Summary
Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.
Abstract
Aangezien de celfunctie wordt beïnvloed door nichespecifieke factoren in de cellulaire micro-omgeving, kunnen methoden om cellokalisatie en migratie te ontleden, verder inzicht geven in de celfunctie. B-1a cellen zijn een unieke B-cel subset in muizen die beschermende natuurlijke IgM antilichamen produceren tegen oxidatie-specifieke epitopen die ontstaan tijdens de gezondheid en ziekte. B-1a cel IgM productie verschilt afhankelijk van B-1a cel locatie, en daarom wordt het nuttig vanuit een therapeutisch oogpunt te richten B-1a lokalisatie niches ondersteunen van hoge antilichaam productie. Hier beschrijven we een methode om B-1a celmigratie naar het beenmerg te richten door retrovirale gemedieerde overexpressie van het C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninductie in primaire murine B-cellen kan uitdagend zijn en levert meestal lage transfectie-efficiëntie van 10-20% op, afhankelijk van de techniek. Hier tonen we aan dat retrovirale transductie van primaire murine B-1a cellen resulteert in 30-40% transductie-efficiëntie. Deze methode maakt gebruik van adoptieceloverdracht van getransduceerde B-1a cellen in B-cel-deficiënte ontvangende muizen, zodat donor B-1a celmigratie en lokalisatie kan worden gevisualiseerd. Dit protocol kan worden gewijzigd voor andere retrovirale constructies en kan worden gebruikt in diverse functionele tests post-adoptieve overdracht, met inbegrip van analyse van donorcel of gastheer cel fenotype en functie, of analyse van oplosbare factoren afgescheiden post B-1a cel overdracht. Het gebruik van verschillende donor- en ontvangermuizen, onderscheiden door CD45.1 en CD45.2-allotype en de aanwezigheid van een GFP-verslaggever binnen het retrovirale plasmide, zou ook de detectie van donorcellen in andere, immuun-toereikende muismodellen met endogene B-celpopulaties mogelijk kunnen maken.
Introduction
Recente studies hebben aangetoond aanzienlijke immuuncel, en met name B-cel, fenotypische en functionele heterogeniteit, afhankelijk van cellokalisatie1,2,3,4,5. B-1a cellen zijn een dergelijke populatie met heterogene capaciteit om beschermende IgM-antilichamen te produceren; beenmerg B-1a cellen scheiden IgM constitutief en dragen aanzienlijk bij aan plasma IgM titers6, terwijl peritoneale B-1a cellen hebben low-level IgM secretie op homeostase en in plaats daarvan kan worden geactiveerd door aangeboren tol-achtige receptor (TLR) of cytokine-gemedieerde signalering om snel te vermenigvuldigen, migreren en scheiden IgM7,8,9,10. B-1a-cel IgM-antilichamen herkennen oxidatiespecifieke epitopen (OSE) die aanwezig zijn op pathogenen, apoptotische cellen en geoxideerde LDL, en IgM-binding aan OSE kunnen ontstekings downstream signalering voorkomen bij ziekten zoals atherosclerose11. Daarom kunnen strategieën om de IgM-productie te verhogen via het verhogen van peritoneale B-1a-celmigratie naar sites zoals het beenmerg therapeutisch nuttig zijn. Het is echter belangrijk dat dergelijke strategieën worden gericht en cel-type specifiek, als off-target effecten kunnen een negatieve invloed hebben op de immuunfunctie of gezondheid.
Hier beschrijven we een methode voor gerichte en langdurige overexpressie van CXCR4 in primaire murine B-1a cellen en de daaropvolgende adoptieoverdracht om celmigratie en functionele IgM-antilichaamproductie te visualiseren(figuur 1). Genetische manipulatie van primaire B-cellen wordt beperkt door lage transfectie-efficiëntie in vergelijking met transfectie van getransformeerde cellijnen. Aangezien getransformeerde cellijnen echter aanzienlijk kunnen afwijken van primaire cellen12,13,biedt het gebruik van primaire cellen waarschijnlijk resultaten die beter aansluiten op de normale fysiologie. Er zijn verschillende technieken beschreven voor genoverdracht in primaire murine B-cellen, waaronder retrovirale transductie, adenovirale transductie, lipofection of transporatiegebaseerde transfectie, die verschillende niveaus van efficiëntie, vergankelijkheid en impact hebben op de gezondheid van cellen13,14,15. De volgende methode gebruikt retrovirale transductie als het leverde voldoende genoverdracht efficiëntie van >30% terwijl een minimale invloed op de levensvatbaarheid van cellen. Het CXCR4-uitdrukkende retrovirus werd gegenereerd met behulp van de eerder beschreven retrovirale constructie murine stamcelvirus-interne ribosomale entry site-groene fluorescente eiwit (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, waarin de muis CXCR4 gen was sub-gekloond4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) en CXCR4-GFP retrovirale deeltjes werden gegenereerd met behulp van calciumfosfaattransfectie zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen4,14.
Succesvol getransduceerde B-1a cellen werden vervolgens intraveneus overgebracht naar lymfocyten-deficiënte Rag1-/- muizen. Zowel donor- als ontvangermuizen bevatten bovendien knock-out van het apolipoprotein E (ApoE)-gen, wat resulteert in een verhoogde OSE-accumulatie en atherosclerose, waardoor een model wordt voor in vivo B-1 celactivering en IgM-productie. Bovendien verschilden donor- en ontvangermuizen in CD45-allotype; donor B-1 cellen kwamen van CD45.1+ ApoE-/- muizen en werden overgebracht naar Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- ontvangers. Dit toegestaan differentiatie van donor CD45.1 van ontvanger CD45.2 B cellen post-overdracht zonder de noodzaak om bovendien vlek voor B-cel markers tijdens flow cytometrie analyse. De hier verstrekte resultaten tonen aan dat gerichte CXCR4 overexpressie op B-1a cellen associeert met een verhoogd vermogen van B-1a cellen om te migreren naar het beenmerg, die associeert met verhoogde plasma anti-OSE IgM. Daarnaast bieden we een methode voor de verrijking van buikvlies B-1 cellen door negatieve selectie en tonen we de eis van B-1 celactivering voor efficiënte transductie. Deze methode kan worden aangepast voor andere retrovirale constructies om het effect van eiwitoverexpressie op B-1a-celmigratie, fenotype of functie te bestuderen. Bovendien zou het gebruik van CD45.1 versus CD45.2 allotype onderscheid theoretisch overdracht naar andere immuun-voldoende murinemodellen met endogene B-cellen mogelijk kunnen maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierenprotocollen zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia.
1. Magnetische scheiding en verrijking van buikvlies B-1 cellen
- Euthanaseren een 12−14 weken oude, man, CD45.1+ApoE-/- muis met CO2.
- Maak een oppervlakkige snede in de buik met behulp van rechte chirurgische schaar en schil terug huid met behulp van gebogen schaar om de buikvlieswand bloot. Spoel de buikholte met 10 mL van 37 °C RPMI-1640 medium met behulp van een 10 mL spuit en 25 G naald. Schud de muis om cellen los te maken door de staart vast te grijpen en de muis gedurende 15-20 s grondig naar de zijkant te bewegen.
OPMERKING: Het masseren van het gespoelde buikvlies kan ook het herstel van de cel maximaliseren. - Verzamel peritoneale vloeistof met behulp van een 10 mL spuit en 25 G naald door het opstellen van vloeistof aan de rechterbenedenzijde van het buikvlies net boven het niveau van de heup, in de buurt van de darmen. Vermijd het verstoren van epidydimale vetdepots en onderliggende organen. Vermijd het trekken van vloeistof van de linkerkant van de muis als de omental vet kan gemakkelijk worden getrokken in de spuit.
- Zodra ~6−7 mL vloeistof is verzameld, af te zien in een 50 mL conische buis geplaatst op ijs. Verhoog vervolgens de muis verticaal door de buikvlieswand boven het middenrif te houden met behulp van tangen, zodat de resterende vloeistof aan de onderkant van de buikholte blijft. Maak een kleine snede in de buikvlieswand met behulp van chirurgische schaar boven de lever (zorg ervoor dat de lever niet snijden) en verzamel de resterende buikvliesvloeistof met behulp van een glazen pipet en lamp.
- Pool peritoneale washoutcellen van alle CD45.1+ApoE-/- muizen (n = 15−20) in 50 mL conische buizen, en slaan op ijs.
OPMERKING: Voor het berekenen van het aantal muizen dat nodig is: B-1a cellen omvatten 5−10% van de totale buikvliespopulatie en leveren ongeveer 2,5−5 x 105 B-1a cellen per muis in de handen van auteurs. De transductie-efficiëntie is ~30−40%, zoals hieronder weergegeven. - Tel levende cellen met behulp van een levensvatbare kleurstof zoals trypanblauw en een hemocytometer (verdun monsters 1:5 in trypanblauw en laad 10 μL in de hemocytometerkamer). Bundel cellen tot 1 x 108 cellen per buis. Centrifugecellen op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C, dan aanzuigen supernatant.
- Tot 1 x 108 cellen in 1 mL anti-CD16/CD32-antilichaam(Tabel van materialen)verdund tot 1:50 in testbuffer (1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS], 0,5% runderserumalbumin [BSA], 2 mM EDTA) om Fc-receptoren te blokkeren. Schaal indien nodig op basis van het aantal cellen. Incubeer 10 minuten op ijs bij 4 °C.
- Bereid een 2x master mix van de biotinylated antilichamen(Tabel 1) in testbuffer voor uitputting. De 2x master mix is verantwoordelijk voor het volume van de vloeistof waarin de cellen zich al bevinden bij het uitbroeden met anti-CD16/CD32. Als cellen bijvoorbeeld uitbroeden in 500 μL verdunde anti-CD16/CD32, voeg vervolgens 500 μL 2x mastermix toe met 10 μL biotinylated Ter119, Gr-1, CD23 en NK1.1 antilichamen en 25 μL biotinylated F4/80-antilichaam om de in tabel 1vermelde eindconcentraties te bereiken. Voeg 2x master mix toe aan cellen en vlek gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Was cellen met 5 mL testbuffer en centrifuge bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en spoel supernatant aan.
- Resuspend en incubaat cellen met anti-biotine microbeads (Tabel van materialen) verdund in testbuffer volgens de concentratie en het protocol aanbevolen door de fabrikant.
- Was met 5 mL testbuffer en centrifuge op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aanzuigen supernatant en resuspend tot 1 x 108 cellen in 500 μL van testbuffer.
- Eerste magnetische selectiekolommen(Tabel van materialen) met 3 mL testbuffer. Breng cellen over op geprimede magnetische selectiekolommen en verzamel het eluent met verrijkte B-1 cellen in een 15 mL conische buis op ijs. Was de magnetische selectiekolom met extra testbuffer tot het totale verzamelde volume 10 mL is.
OPMERKING: Een aliquot van de voorgezuiverde en post-gezuiverde celfracties moet afzonderlijk worden geanalyseerd door stroomcytometrie voor zuiveringsefficiëntie door kleuring voor CD19+ B-cellen, F480+ macrofagen en CD5+ T-cellen zoals weergegeven in figuur 2. - Tel de post-gezuiverde celfractie (het eluent dat verrijkte B-1 cellen bevat) door levende cellen te tellen als in stap 1.6, en resuspend op 1 x 106 cellen/mL in B-celkweekmedium (RPMI-1640, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum [FBS], 10 mM HEPES, 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat, 50 μg/mL gentamicine, 55 μM β-mercaptoethanol).
2. Peritoneale B-1 celstimulatie
- Gesplitste gepoolde cellen voor de twee getransduceerde omstandigheden (Ctl-GFP en CXCR4-GFP), terwijl ze ten minste 10 x 106 cellen opzij zetten en platingen voor een niet-getransduceerde besturing.
- Plaat tot 150 μL (150.000 cellen) per goed in 96-goed ronde-bodemplaten.
- Voeg 100 nM TLR9 agonist ODN1668 toe aan alle putten om celproliferatie te stimuleren.
- Incubeer voor 16-18 uur bij 37 °C, 5% CO2.
3. Retrovirale transductie van buikvlies B-cellen
- Cenerful-GFP (MigR1) en CXCR4-GFP retrovirale deeltjes genereren met behulp van calciumfosfaattransfectie zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen14.
OPMERKING: Dit zal enkele dagen duren, dus bereid en titer retrovirale voorraden en sla aliquots op -80 °C voorafgaand aan het starten van dit protocol. - Ontdooi retrovirusvoorraden op ijs. Gebruik onmiddellijk en niet opnieuw bevriezen als virus titer aanzienlijk vermindert tijdens vries-dooi cycli. Voeg Ctl-GFP of CXCR4-GFP retrovirale supernatants toe bij 20:1 veelheid van infectie (MOI) aan cellen, in aanwezigheid van 8 μg/mL polybrene en verse β-mercaptoethanol bij 55 μM eindconcentratie. Voeg geen virale voorraden toe aan de cellen die zijn gereserveerd voor de niet-getransduceerde controle.
- Voer spinfectie uit door middel van centrifugingplaten op 800 x g gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeerplaten met retrovirus bij 37 °C, 5% CO2 voor nog eens 3 uur.
- Oogst en replate cellen in vers B-celmedium en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
4. Celsorde van getransduceerde buikvlies B-1acellen
- Oogst gekweekte cellen en verloop in drie afzonderlijke 50 mL conische buizen voor elke aandoening: niet-getransduceerd, Ctl-GFP getransduceerd, en CXCR4-GFP getransduceerd.
- Tel levende cellen zoals in stap 1.6, dan centrifuge op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en aanzuigen supernatant.
- Resuspend cellen bij 100.000 cellen/μL in sort buffer (PBS + 1% BSA) met 1:50 anti-CD16/CD32 antilichaam (Tabel van materialen) om Fc receptoren te blokkeren. Incubeer 10 minuten op ijs bij 4 °C.
- Aliquot cellen voor compensatie controles (~ 30.000 cellen per compensatie controle): voor niet-bevlekte en enkele vlek controles aliquot van niet-getransduceerde monster en voor GFP enkele vlek controle aliquot van getransduceerde monsters.
OPMERKING: Commercieel beschikbare compensatiekralen kunnen ook worden gebruikt voor besturingselementen met één vlek als het niet-getransduceerde celnummer laag is. - Bereid een 2x antilichaam master mix met de fluorofofoforeren-geconjugeerde antilichamen in sort buffer (Tabel 1). Voeg 2x mastermix toe aan niet-getransduceerde, CTL-GFP-getransduceerde en CXCR4-GFP-getransduceerde monsters. Voeg individuele antilichamen toe aan enkele vlekcontroles. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: De 2x master mix is verantwoordelijk voor het volume vloeistof waarin de cellen zich al bevinden bij het uitbroeden met anti-CD16/CD32, zoals in stap 1.8. Een aliquot van cellen van elke voorwaarde kan afzonderlijk worden gekleurd voor CXCR4 om CXCR4 overexpressie te bevestigen. - Was monsters met 1 mL soortbuffer en zeef door 70 μm filters in polypropyleenbuizen.
- Centrifuge bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en aanzuigen supernatant. Resuspend samples at 50,000 cells/μL in sort buffer.
- Voordat de celsorlingsing gelabeld fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuizen (FACS) voorslepen met 1 mL inzamelmedium (RPMI-1640, 20% warmte-geïnactiveerde FBS, 10 mM HEPES, 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat, 50 μg/mL gentamicine, 55 μM β-mercaptoethanol) voor elke te sorteren populatie.
- Voorafgaand aan het uitvoeren van monsters op de celsorteerder voeg 2x DAPI (bereid als 1:5000 verdunning in sorteerbuffer) toe voor dode celdiscriminatie.
- Sorteer GFP+ B-1a cellen in FACS buizen met collectiemedium als DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ cellen uit de CTL-GFP en CXCR4-GFP samples. Gebruik het niet-getransduceerde monster om de GFP+ poort in te stellen en dapi- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ niet-getransduceerde B-1a cellen te sorteren.
OPMERKING: Als alternatief kunnen niet-getransduceerde cellen ook worden gesorteerd uit de CTL-GFP- en CXCR4-GFP-monsters door B-1a-cellen afzonderlijk in de GFP-fractie te gating. Getransduceerde of niet-getransduceerde B-1b cellen kunnen ook worden gesorteerd met behulp van dit soort strategie als DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- cellen.
5. Adoptieoverdracht
- Na het sorteren van cellen centrifugeren centrifugecellen op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en supernatant voorzichtig aanzuigen.
- Resuspend cellen in koude steriele 1x PBS bij 1.000 cellen/μL.
- Verdoven mannelijke Rag1-/- ApoE-/- muizen die isofluraan gebruiken en injecteren 100 μL (100.000 cellen) per muis via intraveneuze retro-orbitale of staartaderinjectie met behulp van een ultrafijne insulinespuit. Injecteer een paar muizen met 1x PBS als controle.
6. Kwantificering van donorcellen en plasma IgM
- Op het gewenste moment post-adoptieve overdracht, analyseren overgedragen cellen in de ontvanger muizen door beenmerg en milt weefsel oogst4 en flow cytometrie. Kwantificeer de lokalisatie van donorcellen en CXCR4 overexpressie door vlekken op CD45.1, CD45.2 en CXCR4 en analyseer de resultaten van de stroomcytometrie met behulp van een software zoals Flowjo.
OPMERKING: Zie tabel 1 voor antilichamen die in deze stap worden gebruikt. Zorg ervoor dat u geen antilichaamconjugaat gebruikt die fluoresceert in het FITC-kanaal, omdat GFP aanwezig zal zijn op getransduceerde donorcellen. - Isoleer plasma door 10 μL 0,5 M EDTA toe te voegen aan volbloed dat wordt verzameld via hartpunctie op het moment van het offeren van dieren. Centrifuge volbloed bij 7.000 x g en aliquot plasma in afzonderlijke 1,5 mL centrifugebuizen. Bewaar op -80 °C tot het uitvoeren van analyse van gedecretde factoren zoals IgM door ELISA4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van het protocol is te vinden in figuur 1. Figuur 2 toont verrijking van buikvlies B-1a cellen na magnetische uitputting van andere peritoneale celtypen. Levende singlet cellen in de post-uitputting fractie hebben een groter percentage van CD19 + B cellen in vergelijking met F4/80+ macrofagen, gebrek aan CD5hi CD19- T cellen, en bevatten een verhoogde frequentie van CD19+ CD5mid B-1a cellen in vergelijking met de pre-uitputting fractie. Figuur 3 toont de eis van B-celactivering voor succesvolle retrovirale B-celtransductie, en een dosisafhankelijke toename van de frequentie van succesvol getransduceerde GFP+ B-celsubsets met toenemende virus-MOI met behulp van Ctl-GFP retrovirus. Tabel 2 geeft een verhoogde transductie-efficiëntie met behulp van 96 goed ronde bodem platen in vergelijking met 24-well of 6-well platen. Figuur 4 toont succesvolle CXCR4 overexpressie (>40%) b-1-cellen en verhoogde B-1-celmigratie naar CXCL12 in vitro na transductie met CXCR4-GFP retrovirus, zonder een significante impact op de levensvatbaarheid van de B-cel. Figuur 5 toont de gating strategie voor het sorteren van live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a cellen uit een niet-getransduceerde aandoening (GFP-), of de twee getransduceerde voorwaarden (GFP+). Houd er rekening mee dat CD23+ B-2-cellen niet aanwezig zijn in deze monsters als gevolg van voorafgaande magnetische uitputting. Transduced live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b cellen kunnen ook worden gesorteerd met behulp van deze gating strategie. Figuur 6-beeldschermen hebben cd45.1+ donorcellen en aanhoudende CXCR4-overexpressie op donorcellen die 17 weken na de celoverdracht zijn teruggevonden uit beenmerg en milt van CD45.2-ontvangende muizen, overgedragen. Tabel 3 geeft een positief verband weer tussen CXCR4-expressie en donorcellokalisatie met het beenmerg, maar niet milt. Tabel 4 toont een positief verband tussen donorcelnummer in het beenmerg en de plasmahoeveelheid anti-MDA-LDL IgM.
Figuur 1: Schematisch experimenteel ontwerp voor retrovirale transductie en adoptieoverdracht. Peritoneale cellen geïsoleerd van CD45.1 allotype muizen worden verrijkt voor B-1 cellen door magnetische uitputting met behulp van biotinylated antilichamen en anti-biotine microbeads. Verrijkte peritoneale B-1 cellen worden geactiveerd om celproliferatie te stimuleren met TLR9 agonist CpG oligodeoxynucleotide. Geactiveerde cellen worden getransduceerd met Ctl-GFP of CXCR4-GFP retrovirale deeltjes. Succesvolle getransduceerde GFP+ B-1a cellen worden gesorteerd met FACS en adoptief overgebracht naar CD45.2 allotype host muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verrijking voor buikvlies B-1 cellen. Representatieve stroomcytometriepercelen van buikvliescellen pre-magnetische verrijking (boven) en post-magnetische verrijking (onder) voor CD19+ B cellen. CD19+ F4/80- cellen zijn B-cellen, CD19- F4/80+ cellen zijn macrofagen, CD19+ CD5middencellen zijn B-1a cellen en CD19- CD5hi cellen zijn T-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Retrovirale transductie vereist B-celactivering. Peritoneale B-cellen werden omgezet met Ctl-GFP retrovirus op 5:1, 10:1, of 25:1 MOI of links niet-getransduced in de aanwezigheid of afwezigheid van TLR9 agonist CpG ODN1668. De frequentie van succesvol getransduceerde GFP+ B2, B1, B-1a of B-1b cellen werd gekwantificeerd door flow cytometrie 18 uur na transductie. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Bevestiging van CXCR4 overexpressie en verhoogde B-1a migratie in vitro. Peritoneale B-cellen van ApoE-/- muizen met B-celspecifieke tekorten aan CXCR4 werden geïsoleerd en getransduceerd met Ctl-GFP of CXCR4-GFP retrovirus, of gekweekt zonder transductie. aa) Representatieve stroompercelen cxcr4- en GFP-expressie op B-1-cellen van niet-getransduceerde (linksboven), Ctl-GFP-getransduceerde (linksonder) of CXCR4-GFP-omzetting (rechtsonder). FMO-CXCR4 (rechtsboven) gebruikt om CXCR4 positieve poort in te stellen. b) Kwantificering van de MFI van CXCR4 op GFP+ B-1 cellen uit niet-getransduceerde (n = 1), Ctl-GFP-omzetting (n = 2) of CXCR4-GFP-getransduceerde (n = 2) voorwaarden. c) Frequentie van niet-getransduceerde (n = 1), Ctl-GFP-transduced (n = 2) of CXCR4-GFP-transduced (n = 2) B-1-cellen die naar CXCL12 zijn gemigreerd als percentage van het totale aantal B-1-cellen geladen in transwell. d) representatieve gatingstrategie voor kwantificering van levensvatbare cellen binnen de met succes getransduceerde B-celpopulatie (CD19+GFP+). ee) Frequentie van levende B-cellen na transductie met Ctl-GFP (n = 2) of CXCR4-GFP retrovirus (n = 2). Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige publicatie4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Gating-strategie voor het sorteren van getransduceerde GFP+ B-1a cellen. Representatieve stroomcytometriepercelen voor het sorteren van GFP+ of GFP- B-1a-cellen uit een niet-getransduceerd monster (boven), een Ctl-GFP-getransduceerd monster (midden) en een CXCR4-GFP-getransduceerd monster (onder). B-1a cellen gedefinieerd als live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Kwantificering van overgedragen donorcellen. Representatieve stroomcytometriepercelen met CD45.1+ CD45.2- donorcellen van één PBS-controle (boven), een Ctl-GFP+ B-1a-celontvanger (midden) en één CXCR4-GFP+ B-1a-celontvanger (onder), en latere analyse van CXCR4-expressie op donorcellen in beenmerg(a),of milt (b). Kwantificering van CXCR4-expressie (gemiddelde fluorescentieintensiteit, MFI) op donorcellen uit beenmerg (c) of milt (d). Kwantificering van het aantal donorcellen dat is teruggevonden in beenmerg (e) of milt (f) van de ontvangers. *P < 0,05 of **P < 0,01 door Mann-Whitney test. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige publicatie4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Protocolstap | Antilichaam | Definitieve concentratie |
| Stap 1.8 | Ter119 biotine | 1 μL per 100 μL eindvolume |
| CD3e biotine | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| Gr-1 biotine | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| CD23 biotine | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| NK1.1 biotine | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| F4/80 biotine | 2,5 μL per 100 μL eindvolume | |
| Antilichaam | Definitieve concentratie | |
| Stap 4.5 | CD5 PE | 1 μL per 100 μL eindvolume |
| IgM PECF594 | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| CD23 PECy7 | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| B220 APC | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| CD19 APCef780 | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| Antilichaam | Definitieve concentratie | |
| Stap 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 μL per 100 μL eindvolume |
| CD45.2 BV421 | 1 μL per 100 μL eindvolume | |
| CXCR4 APC | 2,5 μL per 100 μL eindvolume |
Tabel 1: Antilichamen en hun uiteindelijke concentraties die in het protocol worden gebruikt.
| Voorwaarde | %GFP+ van de totale bevolking | %GFP+ cd19+ B-cellen |
| 96-goed ronde bodemplaat | 30.9% | 52.7% |
| 24-well plaat | 8.4% | 21.2% |
| 6-well plaat | 16.2% | 27.3% |
Tabel 2: Plaatoptimalisatie. Frequentie van met succes getransduceerde totale GFP+ cellen of GFP+ CD19+ B cellen na transductie van 6 x 106 verrijkte peritoneale B-1 cellen in een 96-well round-bottom plaat (40 putten bij 150.000 cellen per put), een 24-well plaat (6 putten bij 1 x 106 cellen per put), of een 6-well plaat (3 putten bij 2 x 106 cellen per put) bij een 20:1 MOI met Ctl-GFP retrovirus.
| Variabele | MFI van CXCR4 op donor B-1a cellen | |
| r-waarde | p-waarde | |
| # van donor B-1a cellen in beenmerg | 0.71 | *0.014 |
| # van donor B-1a cellen in milt | 0.43 | 0.18 |
Tabel 3: Associatie tussen CXCR4-expressie op donorcellen en lokalisatie van donorcellen. De gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van CXCR4 op donor B-1a cellen gecorreleerd met het aantal donor B-1a cellen in beenmerg of milt van Rag1-/- ApoE-/- ontvangende muizen 17 weken na adoptieve overdracht. Gegevens gepresenteerd als correlatiecoëfficiënt (r) en statistische significantie (p). Deze tabel is gewijzigd ten opzichte van onze vorige publicatie4.
| Variabele | # van donorcellen in beenmerg | |
| r-waarde | p-waarde | |
| Plasma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plasma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plasma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tabel 4: Associatie tussen lokalisatie van donorcellen en plasmahoeveelheid anti-OSE IgM. Het aantal donor B-1a cellen in beenmerg van Rag1-/- ApoE-/- ontvangende muizen 17 weken na adoptieve overdracht gecorreleerd met circulerende hoeveelheid anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM, of anti-1,3-dextran IgM. Gegevens gepresenteerd als correlatiecoëfficiënt (r) en statistische significantie (p). Deze tabel is gewijzigd ten opzichte van onze vorige publicatie4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier geboden methode maakt stabiele en relatief efficiënte primaire B-1a-celgenlevering, in vivo adoptieoverdracht en identificatie en lokalisatie van geïnjecteerde cellen mogelijk. Cellen konden worden gedetecteerd 17 weken na de cel overdracht en behouden verhoogde CXCR4 expressie. Retrovirus-gemedieerde levering leverde 30-40% transductie-efficiëntie van primaire murine B-1a cellen met minimale impact op de levensvatbaarheid van de cel in onze handen(figuur 4e). Dit is in lijn met de resultaten van een eerdere studie van Moghimi en collega's die technieken voor genoverdracht vergeleken met primaire murine B-cellen, waaronder retrovirale infectie, adenovirale infectie, nucleofection, of lipofectamine15. We stelden echter vast dat het bereik van CXCR4-overexpressie aanzienlijk varieerde binnen ontvangers die CXCR4-GFP-getransduceerde B-1a-cellen kregen (figuur 6c,d). Daarom hebben we associatieve analyse gebruikt om aan te tonen dat verhoogde CXCR4-expressie gecorreleerd is met verhoogde B-1a-migratie en lokalisatie naar het beenmerg, wat gepaard gaat met een verhoogd plasma IgM(tabel 3 en tabel 4).
Beperkingen van deze methode omvatten het grote aantal muizen dat nodig is om voldoende aantallen succesvol getransduceerde B-1a-cellen te krijgen, en de variabiliteit in transductie-efficiëntie van het ene experiment naar het andere. De transductie-efficiëntie wordt verbeterd door hogere titers van virale voorraden, die ten minste 2 x 107 besmettelijke deeltjes/mL14moeten zijn . Het gebruik van oudere muizen, 12-16 weken, kan ook de peritoneale B-1 celopbrengst verbeteren, omdat peritoneale B-1 celnummers toenemen met de leeftijdvan 17.
Het is ook belangrijk op te merken dat de hoeveelheid IgM afgescheiden door getransduceerde B-1a cellen post-adoptieve overdracht was ~ 5-voudige minder dan de hoeveelheid afgescheiden door niet-getransduceerde B-1a cellen na adoptie-overdracht in dezelfde Rag1-/- ApoE-/- model (gegevens niet getoond). Dit kan te wijten zijn aan de eis van B-1 celactivering met TLR9-agonist vóór retrovirale transductie (figuur 3), die de secundaire activering en de productie van IgM kan beperken in reactie op OSE in vivo post-adoptieve overdracht. Daarom kunnen alternatieve genoverdrachtstechnieken die geen voorafgaande B-1a-celactivering vereisen, zoals lentivirale levering18,19 , nuttig zijn voor studies die robuuste IgM-productie vereisen door overgedragenB-1a-cellen. Als alternatief kunnen wijzigingen in dit protocol die activeringsstrategieën omvatten om proliferatie te veroorzaken, maar niet B-1a-differentiatie in IgM-afscheidende cellen ook voldoende zijn voor een succesvolle retrovirale transductie zonder dat dit gevolgen heeft voor secundaire B-celactivering. IL-5 is een belangrijk cytokine dat bemiddelt op de proliferatie en overleving van B-1a-cellen en kan een effectief alternatief zijn voor TLR9-stimulatie20,21.
Eerdere studies hebben gebruikt milt B-cellen geïsoleerd door middel van positieve of negatieve selectie strategieën met behulp van antilichamen tegen B220 (B-cel marker) of Thy1.2 (T-cel marker)13,14. B220+ milt B-cellen zijn echter een heterogene populatie die B-1- en B-2-celsubsets bevat. Bovendien is de B-1 celfrequentie binnen de totale milt-cd19+ B-celpopulatie laag (1−2%). Deze methode maakt daarentegen gebruik van de buikholte als B-1-celbron voor transductie, omdat B-1-cellen 60−70% van de totale CD19+ B-cellen in dit compartiment22omvatten en CD23 gebruikt als markering voor het afbreken van buikvlies B-2-cellen. Latere sortering van met succes getransduceerde B-1a cellen op basis van GFP, CD19, B220, CD23, IgM en CD5 expressie maakt de overdracht van een meer specifiek gedefinieerd celtype verder mogelijk. De magnetische uitputtingsstrategie om peritoneale B-1 cellen effectief uitgeputte T-cellen te verrijken, en verminderde F4/80 peritoneale macrofaagfrequentie met ~ 50% in onze handen(figuur 2), hoewel verdere optimalisatie en probleemoplossing van deze kritieke stap de transduction-efficiëntie zou kunnen verhogen. Bijvoorbeeld, met behulp van een hogere concentratie van biotinylated F4/80 antilichaam voor een betere macrofaag uitputting zou verder kunnen verhogen B-1a cel transductie efficiëntie, omdat er minder "off-target" retrovirale transductie van andere celtypes zou zijn. Het gebruik van 96-well ronde bodem platen voor transductie, in plaats van platte bodem 24-well of 6-well platen bovendien aanzienlijk verbeterd transductie efficiëntie (Tabel 2), maar verhoogt de behandeling en pipetting tijd.
Over het algemeen biedt deze methode een nuttige proof-of-concept benadering om te bepalen of gerichte genlevering aan B-1a-cellen b-1a-cellokalisatie en functionele IgM-productie kan veranderen. Toekomstige toepassingen van deze techniek kunnen onder meer bestaan uit de levering van retrovirale constructies die gericht zijn op andere eiwitten, en adoptieoverdracht om het effect ervan op donor- of gastheercelprocessen in vivo te bepalen, waaronder celoverleving, migratie, proliferatie of functie. Adoptieoverdracht naar immunocompetent hosts, in plaats van lymfocyten-deficiënte gastheren, zou ook mogelijk zijn met deze techniek, omdat donorcellen (CD45.1+ GFP+) kunnen worden onderscheiden van hostcellen (CD45.2+ GFP-). Gericht op andere chemokine receptoren met behulp van deze methode kan verder ondersteunen de hypothese dat gericht op B-1a cel migratie naar niches tolerant van hoge IgM productie effectief kan stimuleren niveaus van beschermende IgM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 van P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) en R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye werd ondersteund door American Heart Association Pre-doctorale fellowship 16PRE30300002 en 5T32AI007496-20. Wij danken Joanne Lannigan, Mike Solga, en Claude Chew van de Universiteit van Virginia Flow Cytometrie Core voor hun uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
