i hemocytometerkammaren). Poolceller på upp till 1 x 108 celler per rör. Centrifugceller vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera sedan supernatant.
- Resuspend upp till 1 x 108 celler i 1 ml anti-CD16/CD32 antikroppar (Tabell av material) utspädd 1:50 i analysen buffert (1x fosfat buffrad saltlösning [PBS], 0,5% bovin serum albumin [BSA], 2 mM EDTA) för att blockera Fc-receptorer. Skala efter behov baserat på antalet celler. Inkubera på is i 10 min vid 4 °C.
- Förbered en 2x-masterblandning av de biotinylerade antikropparna (tabell 1) i analysbuffert för utarmning. Den 2x master mix står för volymen av vätskan cellerna är redan i när inkubera med anti-CD16/CD32. Om cellerna till exempel inkuberar i 500 μL utspädd anti-CD16/CD32, tillsätt sedan 500 μl 2x master mix som innehåller 10 μl biotinylerade Ter119, Gr-1, CD23 och NK1.1 antikroppar och 25 μl biotinylerade F4/80-antikroppar för att uppnå de slutliga koncentrationerna i tabell 1. Tillsätt 2x master mix till celler och fläck i 20 min vid 4 °C.
- Tvätta celler med 5 ml analysbuffert och centrifug vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatant.
- Återanvända och inkubera celler med anti-biotinmikropärer (Tabell över material) utspädda i analysbuffert enligt den koncentration och det protokoll som rekommenderas av tillverkaren.
- Tvätta med 5 ml analysbuffert och centrifug vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Sugsupermedlet och återsuspend upp till 1 x 108 celler i 500 μL analysbuffert.
- Prime magnetiska val kolumner (Tabell över material) med 3 ml analys buffert. Överför celler till primade magnetiska urvalskolonner och samla in eluenten som innehåller berikade B-1-celler i ett koniskt rör på 15 ml på is. Tvätta den magnetiska urvalskolonnen med ytterligare analysbuffert tills den totala volymen som samlas in är 10 ml.
OBS: Ett alikvot av de förrenade och postrenade cellfraktionerna bör analyseras separat med flödescytometri för reningseffektivitet genom färgning för CD19+ B-celler, F480+ makrofager och CD5+ T-celler enligt figur 2. - Räkna den postrenade cellfraktionen (eluenten som innehåller berikade B-1-celler) genom att räkna levande celler som i steg 1.6 och återsuspend vid 1 x 106 celler/ml i B-cellodlingsmedium (RPMI-1640, 10% värmeaktiverat fetala bovin serum [FBS], 10 mM HEPES, 1x icke-essentiella aminosyror, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM β-mercaptoetanol).
2. Peritoneal B-1 cell stimulering
- Dela poolade celler för de två omutbildade förhållandena (Ctl-GFP och CXCR4-GFP), samtidigt som man lägger åt sidan och plätering av minst 10 x 106 celler för en icke-transduced kontroll.
- Platta upp till 150 μL (150 000 celler) per brunn i 96-brunns runtbottenplattor.
- Lägg till 100 nM TLR9 agonist ODN1668 till alla brunnar för att stimulera cellproliferation.
- Inkubera i 16−18 h vid 37 °C, 5% CO2.
3. Retroviral transduktion av bukhinnans B-celler
- Generera reflektorer mellan Ctl-GFP (MigR1) och CXCR4-GFP med kalciumfosfattransfection enligt beskrivningen i tidigare publicerade protokoll14.
OBS: Detta kommer att ta flera dagar, så förbereda och titer retrovirala lager och lagra alikvoter på -80 °C innan detta protokoll påbörjas. - Tina retrovirus lager på is. Använd omedelbart och inte åter frysa som virus titer minskar avsevärt under frys-tö cykler. Tillsätt Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirala supernatanter vid 20:1 multiplicitet av infektion (MOI) till celler, i närvaro av 8 μg/ml polybrene och färsk β-mercaptoetanol vid 55 μM slutlig koncentration. Tillsätt inte viruslager till de celler som avsatts för icke-ometalderade kontroll.
- Utför spinfection genom centrifugingplattor vid 800 x g i 90 min vid rumstemperatur.
- Inkubera plattor med retrovirus vid 37 °C, 5% CO2 för ytterligare 3 timmar.
- Skörda och replate celler i färsk B-cell medium och inkubera vid 37 °C, 5% CO2 över natten.
4. Cellsortering av transducerade peritoneal B-1a celler
- Skörda odlade celler och pool i tre separata 50 ml koniska rör för varje tillstånd: icke-transduced, Ctl-GFP utbildad, och CXCR4-GFP utbildad.
- Räkna levande celler som i steg 1,6, sedan centrifug vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatant.
- Resuspend celler vid 100.000 celler /μL i sorteringsbuffert (PBS + 1% BSA) som innehåller 1:50 anti-CD16/CD32 antikroppar (Tabell av material) för att blockera Fc-receptorer. Inkubera på is i 10 min vid 4 °C.
- Aliquot celler för kompensation kontroller (~ 30.000 celler per kompensationskontroll): för oavbrända och enda fläck kontroller aliquot från icke-transduced prov och för GFP enda fläck kontroll aliquot från transduced prover.
OBS: Kommersiellt tillgängliga ersättningspärlor kan alternativt användas för enstaka fläckkontroller om det icke-transducerade cellnumret är lågt. - Bered en 2x antikroppsbörsblandning som innehåller fluoroforekonjugerade antikroppar i sorteringsbuffert (tabell 1). Tillsätt 2x master mix till icke-transduced, CTL-GFP transduced, och CXCR4-GFP transduced prover. Tillsätt enskilda antikroppar till enstaka fläckkontroller. Inkubera i 20 min vid 4 °C i mörker.
OBS: 2x master mix står för volymen av vätska cellerna är redan i när inkubera med anti-CD16/CD32, som i steg 1.8. En alikvot av celler från varje tillstånd kan separat färgas för CXCR4 för att bekräfta CXCR4 överuttryck. - Tvätta proverna med 1 ml slags buffert och sila genom 70 μm filter i polypropylenrör.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatant. Resuspend prover på 50.000 celler /μL i sorteringsbuffert.
- Före cellsortering bereder märkt fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) insamlingsrör som innehåller 1 ml samlingsmedium (RPMI-1640, 20% värmeaktiverad FBS, 10 mM HEPES, 1x icke-essentiella aminosyror, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg/ml gentamicin, 55 μM β-mercaptoetanol) för varje population som ska sorteras.
- Innan du kör prover på cellsorteraren tillsätt 2x DAPI (beredd som 1:5000 utspädning i sorteringsbuffert) för död celldiskriminering.
- Sortera GFP+ B-1a-celler i FACS-rör som innehåller insamlingsmedium som DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ celler från CTL-GFP- och CXCR4-GFP-proverna. Använd det icke-transduced provet för att ställa in GFP+-porten och sortera DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ icke-transduced B-1a-celler.
Obs: Alternativt kan icke-transduced celler också sorteras från CTL-GFP och CXCR4-GFP prover genom att separat gating B-1a celler inom GFP-fraktionen. Transduced eller icke-transduced B-1b celler kan också sorteras med denna sorteringsstrategi som DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- celler.
5. Adoptivöverföring
- Efter cellsortering, centrifugceller vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och aspirera supernatant noggrant.
- Resuspend celler i kall steril 1x PBS vid 1000 celler/μL.
- Bedöva manliga Rag1-/- ApoE-/- möss som använder isofluran och injicerar 100 μL (100 000 celler) per mus via intravenös retro-orbital eller svansveninjektion med en ultrafin insulinspruta. Injicera några möss med 1x PBS som en kontroll.
6. Kvantifiering av givarceller och plasma IgM
- Vid önskad tid post-adoptivöverföring, analysera överförda celler i mottagarmöss med benmärg och mjälte vävnadsskörd4 och flödescytometri. Kvantifiera givarcelllokalisering och CXCR4 överuttryck genom färgning för CD45.1, CD45.2 och CXCR4 och analysera flödescytometriresultat med hjälp av en programvara som Flowjo.
OBS: Se tabell 1 för antikroppar som används i detta steg. Se till att inte använda ett antikroppskonjugat som fluorescerar i FITC-kanalen eftersom GFP kommer att finnas på transducerade givarceller. - Isolera plasma genom att tillsätta 10 μL 0,5 M EDTA till helblod som samlats in via hjärtpunktering vid tidpunkten för djuroffret. Centrifugera helblod vid 7000 x g och alikvotplasma i separata 1,5 ml centrifugrör. Förvaras vid -80 °C tills analys av utsöndrade faktorer som IgM utförs av ELISA4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över protokollet ges i figur 1. Figur 2 visar anrikning av peritoneal B-1a celler efter magnetisk utarmning av andra peritoneal celltyper. Levande singlet celler i post-utarmning fraktion har en större andel av CD19 + B-celler jämfört med F4/80+ makrofager, saknar CD5hi CD19- T-celler, och innehåller en ökad frekvens av CD19+ CD5mitten B-1a celler jämfört med pre-utarmning fraktion. Figur 3 visar kravet på B-cellaktivering för framgångsrik retroviral B-celltransduktion och en dosberoende ökning av frekvensen av framgångsrikt transducerade GFP + B-cellundergrupper med ökande virus MOI med ctl-GFP retrovirus. Tabell 2 visar ökad transduktionseffektivitet med 96 väl runtbottenplattor jämfört med 24-brunns- eller 6-brunnsplattor. Bild 4 visar lyckad CXCR4-överuttryck (>40 %) på B-1-celler och ökad B-1-cellsmigration mot CXCL12 in vitro efter transduktion med CXCR4-GFP retrovirus, utan någon signifikant inverkan på B-cellens livskraft. Figur 5 visar gating-strategin för sortering av levande, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a-celler från antingen ett icke-transduced tillstånd (GFP-) eller de två transduced villkoren (GFP+). Observera att CD23+ B-2-celler inte finns i dessa prover på grund av tidigare magnetisk utarmning. Transduced live, singlet, CD19 + CD23- IgM + CD5- B-1b celler kan också sorteras med denna gating strategi. Figur 6 visar överförda CD45.1+ givarceller och ihållande CXCR4-överuttryck på givarceller som återhämtat sig från benmärg och mjälte av CD45.2 mottagarmöss 17 veckor efter cellöverföring. Tabell 3 visar en positiv koppling mellan CXCR4 uttryck och givare cell lokalisering till benmärgen, men inte mjälte. Tabell 4 visar ett positivt samband mellan givarcellnummer i benmärgen och plasmamängden anti-MDA-LDL IgM.
Figur 1: Schematisk för experimentell design för retroviral transduktion och adoptivöverföring. Peritoneal celler isolerade från CD45.1 allotyp möss är berikade för B-1 celler genom magnetisk utarmning med hjälp av biotinylerade antikroppar och anti-biotin microbeads. Berikade peritoneal B-1 celler aktiveras för att stimulera cellproliferation med TLR9 agonist CpG oligodeoxynucleotide. Aktiverade celler tillverkas med Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirala partiklar. Framgångsrikt transducerade GFP + B-1a celler sorteras med FACS och adoptivt överföras till CD45.2 allotype värd möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Anrikning för peritoneal B-1 celler. Representativa flöde cytometri tomter av peritoneal celler pre-magnetisk anrikning (överst) och post-magnetisk anrikning (botten) för CD19 + B-celler. CD19+ F4/80- celler är B-celler, CD19- F4/80+ celler är makrofager, CD19+ CD5mellanceller är B-1a-celler och CD19- CD5hi-celler är T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Retroviral transduktion kräver B-cellsaktivering. Peritoneal B-celler var transduced med Ctl-GFP retrovirus på 5:1, 10:1 eller 25:1 MOI eller vänster icke-transduced i närvaro eller avsaknad av TLR9 agonist CpG ODN1668. Frekvensen av framgångsrikt transduced GFP + B2, B1, B-1a eller B-1b celler kvantifierades av flöde cytometri 18 h post-transduktion. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bekräftelse av CXCR4 överuttryck och ökad B-1a migration in vitro. Peritoneal B-celler från ApoE-/- möss med B cell-specifik brist på CXCR4 isolerades och transduced med Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirus, eller odlade utan transduktion. a) Representativa flödesområden med CXCR4- och GFP-uttryck på B-1-celler från icke-transducerade (övre vänstra), Ctl-GFP-transducerade (nedre vänstra) eller CXCR4-GFP-transducerade förhållanden (nedre högra) . FMO-CXCR4 (övre högra) används för att ställa CXCR4 positiv grind. b)Kvantifiering av MFI av CXCR4 på GFP+ B-1-celler från icke-transducerade (n = 1), Ctl-GFP-transducerade (n = 2) eller CXCR4-GFP-transducerade (n = 2) förhållanden. c)Frekvens av icke-transduced (n = 1), Ctl-GFP som har tillverkats (n = 2) eller CXCR4-GFP-transducerade (n = 2) B-1-celler som migrerade mot CXCL12 i procent av det totala antalet B-1-celler som laddats i omlastning. d)Representativ strategi för kvantifiering av livskraftiga celler inom den framgångsrikt omfeducerade B-cellpopulationen (CD19+GFP+). e)Frekvens av levande B-celler efter transduktion med Ctl-GFP (n = 2) eller CXCR4-GFP retrovirus (n = 2). Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM. Denna siffra har ändrats från vår tidigare publikation4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Gating strategi för sortering av transducerade GFP + B-1a celler. Representativa flödescytometriområden för sortering av GFP+ eller GFP- B-1a-celler från ett icke-transducerat prov (överst), ett Ctl-GFP-transducerat prov (mitten) och ett CXCR4-GFP-transducerat prov (botten). B-1a celler definieras som levande, singlet, CD19 + CD23- IgM + CD5 + celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kvantifiering av överförda donatorceller. Representativa flödescytometridiagram som visar CD45.1+ CD45.2- givarceller från en PBS-kontroll (överst), en Ctl-GFP+ B-1a-cellmottagare (mitten) och en CXCR4-GFP+ B-1a-cellmottagare (botten) och efterföljande analys av CXCR4-uttryck på givarceller i benmärgen (a), eller mjälta (b). Kvantifiering av CXCR4-uttryck (genomsnittlig fluorescensintensitet, MFI) på givarceller från benmärg (c) eller mjälte (d). Kvantifiering av antalet givarceller som återvunnits i benmärg(e)eller mjälte (f)av mottagarna. *P < 0.05 eller **P < 0.01 av Mann-Whitney test. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM. Denna siffra har ändrats från vår tidigare publikation4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protokollsteg | Antikropp | Slutlig koncentration |
| Steg 1.8 | Ter119 biotin | 1 μL per 100 μL slutlig volym |
| CD3e biotin | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| Gr-1 biotin | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| CD23 biotin | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| NK1.1 biotin | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| F4/80 biotin | 2,5 μl per 100 μl slutlig volym | |
| Antikropp | Slutlig koncentration | |
| Steg 4.5 | CD5 PE | 1 μL per 100 μL slutlig volym |
| IgM PECF594 | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| CD23 PECy7 | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| B220 APC | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| CD19 APCef780 | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| Antikropp | Slutlig koncentration | |
| Steg 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 μL per 100 μL slutlig volym |
| CD45.2 BV421 | 1 μL per 100 μL slutlig volym | |
| CXCR4 APC | 2,5 μl per 100 μl slutlig volym |
Tabell 1: Antikroppar och deras slutliga koncentrationer som används i protokollet.
| Villkor | %GFP+ för den totala populationen | %GFP+ för CD19+ B-celler |
| 96-brunns plattan | 30.9% | 52.7% |
| 24-brunnsplatta | 8.4% | 21.2% |
| 6-brunnsplatta | 16.2% | 27.3% |
Tabell 2: Plattoptimering. Frekvens av framgångsrikt omdaucerade totala GFP+-celler eller GFP+ CD19+ B-celler efter transduktion av 6 x 106 berikade peritoneal B-1-celler i antingen en 96-brunns plattan med rund botten (40 brunnar vid 150 000 celler per brunn), en 24-brunnsplatta (6 brunnar vid 1 x 106 celler per brunn), eller en 6-brunnsplatta (3 brunnar vid 2 x 106 celler per brunn) vid en 20:1 MOI med Ctl-GFP retrovirus.
| Variabel | MFI av CXCR4 på givare b-1a celler | |
| R | p-värde | |
| Antal donator B-1a-celler i benmärg | 0.71 | *0.014 |
| Antal donator B-1a-celler i mjälte | 0.43 | 0.18 |
Tabell 3: Association mellan CXCR4 uttryck på givare celler och givare cell lokalisering. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) av CXCR4 på givar B-1a-celler korrelerade med antalet donator B-1a-celler i benmärg eller mjälte i Rag1-/- ApoE-/- mottagarmöss 17 veckor efter adoptivöverföring. Data som presenteras som korrelationskoefficient (r) och statistisk signifikans (p). Denna tabell har ändrats från vår tidigare publikation4.
| Variabel | Antal givarceller i benmärg | |
| R | p-värde | |
| Plasma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plasma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plasma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tabell 4: Association mellan givare cell lokalisering och plasma mängd anti-OSE IgM. Antalet donator B-1a celler i benmärg av Rag1-/- ApoE-/- mottagare möss 17 veckor post-adoptivöverföring korrelerade med cirkulerande mängd anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM, eller anti-1,3-dextran IgM. Data som presenteras som korrelationskoefficient (r) och statistisk signifikans (p). Denna tabell har ändrats från vår tidigare publikation4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som tillhandahålls här möjliggör stabil och relativt effektiv primär B-1a cell gen leverans, in vivo adoptivöverföring, och identifiering och lokalisering av injicerade celler. Celler kunde upptäckas 17 veckor post-cell överföring och behöll ökad CXCR4 uttryck. Retrovirusmedierad leverans gav 30-40% transduktionseffektivitet primära murine B-1a celler med minimal inverkan på cellens livskraft i våra händer(figur 4e). Detta är i linje med resultaten från en tidigare studie av Moghimi och kollegor som jämförde tekniker för genöverföring till primära murine B-celler inklusive retroviral infektion, adenoviral infektion, nukleofection, eller lipofectamin15. Vi fann dock att intervallet CXCR4 överuttryck varierade avsevärt inom mottagare som fick CXCR4-GFP transduced B-1a celler(Figur 6c, d). Därför använde vi associativ analys för att visa att ökat CXCR4-uttryck korrelerade med ökad B-1a-migrering och lokalisering till benmärgen, som förknippas med ökad plasma IgM (tabell 3 och tabell 4).
Begränsningar av denna metod inkluderar det stora antalet möss som krävs för att få tillräckligt många framgångsrikt ombyggda B-1a celler, och variationen i transduction effektivitet från ett experiment till ett annat. Transduktionseffektiviteten förbättras genom högre titrar av viruslager, vilket bör vara minst 2 x 107 infektiösa partiklar/ml14. Användningen av äldre möss i åldern 12−16 veckor kan också förbättra peritoneal B-1 cell avkastning, som peritoneal B-1 cell nummer ökar med åldern17.
Det är också viktigt att notera att mängden IgM som utsöndras av transducerade B-1a-celler efter adoptivöverföring var ~ 5 gånger mindre än den mängd som utsöndras av icke-transduced B-1a celler efter adoptivöverföring till samma Rag1-/- ApoE-/- modell (data visas inte). Detta kan bero på kravet på B-1-cellsaktivering med TLR9-agonist före retroviral transduktion (figur 3), som kan begränsa sekundär aktivering och IgM-produktion som svar på OSE in vivo post-adoptivöverföring. För studier som kräver robust IgM-produktion av överförda B-1a-celler kan därför alternativa genöverföringstekniker som inte kräver tidigare B-1a-cellaktivering, såsom lentiviral leverans18,19, visa sig användbara. Alternativt kan ändringar av detta protokoll som innebär aktiveringsstrategier för att inducera spridning men inte B-1a differentiering i IgM-utsöndrande celler också vara tillräckliga för framgångsrik retroviral transduktion utan att påverka sekundär B-cellaktivering. IL-5 är en viktig cytokin medla B-1a cell spridning och överlevnad, och kan vara ett effektivt alternativ till TLR9stimulering 20,21.
Tidigare studier har använt splenic B-celler isolerade genom positiva eller negativa urvalsstrategier med antikroppar mot B220 (B-cellmarkör) eller Thy1.2 (T-cellmarkör)13,14. B220+ mjältceller är dock en heterogen population som innehåller cellundergrupperna B-1 och B-2. Dessutom är B-1 cellfrekvens inom den totala splenic CD19 + B cellpopulationen låg (1−2%). Däremot använder denna metod bukhinnan hålighet som en B-1 cellkälla för transduktion, som B-1 celler utgör 60−70% av den totala CD19 + B-celler i detta fack22, och använder CD23 som en markör för utarmning peritoneal B-2 celler. Efterföljande sortering av framgångsrikt transducerade B-1a-celler baserat på GFP-, CD19-, B220-, CD23-, IgM- och CD5-uttryck möjliggör ytterligare överföring av en mer specifikt definierad celltyp. Den magnetiska utarmning strategi för att berika peritoneal B-1 celler effektivt utarmat T-celler, och minskade F4/80 peritoneal makrofag frekvens med ~ 50% i våra händer (figur 2), men ytterligare optimering och felsökning av detta kritiska steg kan öka transduktion effektivitet. Till exempel, med hjälp av en högre koncentration av biotinylerade F4/80 antikroppar för bättre makrofag utarmning kan ytterligare öka B-1a cell transduktion effektivitet, eftersom det skulle vara mindre "off-target" retroviral transduktion av andra celltyper. Användningen av 96-väl runtbotten plattor för transduktion, i stället för platt-botten 24-brunn eller 6-brunn plattor dessutom avsevärt förbättrad transduktion effektivitet (Tabell 2), men ökar hantering och pipettering tid.
Sammantaget ger denna metod en användbar proof-of-concept strategi för att avgöra om riktade genleverans till B-1a celler kan förändra B-1a cell lokalisering och funktionella IgM produktion. Framtida tillämpningar av denna teknik kan omfatta ex vivo leverans av retrovirala konstruktioner som riktar sig till andra proteiner, och adoptivöverföring för att bestämma dess effekt på givare eller värdcell processer in vivo, inklusive cell överlevnad, migration, spridning, eller funktion. Adoptivöverföring till immunkompetenta värdar, snarare än lymfocyter-bristfälliga värdar, skulle också vara möjligt med denna teknik eftersom givarceller (CD45.1+ GFP+) skulle kunna skiljas från värdceller (CD45.2+ GFP-). Inriktning andra chemokine receptorer med denna metod kan ytterligare stödja hypotesen att rikta B-1a cell migration mot nischer tillåtande av hög IgM produktion effektivt kan öka nivåerna av skyddande IgM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 av P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) och R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye stöddes av American Heart Association Pre-doctoral fellowship 16PRE30300002 och 5T32AI007496-20. Vi tackar Joanne Lannigan, Mike Solga och Claude Chew från University of Virginia Flow Cytometry Core för deras utmärkta tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
