Summary
Her beskriver vi en metode for retroviral overuttrykk og adoptivoverføring av murine B-1a celler for å undersøke in vivo B-1a cellemigrasjon og lokalisering. Denne protokollen kan utvides for ulike nedstrøms funksjonelle analyser, inkludert kvantifisering av donor B-1a celle lokalisering eller analyse av donor celle-avledede utskillede faktorer etter adoptivoverføring.
Abstract
Ettersom cellefunksjonen påvirkes av nisjespesifikke faktorer i det cellulære mikromiljøet, kan metoder for å dissekere cellelokalisering og migrasjon gi ytterligere innsikt i cellefunksjonen. B-1a celler er en unik B celle undergruppe hos mus som produserer beskyttende naturlige IgM antistoffer mot oksidasjonsspesifikke epitoper som oppstår under helse og sykdom. B-1a celle IgM produksjon varierer avhengig av B-1a celle plassering, og derfor blir det nyttig fra et terapeutisk synspunkt for å målrette B-1a lokalisering til nisjer som støtter høy antistoffproduksjon. Her beskriver vi en metode for å målrette B-1a cellemigrasjon til benmargen ved retroviral-mediert overuttrykk av C-X-C motiv chemokinreseptor 4 (CXCR4). Geninduksjon i primære murine B-celler kan være utfordrende og gir vanligvis lav transfeksjonseffektivitet på 10-20% avhengig av teknikk. Her viser vi at retroviral transduksjon av primære murine B-1a celler resulterer i 30-40% transduksjon effektivitet. Denne metoden benytter adoptivcelleoverføring av transduserte B-1a-celler til B-cellemangeldende mottakermus, slik at donor B-1a cellemigrasjon og lokalisering kan visualiseres. Denne protokollen kan endres for andre retrovirale konstruksjoner og kan brukes i ulike funksjonelle analyser etter adoptivoverføring, inkludert analyse av donorcelle eller vertscellefenotype og funksjon, eller analyse av løselige faktorer utskilt etter B-1a celleoverføring. Bruken av distinkte donor- og mottakermus differensiert av CD45.1 og CD45.2 allotype og tilstedeværelsen av en GFP-reporter i retroviral plasmid kan også muliggjøre deteksjon av donorceller i andre, immunforsynte musemodeller som inneholder endogene B-cellepopulasjoner.
Introduction
Nyere studier har vist betydelig immuncelle, og spesielt B celle, fenotypisk og funksjonell heterogenitet avhengig av celle lokalisering1,2,3,4,5. B-1a celler er en slik populasjon med heterogen kapasitet til å produsere beskyttende IgM antistoffer; benmarg B-1a celler utskiller IgM konstitutivt og bidra betydelig til plasma IgM titers6,mens peritoneal B-1a celler har lavt nivå IgM sekresjon på homeostase og i stedet kan aktiveres gjennom medfødt toll-lignende reseptor (TLR) eller cytokin-mediert signalering til raskt proliferate, migrere og skille ut IgM7,8,9,10. B-1a celle IgM antistoffer gjenkjenne oksidasjon-spesifikke epitoper (OSE) som er tilstede på patogener, apoptotiske celler, og oksidert LDL, og IgM binding til OSE kan forhindre inflammatorisk nedstrøms signalering i sykdommer som aterosklerose11. Derfor kan strategier for å øke IgM-produksjonen via økende peritoneal B-1a cellemigrasjon til steder som benmargen være terapeutisk nyttig. Det er imidlertid viktig at slike strategier målrettes og celletypespesifikke, da off-target effekter kan påvirke immunforsvaret eller helsen negativt.
Her beskriver vi en metode for målrettet og langsiktig overuttrykk av CXCR4 i primære murine B-1a celler og påfølgende adoptivoverføring for å visualisere cellemigrasjon og funksjonell IgM antistoffproduksjon (Figur 1). Genetisk manipulering av primære B-celler er begrenset av lav transfeksjoneffektivitet sammenlignet med transfeksjon av transformerte cellelinjer. Men som forvandlede cellelinjer kan betydelig avvike fra primære celler12,13, bruk av primære celler er sannsynlig å gi resultater som tettere justere til normal fysiologi. Flere teknikker har blitt beskrevet for genoverføring i primære murine B-celler, inkludert retroviral transduksjon, adenoviral transduction, fettspirasjon, eller elektroporasjonsbasert transfeksjon, som har varierende nivåer av effektivitet, transience, og innvirkning på cellehelse13,14,15. Følgende metode benyttet retroviral transduksjon da det ga tilstrekkelig genoverføringseffektivitet på > 30% mens det minimalt påvirket celle levedyktigheten. CXCR4-uttrykkende retrovirus ble generert ved hjelp av det tidligere beskrevne retrovirale konstruksjonen murine stamcellevirus-intern ribosomalt oppføring sted-grønn fluorescerende protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, der musen CXCR4 genet ble sub-klonet4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) og CXCR4-GFP retrovirale partikler ble generert ved hjelp av kalsiumfosfattransfeksjon som beskrevet i tidligere publiserte protokoller4,,14.
Vellykket transdusert B-1a celler ble deretter intravenøst overført til lymfocytter-mangelfull Rag1-/- mus. Både donor- og mottakermus inneholdt i tillegg knockout av apolipoprotein E (ApoE)-genet, noe som resulterer i økt OSE-akkumulering og aterosklerose, og gir dermed en modell for in vivo B-1-celleaktivering og IgM-produksjon. Videre var donor- og mottakermus forskjellig i CD45 allotype; donor B-1-celler kom fra CD45.1+ ApoE-/- mus og ble overført til Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- mottakere. Dette tillot differensiering av donor CD45.1 fra mottaker CD45.2 B-celler etter overføring uten å måtte i tillegg beise for B-cellemarkører under flowcytometrianalyse. Resultatene som er gitt her viser at målrettet CXCR4 overuttrykk på B-1a celler forbinder med økt evne til B-1a celler til å migrere til benmargen, som forbinder med økt plasma anti-OSE IgM. Vi gir i tillegg en metode for berikelse av peritoneale B-1-celler gjennom negativt utvalg og demonstrerer kravet om B-1-celleaktivering for effektiv transduksjon. Denne metoden kan tilpasses andre retrovirale konstruksjoner for å studere effekten av proteinoveruttrykk på B-1a cellemigrasjon, fenotype eller funksjon. Videre kan bruk av CD45.1 versus CD45.2 allotype skillet teoretisk tillate overføring til andre immunforsynte murinmodeller som inneholder endogene B-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Magnetisk separasjon og berikelse av peritoneale B-1-celler
- Euthanize en 12-14 uker gammel, mann, CD45.1+ApoE-/- mus ved hjelp av CO2.
- Lag et overfladisk kutt i magen ved hjelp av rett kirurgisk saks og skrell tilbake huden ved hjelp av buet saks for å eksponere bukveggen. Skyll bukhulen med 10 ml 37 °C RPMI-1640 medium med en 10 ml sprøyte og 25 G kanyle. Rist musen for å løsne celler ved å gripe halen og flytte musen side til side grundig i 15-20 s.
MERK: Masserer lavaged peritoneum kan også maksimere celle utvinning. - Samle peritonealvæske ved hjelp av en 10 ml sprøyte og 25 G nål ved å trekke opp væske på nedre høyre side av bukhinnen like over hoftenivået, nær tarmene. Unngå å forstyrre epidydelalt fettdepoter og underliggende organer. Unngå å trekke væske fra musens venstre side, da omentalfettet lett kan trekkes inn i sprøyten.
- Når ~6−7 ml væske samles, må det føres ut i et konisk rør på 50 ml som er plassert på is. Løft deretter musen vertikalt ved å holde bukveggen over membranen ved hjelp av tang, slik at eventuell gjenværende væske forblir på bunnen av bukhulen. Lag et lite kutt i bukveggen ved hjelp av kirurgisk saks over leveren (sørg for ikke å kutte leveren) og samle eventuelle gjenværende peritonealvæske ved hjelp av en glasspipet og pære.
- Pool peritoneal washout celler fra alle CD45.1+ApoE-/- mus (n = 15-20) i 50 ml koniske rør, og lagre på is.
MERK: For beregning av antall mus som trengs: B-1a-celler utgjør 5–10 % av den totale peritoneale populasjonen og gir omtrent 2,5–5 x 105 B-1a-celler per mus i forfatternes hender. Transduksjonseffektivitet er ~30−40%, som vist nedenfor. - Tell levende celler ved hjelp av en levedyktighet fargestoff som trypan blå og et hemocytometer (fortynne prøver 1:5 i trypan blå og laste 10 μL inn i hemocytometerkammeret). Pool celler på opptil 1 x 108 celler per rør. Sentrifugeceller ved 400 x g i 5 min ved 4 °C, deretter aspirere supernatant.
- Resuspend opp til 1 x 108 celler i 1 ml anti-CD16/CD32 antistoff (Tabell av materialer) fortynnet 1:50 i analysebuffer (1x fosfat bufret saltvann [PBS], 0,5% storfe serum albumin [BSA], 2 mM EDTA) for å blokkere FC reseptor. Skaler etter behov basert på celletelling. Inkuber på is i 10 min ved 4 °C.
- Forbered en 2x master blanding av biotinylerte antistoffer (tabell 1) i analysebuffer for uttømming. 2x master mix står for volumet av væsken cellene allerede er i når de inkuberer med anti-CD16/CD32. Hvis for eksempel cellene inkuberer i 500 μL fortynnet anti-CD16/CD32, deretter tilsett 500 μL av 2x master mix som inneholder 10 μL biotinylert Ter119, Gr-1, CD23 og NK1.1 antistoffer, og 25 μL biotinylert F4/80 antistoff for å oppnå de endelige konsentrasjonene gitt i tabell 1. Tilsett 2x master blanding til celler og flekk i 20 min ved 4 °C.
- Vask celler med 5 ml analysebuffer og sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirer supernatant.
- Resuspend og inkubere celler med anti-biotin mikroperler (Tabell over materialer) fortynnet i analysebuffer i henhold til konsentrasjon og protokoll anbefalt av produsenten.
- Vask med 5 ml analysebuffer og sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirer supernatant og resuspend opptil 1 x 108 celler i 500 μL analysebuffer.
- Prime magnetiske utvalgskolonner (Tabell over materialer) med 3 ml analysebuffer. Overfør celler til primet magnetiske utvalgskolonner og samle eluent som inneholder berikede B-1-celler i et 15 ml konisk rør på is. Vask den magnetiske valgkolonnen med ekstra analysebuffer til det totale volumet som samles inn er 10 ml.
MERK: Et aliquot av de forhåndsrensede og postrensede cellefraksjonene bør analyseres separat av strømningscytometri for rensingseffektivitet ved farging for CD19+ B-celler, F480+ makrofager og CD5+ T-celler som vist i figur 2. - Telle den postrensede cellefraksjonen (eluent som inneholder berikede B-1-celler) ved å telle levende celler som i trinn 1.6, og resuspend ved 1 x10 6 celler / ml i B cellekultur medium (RPMI-1640, 10% varmeinaktiverte føtale storfe serum [FBS], 10 mM HEPES, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyuvat, 50 μg/ml gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol).
2. Peritoneal B-1 cellestimulering
- Split pooled celler for de to transduced forhold (Ctl-GFP og CXCR4-GFP), mens du setter til side og plating minst 10 x 106 celler for en ikke-transdusert kontroll.
- Plate opp til 150 μL (150.000 celler) per godt i 96-godt runde bunnplater.
- Tilsett 100 nM TLR9 agonist ODN1668 til alle brønner for å stimulere cellespredning.
- Inkuber i 16-18 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
3. Retroviral transduksjon av peritoneale B-celler
- Generer Ctl-GFP (MigR1) og CXCR4-GFP retrovirale partikler ved hjelp av kalsiumfosfattransfeksjon som beskrevet i tidligere publiserte protokoller14.
MERK: Dette vil ta flere dager, så forberede og titer retrovirale aksjer og lagre aliquots ved -80 °C før du starter denne protokollen. - Tin retroviruslagre på is. Bruk umiddelbart og ikke fryses på nytt, da virustitre betydelig avtar under fryse-tine sykluser. Tilsett Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirale supernaturtegn ved 20:1 multiplisitet av infeksjon (MOI) til celler, i nærvær av 8 μg/ml polyøfen og frisk β-mercaptoethanol ved 55 μM endelig konsentrasjon. Ikke legg til virale aksjer til cellene satt til side for ikke-transdusert kontroll.
- Utfør spinfeksjon ved sentrifuging plater på 800 x g i 90 min ved romtemperatur.
- Inkuber plater med retrovirus ved 37 °C, 5 % CO2 i ytterligere 3 timer.
- Høste og replate celler i frisk B celle medium og inkubere ved 37 ° C, 5% CO2 over natten.
4. Cellersortering av transdukerte peritoneale B-1a-celler
- Høstkalde celler og tre i tre separate 50 ml koniske rør for hver tilstand: ikke-transdusert, Ctl-GFP transdusert og CXCR4-GFP transdusert.
- Tell levende celler som i trinn 1.6, deretter sentrifuger ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirer supernatant.
- Resuspendceller ved 100 000 celler/μL i sorteringsbuffer (PBS + 1% BSA) som inneholder 1:50 anti-CD16/CD32 antistoff (Tabell over materialer) for å blokkere Fc reseptorer. Inkuber på is i 10 min ved 4 °C.
- Aliquot-celler for kompensasjonskontroller (~30 000 celler per kompensasjonskontroll): for ikke-oppnådde og enkeltflekkkontroller aliquot fra ikke-transdusert prøve og for GFP enkelt flekkkontroll aliquot fra transduserte prøver.
MERK: Kommersielt tilgjengelige kompensasjonsperler kan alternativt brukes til enkeltflekkkontroller hvis ikke-transdusert cellenummer er lavt. - Forbered en 2x antistoff master blanding som inneholder fluorophore-konjugert antistoffer i sort buffer (Tabell 1). Tilsett 2x hovedmiks i ikke-transdusert, CTL-GFP transdusert og CXCR4-GFP transdusert prøver. Legg til individuelle antistoffer i enkeltflekkkontroller. Inkuber i 20 min ved 4 °C i mørket.
MERK: 2x master mix står for volumet av væske cellene er allerede i når inkubering med anti-CD16/CD32, som i trinn 1.8. Et aliquot av celler fra hver tilstand kan separat farges for CXCR4 for å bekrefte CXCR4-overuttrykk. - Vask prøver med 1 ml sort buffer og belastning gjennom 70 μm filtre i polypropylenrør.
- Sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirer supernatant. Resuspend prøver på 50.000 celler / μL i sorteringsbuffer.
- Før cellesortering klargjør merkede fluorescensaktiverte cellesorteringsrør (FACS) som inneholder 1 ml oppsamlingsmedium (RPMI-1640, 20 % varmeinaktivert FBS, 10 mM HEPES, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyuvat, 50 μg/ml gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol) for hver populasjon som skal sorteres.
- Før du kjører prøver på cellesortering legge 2x DAPI (klargjort som 1:5000 fortynning i sortering buffer) for død celle diskriminering.
- Sorter GFP+ B-1a-celler i FACS-rør som inneholder samlingsmedium som DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ celler fra CTL-GFP- og CXCR4-GFP-prøvene. Bruk den ikke-fulgte prøven til å angi GFP+-porten og sortere DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ ikke-transdusert B-1a-celler.
MERK: Alternativt kan ikke-transduserte celler også sorteres fra CTL-GFP- og CXCR4-GFP-prøvene ved å separat gating B-1a-celler i GFP-fraksjonen. Transdusert eller ikke-transdusert B-1b celler kan også sorteres ved hjelp av denne sorteringsstrategien som DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- celler.
5. Adoptivoverføring
- Etter cellesortering, sentrifugeceller ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirerer supernatant nøye.
- Resuspendceller i kald steril 1x PBS ved 1000 celler/μL.
- Bedøve mannlige Rag1-/- ApoE-/- mus som bruker isofluran og injiserer 100 μL (100 000 celler) per mus via intravenøs retro-orbital eller halevenneinjeksjon ved hjelp av en ultrafin insulinsprøyte. Injiser noen mus med 1x PBS som kontroll.
6. Kvantifisering av donorceller og plasma-IgM
- På ønsket tid etter adoptivoverføring, analysere overførte celler i mottakermus med benmarg og miltvev høste4 og strømning cytometri. Kvantifiser lokalisering av donorcelle og CXCR4-overuttrykk ved farging for CD45.1, CD45.2 og CXCR4 og analyser flowcytometriresultater ved hjelp av en programvare som Flowjo.
MERK: Se tabell 1 for antistoffer som brukes i dette trinnet. Sørg for at du ikke bruker et antistoffkonjugat som fluoresces i FITC-kanalen som GFP vil være til stede på transdusert donorceller. - Isoler plasma ved å tilsette 10 μL 0,5 M EDTA til fullblod samlet inn via hjertepunktering på tidspunktet for dyreoffer. Sentrifuger fullblod ved 7000 x g og aliquotplasma i separate 1,5 ml sentrifugerør. Oppbevares ved -80 °C til du utfører analyser av utskillede faktorer som IgM av ELISA4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over protokollen er gitt i figur 1. Figur 2 viser berikelse av peritoneale B-1a-celler etter magnetisk uttømming av andre peritoneale celletyper. Levende singletceller i post-uttømmingsfraksjonen har en større andel av CD19 + B-celler sammenlignet med F4/80+ makrofager, mangler CD5hi CD19- T-celler, og inneholder en økt frekvens av CD19+ CD5mid B-1a celler sammenlignet med pre-uttømmingfraksjonen. Figur 3 viser kravet om B-celleaktivering for vellykket retroviral B celletransduksjon, og en doseavhengig økning i frekvensen av vellykket transdusert GFP + B celle undergrupper med økende virus MOI ved hjelp av Ctl-GFP retrovirus. Tabell 2 viser økt transduksjonseffektivitet ved hjelp av 96 godt rundbunnsplater sammenlignet med 24-brønns- eller 6-brønnplater. Figur 4 viser vellykket CXCR4-overuttrykk (>40 %) på B-1-celler og økt B-1-cellemigrasjon mot CXCL12 in vitro etter transduction med CXCR4-GFP retrovirus, uten signifikant innvirkning på B-celle levedyktighet. Figur 5 viser gatingstrategien for sortering av live-, singlet-, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a-celler fra enten en ikke-transdusert tilstand (GFP-) eller de to transduserte forholdene (GFP+). Vær oppmerksom på at CD23+ B-2-celler ikke finnes i disse prøvene på grunn av tidligere magnetisk uttømming. Transduced live, singlet, CD19 + CD23- IgM + CD5- B-1b celler kan også sorteres ved hjelp av denne gating strategi. Figur 6 viser overførte CD45.1+ donorceller og vedvarende CXCR4-overuttrykk på donorceller som er gjenopprettet fra benmarg og milt av CD45.2 mottakermus 17 uker etter celleoverføring. Tabell 3 viser en positiv tilknytning mellom CXCR4-uttrykk og donorcellelokalisering til benmargen, men ikke milt. Tabell 4 viser en positiv sammenheng mellom donorcellenummer i benmargen og plasmamengden av anti-MDA-LDL IgM.
Figur 1: Skjematisk eksperimentell design for retroviral transduction og adoptivoverføring. Peritoneale celler isolert fra CD45.1 allotype mus er beriket for B-1 celler gjennom magnetisk uttømming ved hjelp av biotinylert antistoffer og anti-biotin mikroperler. Berikede peritoneale B-1-celler aktiveres for å stimulere celleproliferasjon med TLR9 agonist CpG oligodeoxynucleotid. Aktiverte celler overføres med Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirale partikler. Vellykket transdusert GFP + B-1a celler sorteres ved hjelp av FACS og adoptivt overføres til CD45.2 allotype vertsmus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Berikelse for peritoneale B-1-celler. Representative flow cytometriplott av peritoneale celler pre-magnetisk berikelse (topp) og post-magnetisk berikelse (nederst) for CD19 + B-celler. CD19+ F4/80- celler er B-celler, CD19- F4/80 + celler er makrofager, CD19 + CD5mid celler er B-1a celler, og CD19- CD5hi celler er T-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Retroviral transduction krever B-celleaktivering. Peritoneal B-celler ble transdusert med Ctl-GFP retrovirus ved 5:1, 10:1 eller 25:1 MOI eller venstre ikke-transdusert i nærvær eller fravær av TLR9 agonist CpG ODN1668. Hyppigheten av vellykket transdusert GFP + B2, B1, B-1a eller B-1b celler ble kvantifisert av strømningscytometri 18 h etter transduksjon. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bekreftelse av CXCR4-overuttrykk og økt B-1a migrasjon in vitro. Peritoneale B-celler fra ApoE-/- mus med B-cellespesifikk mangel på CXCR4 ble isolert og transdusert med Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirus, eller dyrket uten transduging. (a) Representative flytplott av CXCR4- og GFP-uttrykk på B-1-celler fra ikke-transdusert (øvre venstre), Ctl-GFP transdusert (nedre venstre) eller CXCR4-GFP transdusert (nedre høyre) forhold. FMO-CXCR4 (øvre høyre) brukes til å sette CXCR4 positiv port. (b) Kvantifisering av MFI av CXCR4 på GFP + B-1 celler fra ikke-transdusert (n = 1), Ctl-GFP transdusert (n = 2) eller CXCR4-GFP transdusert (n = 2) forhold. (c) Hyppigheten av ikke-transdusert (n = 1), Ctl-GFP transduced (n = 2) eller CXCR4-GFP transdusert (n = 2) B-1 celler som migrerte mot CXCL12 som en prosentandel av det totale antall B-1 celler lastet i transwell. (d) Representativ gating strategi for kvantifisering av levedyktige celler innenfor vellykket transdusert B celle populasjon (CD19 + GFP +). ( e )Hyppighetenav levende B-celler etter transduction med Ctl-GFP (n = 2) eller CXCR4-GFP retrovirus (n = 2). Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. Dette tallet er endret fra vår forrige publikasjon4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Gating strategi for sortering transdusert GFP + B-1a celler. Representative flow cytometriplott for sortering av GFP+ eller GFP- B-1a-celler fra en ikke-transdusert prøve (øverst), en Ctl-GFP transdusert prøve (midten) og en CXCR4-GFP transdusert prøve (nederst). B-1a celler definert som live, singlet, CD19 + CD23- IgM + CD5 + celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Kvantifisering av overførte donorceller. Representative flow cytometriplott som viser CD45.1+ CD45.2- donorceller fra en PBS-kontroll (øverst), en Ctl-GFP+ B-1a cellemottaker (midten), og en CXCR4-GFP+ B-1a cellemottaker (nederst), og påfølgende analyse av CXCR4-uttrykk på donorceller i benmarg(a),eller milt (b). Kvantifisering av CXCR4-uttrykk (gjennomsnittlig fluorescensintensitet, MFI) på donorceller fra benmarg (c) eller milt (d). Kvantifisering av antall donorceller som er gjenfunnet i benmarg (e) eller milt (f) av mottakere. *P < 0,05 eller **P < 0,01 av Mann-Whitney-testen. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. Dette tallet er endret fra vår forrige publikasjon4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protokolltrinn | Antistoff | Endelig konsentrasjon |
| Trinn 1.8 | Ter119 biotin | 1 μL per 100 μL endelig volum |
| CD3e biotin | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| Gr-1 biotin | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| CD23 biotin | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| NK1.1 biotin | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| F4/80 biotin | 2,5 μL per 100 μL endelig volum | |
| Antistoff | Endelig konsentrasjon | |
| Trinn 4.5 | CD5 PE | 1 μL per 100 μL endelig volum |
| IgM PECF594 | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| CD23 PECy7 | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| B220 APC | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| CD19 APCef780 | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| Antistoff | Endelig konsentrasjon | |
| Trinn 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 μL per 100 μL endelig volum |
| CD45.2 BV421 | 1 μL per 100 μL endelig volum | |
| CXCR4 APC | 2,5 μL per 100 μL endelig volum |
Tabell 1: Antistoffer og deres endelige konsentrasjoner som brukes i protokollen.
| Tilstand | %GFP+ av total befolkning | %GFP+ av CD19+ B-celler |
| 96-brønns rund bunnplate | 30.9% | 52.7% |
| 24-brønns plate | 8.4% | 21.2% |
| 6-brønns plate | 16.2% | 27.3% |
Tabell 2: Plateoptimalisering. Hyppigheten av vellykket transdusert totalt GFP + celler eller GFP + CD19 + B-celler etter transduction av 6 x 106 beriket peritoneal B-1 celler i enten en 96-brønn runde-bunn plate (40 brønner på 150,00 0 celler per brønn), en 24-brønnplate (6 brønner ved 1 x 106 celler per brønn), eller en 6-brønnplate (3 brønner ved 2 x10 6 celler per brønn) ved et 20:1 MOI med Ctl-GFP retrovirus.
| Variabel | MFI cxcr4 på donor B-1a celler | |
| R | p-verdi | |
| Antall donor B-1a celler i benmarg | 0.71 | *0.014 |
| # av donor B-1a celler i milt | 0.43 | 0.18 |
Tabell 3: Tilknytning mellom CXCR4-uttrykk for donorceller og lokalisering av donorceller. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av CXCR4 på donor B-1a celler korrelert med antall donor B-1a celler i benmarg eller milt av Rag1-/- ApoE-/- mottakermus 17 uker etter adoptivoverføring. Data presentert som korrelasjonskoeffisient (r) og statistisk signifikans (p). Denne tabellen er endret fra vår forrige publikasjon4.
| Variabel | Antall donorceller i benmarg | |
| R | p-verdi | |
| Plasma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plasma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plasma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tabell 4: Tilknytning mellom lokalisering av donorcelle og plasmamengde anti-OSE IgM. Antall donor B-1a-celler i benmarg av Rag1-/- ApoE-/- mottakermus 17 uker etter adoptivoverføring korrelerte med sirkulerende mengde anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM eller anti-1,3-dextran IgM. Data presentert som korrelasjonskoeffisient (r) og statistisk signifikans (p). Denne tabellen er endret fra vår forrige publikasjon4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som tilbys her muliggjør stabil og relativt effektiv primær B-1a celle genlevering, in vivo adoptivoverføring, og identifisering og lokalisering av injiserte celler. Celler kunne oppdages 17 uker etter celleoverføring og beholdt økt CXCR4-uttrykk. Retrovirus-mediert levering ga 30-40% transduksjonseffektivitet av primære murine B-1a celler med minimal innvirkning på celle levedyktighet i våre hender (Figur 4e). Dette er i tråd med resultater fra en tidligere studie av Moghimi og kolleger som sammenlignet teknikker for genoverføring til primære murine B-celler, inkludert retroviral infeksjon, adenoviral infeksjon, kjernedannelse, eller lipofectamin15. Vi fant imidlertid at rekkevidden av CXCR4-overuttrykk varierte betydelig blant mottakerne som fikk CXCR4-GFP transdusert B-1a-celler (figur 6c,d). Derfor benyttet vi assosiativ analyse for å vise at økt CXCR4-uttrykk korrelerte med økt B-1a migrasjon og lokalisering til benmargen, som er forbundet med økt plasma IgM (tabell 3 og tabell 4).
Begrensninger av denne metoden inkluderer det store antallet mus som kreves for å få tilstrekkelig antall vellykket transdusert B-1a-celler, og variasjonen i transduksjonseffektivitet fra ett eksperiment til et annet. Transduksjonseffektiviteten forbedres av høyere titers av virale bestander, som bør være minst 2 x 107 smittsomme partikler / ml14. Bruken av eldre mus, i alderen 12-16 uker kan også forbedre peritoneal B-1 celle utbytte, som peritoneal B-1 celle tall øker med alder17.
Det er også viktig å merke seg at mengden IgM utskilles av transdusert B-1a celler etter adoptivoverføring var ~ 5 ganger mindre enn mengden utskilles av ikke-transdusert B-1a celler etter adoptivoverføring til samme Rag1-/- ApoE-/- modell (data ikke vist). Dette kan skyldes kravet om B-1-celleaktivering med TLR9-agonist før retroviral transduksjon (figur 3), som kan begrense sekundær aktivering og IgM-produksjon som svar på OSE in vivo etter adoptivoverføring. Derfor, for studier som krever robust IgM-produksjon ved overførte B-1a-celler, kan alternative genoverføringsteknikker som ikke krever tidligere B-1a-celleaktivering, for eksempel lentiviral levering18,19, være nyttige. Alternativt kan endringer i denne protokollen som involverer aktiveringsstrategier for å indusere spredning, men ikke B-1a differensiering i IgM-utskillende celler også være tilstrekkelig for vellykket retroviral transduction uten å påvirke sekundær B-celleaktivering. IL-5 er et viktig cytokin som medierer B-1a celleproliferasjon og overlevelse, og kan være et effektivt alternativ til TLR9 stimulering20,21.
Tidligere studier har benyttet milt B-celler isolert gjennom positive eller negative utvalgsstrategier ved hjelp av antistoffer mot B220 (B-cellemarkør) eller Thy1.2 (T-cellemarkør)13,,14. B220+ milt B-celler er imidlertid en heterogen populasjon som inneholder B-1- og B-2-celledelsett. Videre er B-1 cellefrekvens innenfor den totale milt-CD19+ B-cellepopulasjonen lav (1−2 %). I motsetning benytter denne metoden bukhulen som en B-1 cellekilde for transduksjon, da B-1-celler utgjør 60-70% av totalt CD19 + B-celler i dette rommet22, og bruker CD23 som en markør for å tømme peritoneale B-2-celler. Etterfølgende sortering av vellykket transdusert B-1a-celler basert på GFP-, CD19-, B220-, CD23-, IgM- og CD5-uttrykk tillater videre overføring av en mer spesifikt definert celletype. Den magnetiske uttømmingsstrategien for å berike peritoneale B-1-celler effektivt utarmet T-celler, og reduserte F4/80 peritoneal makrofagfrekvens med ~ 50% i våre hender (figur 2), selv om ytterligere optimalisering og feilsøking av dette kritiske trinnet kan øke transduksjonseffektiviteten. For eksempel, ved hjelp av en høyere konsentrasjon av biotinylert F4/80 antistoff for bedre makrofag uttømming kan ytterligere øke B-1a celle transduksjon effektivitet, som det ville være mindre "off-target" retroviral transduction av andre celletyper. Bruk av 96-brønns plater med rundbunn for transduksjon, i stedet for flatbunne 24-brønn- eller 6-brønnplater i tillegg betydelig forbedret transduksjonseffektivitet(tabell 2),men øker håndteringen og pipetteringstiden.
Samlet sett gir denne metoden en nyttig konseptbevistilnærming for å avgjøre om målrettet genlevering til B-1a-celler kan endre B-1a-cellelokalisering og funksjonell IgM-produksjon. Fremtidige anvendelser av denne teknikken kan omfatte ex vivo levering av retrovirale konstruksjoner rettet mot andre proteiner, og adoptivoverføring for å bestemme effekten på donor eller vert celle prosesser in vivo, inkludert celle overlevelse, migrasjon, spredning, eller funksjon. Adoptivoverføring til immunkompetente verter, i stedet for lymfocytter-mangelfulle verter, ville også være mulig med denne teknikken siden donorceller (CD45.1+ GFP+) kunne differensieres fra vertsceller (CD45.2+ GFP-). Målretting andre chemokin reseptorer ved hjelp av denne metoden kan ytterligere støtte hypotesen om at målretting B-1a celle migrasjon mot nisjer permissive av høy IgM produksjon kan effektivt øke nivåer av beskyttende IgM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Prosjekt 3 av P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) og R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye ble støttet av American Heart Association Pre-doktorstipend 16PRE30300002 og 5T32AI007496-20. Vi takker Joanne Lannigan, Mike Solga og Claude Chew fra University of Virginia Flow Cytometry Core for deres utmerkede tekniske hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
