Summary
Здесь мы описываем метод ретровирусной переэкспрессии и приемной передачи клеток murine B-1a для изучения миграции и локализации клеток vivo B-1a. Этот протокол может быть расширен для различных вниз по течению функциональных анализов, включая количественную оценку донорской B-1a локализации клеток или анализ донорских клеток, полученных секретных факторов после принятия передачи.
Abstract
Поскольку функция клеток зависит от нишевых факторов в клеточной микросреде, методы вскрытия локализации клеток и миграции могут обеспечить дальнейшее понимание функции клеток. Клетки B-1a являются уникальным подмножеством В-клеток у мышей, которые производят защитные природные антитела IgM против окислительных эпитопов, которые возникают во время здоровья и болезней. B-1a ячейки IgM производства отличается в зависимости от B-1a расположение клеток, и поэтому она становится полезной с терапевтической точки зрения целевой B-1a локализации ниш, поддерживающих высокий выработку антител. Здесь мы описываем метод целевой b-1a миграции клеток в костный мозг ретровирусно-опосредованной переэкспрессии C-X-C мотив хемокин рецептор 4 (CXCR4). Индукция гена в первичных клетках murine B может быть сложной задачей и, как правило, дает низкую эффективность трансфекции 10-20% в зависимости от техники. Здесь мы демонстрируем, что ретровирная трансдукция первичных клеток murine B-1a приводит к 30-40% эффективности трансдукции. Этот метод использует приемную передачу клеток трансиндуцированных клеток B-1a в в клетки-дефицитных мышей-реципиента, так что донор B-1a клеточной миграции и локализации могут быть визуализированы. Этот протокол может быть изменен для других ретровирусных конструкций и может быть использован в различных функциональных анализах после приемной передачи, включая анализ фенотипа и функции клеток-доноров, или анализ растворимых факторов, выделяемых после переноса клеток B-1a. Использование различных доноров и мышей-реципиентов, дифференцированных по аллотипу CD45.1 и CD45.2, а также наличие репортера GFP в ретровирусной плазмиде может также способствовать обнаружению донорских клеток в других, иммунодостаточном мышах, содержащих эндогенные популяции клеток B.
Introduction
Недавние исследования продемонстрировали значительную иммунную клетку, и в частности В-клетки, фенотипические и функциональные неоднородности в зависимости от локализации клеток1,2,,3,,4,5. Клетки B-1a являются одной из таких популяций с неоднородной способностью производить защитные антитела IgM; клетки костного мозга B-1a выделяют IgM constitutively и вносят значительный вклад в плазмеigTters9,6,в то время как перитонеальные клетки B-1a имеют низкоуровневую секрецию IgM при гомеостазе и7вместо этого могут быть активированы через врожденный платный рецептор (TLR) или цитокин-опосредованное сигнализацию для быстрого пролиферирования, мигрировать, и выделять 70,890, B-1a клетки IgM антитела признают окисления конкретных эпитопов (OSE), которые присутствуют на патогенных микроорганизмов, апоптотические клетки, и окисленных ЛПНП, и IgM связывания с OSE может предотвратить воспалительные вниз по течению сигнализации при таких заболеваниях, как атеросклероз11. Таким образом, стратегии по увеличению производства IgM за счет увеличения миграции клеток Перитонеала B-1a к местам, как костный мозг может быть терапевтически полезным. Тем не менее, важно, чтобы такие стратегии были целенаправленными и клеточными, так как внецелевые эффекты могут негативно сказаться на иммунной функции или здоровье.
Здесь мы описываем метод целевого и долгосрочного перевыражения CXCR4 в первичных клетках murine B-1a и последующую приемную передачу для визуализации миграции клеток и функционального производства антител IgM (Рисунок 1). Генетическое манипулирование первичными В-клетками ограничено низкой трансфекционной эффективностью по сравнению с трансфекцией преобразованных клеточных линий. Однако, как преобразованные клеточные линии могут значительно отклоняться от первичных клеток12,13, использование первичных клеток, вероятно, обеспечит результаты, которые более тесно выровнять нормальной физиологии. Несколько методов были описаны для передачи генов в первичных клеток murine B, в том числе ретровирусной трансдукции, аденовирусной трансдукции, липофектации, или электропорации на основе трансфекции, которые имеют различные уровни эффективности, трансиенции и воздействия на здоровье клеток13,14,15. Следующий метод использовал ретровиральные трансдукции, как это дало адекватную эффективность передачи генов в размере 30%, в то время как минимально влияющих жизнеспособности клеток. CXCR4-выражения ретровирус был создан с помощью ранее описанной ретровирусной конструкции муриновых стволовых клеток вируса-внутреннего рибосомного входа сайта-зеленый флуоресцентный белок (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, в котором ген мыши CXCR4 был субклонирован4. MigR1 (контроль (Ctl)-GFP) и ретровирусные частицы CXCR4-GFP были созданы с использованием трансфекции фосфатов кальция, как описано в ранее опубликованных протоколах4,14.
Успешно трансиндуцированные клетки B-1a затем внутривенно передавались в лимфоциты-дефицитные Rag1-/- мышей. И донорские, и реципиентные мыши дополнительно содержали нокаут гена аполипопротеина E (ApoE), что приводит к увеличению накопления OSE и атеросклерозу, обеспечивая тем самым модель для активации клеток in vivo B-1 и производства IgM. Кроме того, донорские и реципиентные мыши отличались аллотипом CD45; донорские клетки B-1 пришли из CD45.1 "ApoE-/- мышей и были переведены в Rag1-/- CD45.2" ApoE-/- реципиентов. Это позволило дифференциацию донора CD45.1 от реципиента CD45.2 B клеток после передачи без необходимости дополнительно пятно для Маркеров В клеток во время анализа цитометрии потока. Полученные здесь результаты показывают, что целевая переэкспрессия CXCR4 на клетках B-1a ассоциируется с повышенной способностью клеток B-1a мигрировать в костный мозг, который ассоциируется с повышенной плазменной анти-OSE IgM. Мы дополнительно предоставляем метод для обогащения перитонеальных в-1 клеток через отрицательный отбор и демонстрируем необходимость активации клеток B-1 для эффективной трансдукции. Этот метод может быть адаптирован для других ретровирусных конструкций для изучения влияния переэкспрессии белка на миграцию клеток B-1a, фенотип, или функции. Кроме того, использование CD45.1 против CD45.2 аллотип различия теоретически может позволить переход в другие иммунологические модели, содержащие эндогенные В-клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию в Университете Вирджинии.
1. Магнитное разделение и обогащение перитонеальных вок B-1
- Эвтаназия 12-14-недельный, мужчина, CD45.1-ApoE-/- мышь с использованием CO2.
- Сделайте поверхностный разрез в животе с помощью прямых хирургических ножниц и очистить кожу назад с помощью изогнутых ножниц, чтобы разоблачить брюшной стенки. Флеш перитонеальной полости с 10 мл 37 КК RPMI-1640 среды с использованием 10 мл шприца и 25 G иглы. Встряхните мышь, чтобы отойти от клеток, схватив хвост и перемещая мышь из стороны в сторону тщательно в течение 15–20 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массаж лавагской перитонеума также может максимизировать восстановление клеток. - Соберите перитонеальной жидкости с помощью шприца 10 мл и 25 G иглы, рисуя жидкость в нижней правой части перитонеума чуть выше уровня бедра, возле кишечника. Избегайте нарушения эпидидальных жировых отложений и основных органов. Избегайте рисования жидкости с левой стороны мыши, как оментальный жир может быть легко втянутв в шприц.
- После того, как будет собрано жидкости в размере 6,7 мл, выделите в коническую трубку 50 мл, размещенную на льду. Далее, поднимите мышь вертикально, удерживая стенку перитонеальной над диафрагмой с помощью щипц, так что любая оставшаяся жидкость остается в нижней части полости перитонеальной. Сделайте небольшой разрез в стенке перитонеальной с помощью хирургических ножниц над печенью (убедитесь, что не сократить печень) и собирать все оставшиеся перитонеальной жидкости с помощью стеклянной трубки и луковицы.
- Бассейн перитонеальных клеток вымывания из всех CD45.1-ApoE-/- мышей (n - 15-20) в 50 мл конических труб, и хранить на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета необходимого количества мышей: клетки B-1a составляют 5–10% от общей популяции перитонеальной и дают примерно 2,5 х 55 В-1а на мышь в руках авторов. Эффективность трансдукции составляет 30–40%, как показано ниже. - Подсчитайте живые клетки, используя краситель жизнеспособности, такие как трипан синий и гемоцитометр (разбавляйте образцы 1:5 в трипан-голубом и загружайте 10 л в гемоцитометрическую камеру). Ячейки пула на уровне до 1 х 108 ячеек на трубку. Центрифуги клетки на 400 х г в течение 5 мин при 4 КС, затем аспирсупернат.
- Resuspend до 1 х 108 клеток в 1 мл анти-CD16/CD32 антитела (Таблица материалов) разбавленной 1:50 в буфере ассе (1x фосфат буферного сосудистого раствора (PBS), 0,5% бычьей сыворотки альбумина "BSA", 2 мМ EDTA) для того, чтобы блокировать FC рецепторов. Масштабирование по мере необходимости на основе количества клеток. Инкубировать на льду в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Подготовьте 2x мастер смесь биотиниляционных антител (Таблица 1) в буфере ассеа для истощения. 2x мастер смеси приходится на объем жидкости клетки уже в при инкубации с анти-CD16/CD32. Например, если клетки инкубируют в 500 qL разбавленных анти-CD16/CD32, то добавьте 500 qL 2x мастер-микс, содержащий 10 зл биотинилатированных Ter119, Gr-1, CD23 и NK1.1 антител, и 25 мл биотиниты F4/80 антитела для достижения конечной концентрации в таблице 1. Добавьте 2x мастер-микс к клеткам и пятно в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки с 5 мл буфера асссеии и центрифуги при 400 х г в течение 5 мин при 4 КС и аспирато супернатанта.
- Resuspend и инкубировать клетки с анти-биотина microbeads (Таблица материалов) разбавленной в анализ буфера в соответствии с концентрацией и протоколом, рекомендованных производителем.
- Вымойте 5 мл буфера асссеии и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирировать супернатант и resuspend до 1 х 108 ячеек в 500 злибуфера.
- Основные столбцы магнитного отбора(Таблица материалов) с 3 мл буфера асссе. Перенесите клетки на загрунтованные столбцы магнитного отбора и соберите eluent, содержащий обогащенные клетки B-1 в конической трубке 15 мл на льду. Вымойте столбец магнитного выбора дополнительным буфером ассеа до общего объема, собранного в 10 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвот предварительно очищенных и пост-очищенных клеточных фракций должен быть отдельно проанализирован цитометрией потока для эффективности очистки путем окрашивания для CD19 "B-клеток, макрофагов F480" и Т-клеток CD5, как показано на рисунке 2. - Подсчитайте посточищенную клеточную фракцию (элуент, содержащую обогащенные клетки B-1), отсчитав живые клетки как в шаге 1.6, и повторно на 1 х 106 клеток / мл в Среде культуры B (RPMI-1640, 10% тепло-инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода ,FBS), 10 мМ HEPES, 1x несущественных аминокислот, 1 мМ пируват натрия, 50 мкг/мл благотворный gentamicin, 55 мкм-меркаптоол.
2. Перитонеальная стимуляция клеток B-1
- Сплит объединенные ячейки для двух трансиндуцированных условий (Ctl-GFP и CXCR4-GFP), откладывая и накрывая по крайней мере 10 х 106 ячеек для нетрансдуцированного контроля.
- Плита до 150 кл (150 000 клеток) на скважину в 96-хорошо круглых нижних пластин.
- Добавьте 100 нМ TLR9 агонист ODN1668 во все скважины, чтобы стимулировать пролиферацию клеток.
- Инкубировать для 16-18 ч при 37 градусах По Цельсия, 5% CO2.
3. Ретровиральная трансдукция перитонеальных в клеток В
- Генерировать Ctl-GFP (MigR1) и CXCR4-GFP ретровирусных частиц с использованием трансфекции фосфатов кальция, как описано в ранее опубликованных протоколах14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет несколько дней, так что подготовить и титр ретровирусных запасов и хранить aliquots на -80 градусов по Цельсию до начала этого протокола. - Оттепель ретровирусных запасов на льду. Используйте немедленно и не повторно замораживать, как вирус титр значительно уменьшается во время замораживания оттепели циклов. Добавьте ретровирусные супернацианты Ctl-GFP или CXCR4-GFP при множественности инфекции (МВД) в клетки, при наличии 8 мкг/мл полибрена и свежего й-меркаптоэтанола при конечной концентрации 55 мкм. Не добавляйте вирусные запасы в клетки, отведенные для нетрансиндуированного контроля.
- Выполните спинфекцию центрифугиваемыми пластинами при температуре 800 х г в течение 90 мин при комнатной температуре.
- Инкубировать пластины с ретровирусом при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за дополнительные 3 ч.
- Урожай и replate клетки в свежей среде ячейки B и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 ночь.
4. Сортировка клеток трансиндуцированных перитонеальных клеток B-1a
- Урожай культивированных ячеек и бассейн в три отдельных 50 мл конических труб для каждого состояния: не-трансиндуцированных, Ctl-GFP трансумции, и CXCR4-GFP транс-.
- Подсчитайте живые клетки, как в шаге 1.6, затем центрифуга на 400 х г в течение 5 мин при 4 КС и аспиративной супернатант.
- Resuspend клетки на 100000 клеток / Л в сортировать буфер (PBS 1% BSA), содержащий 1:50 анти-CD16/CD32 антитела (Таблица материалов) для того, чтобы блокировать fc рецепторов. Инкубировать на льду в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Аликвотные ячейки для контроля за компенсацией (30 000 ячеек на компенсационный контроль): для неокрашенных и однозначных средств контроля пятен aliquot из нетрансиндуированного образца и для однократного аликота контроля пятен GFP из трансиндуцированных образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные бусинки компенсации могут быть альтернативно использованы для одного контроля пятна, если не-трансумированный номер ячейки является низким. - Подготовка 2x антитела мастер смесь, содержащая фторофора конъюгированных антител в сортировать буфер (Таблица 1). Добавьте 2x мастер-микс в нетрансдукторы, CTL-GFP трансиндуцированные и CXCR4-GFP трансиндуцированные образцы. Добавьте индивидуальные антитела к одному контролю пятна. Инкубировать в течение 20 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2x мастер смесь приходится на объем жидкости клетки уже в при инкубации с анти-CD16/CD32, как и в шаге 1.8. Аликвот клеток от каждого состояния может быть отдельно окрашены для CXCR4 для подтверждения cXCR4 переэкспрессии. - Промойте образцы с 1 мл сортировки буфера и процедить через 70 мкм фильтры в полипропиленовых труб.
- Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию и аспирато супернатант. Повторное увеличение образцов на уровне 50 000 ячеек/ЗЛ в сортировать буфер.
- Перед сортировкой клеток подготовьте помеченные флуоресценцией активированные клеточные сортировки (FACS) коллекторские трубки, содержащие 1 мл собираемого среднего (RPMI-1640, 20% теплоинактивированный FBS, 10 мМ HEPES, 1x несущественные аминокислоты, 1 мМ пируват натрия, 50 мкг/мл гентамицин, 55 мкм-меркаптоэтанол) для каждой популяции, которая должна быть отсортирована.
- Перед запуском образцов на сортаторе ячейки добавьте 2x DAPI (подготовлен как 1:5000 разбавления в буфере сортировки) для дискриминации мертвых ячеек.
- Сортировать gFP B-1a клетки в FACS трубки, содержащие сбор среды, как DAPI- CD19- GFP- B220середине ло CD23- IgMи CD5- клетки из CTL-GFP и CXCR4-GFP образцов. Используйте нетрансиндуцированный образец, чтобы установить ворота GFP и сортировать DAPI- CD19и GFP- B220mid-lo CD23- IgMи CD5- нетрансиндуцированные клетки B-1a.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, нетрансиндуцированные клетки также могут быть отсортированы из образцов CTL-GFP и CXCR4-GFP путем раздельного gating B-1a клеток в GFP-фракции. Трансиндуцированные или нетрансиндуцированные B-1b-клетки также могут быть отсортированы с помощью этой сортировоженной стратегии в виде DAPI- CD19и GFP,/- B220mid-lo CD23- IgMи CD5- клетки.
5. Приемная передача
- После сортировки клеток, центрифуги клетки на 400 х г в течение 5 минут при 4 кв и аспирировать супернатант тщательно.
- Resuspend клетки в холодной стерильной 1x PBS на 1000 клеток / ЛЛ.
- Анестезия мужской Rag1-/- ApoE-/- мышей с использованием изофларан и вводить 100 Л (100 000 клеток) на мышь с помощью внутривенных ретро-орбитальных или хвостовых инъекций вен с помощью сверхтонкого инсулинового шприца. Введите несколько мышей с 1x PBS в качестве контроля.
6. Количественная оценка донорских клеток и плазмы IgM
- В нужное время после приемной передачи, анализ переданных клеток у мышей-реципиента по костному мозгу и селезенке ткани урожая4 и потока цитометрии. Количественная локализация донорских клеток и переэкспрессия CXCR4 путем окрашивания CD45.1, CD45.2 и CXCR4 и анализа результатов цитометрии потока с помощью программного обеспечения, такого как Flowjo.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для антител, используемых в этом шаге. Убедитесь, что не использовать конъюгированные антитела, которые флуоресцирует в канале FITC, как GFP будет присутствовать на трансиндуцированных донорских клеток. - Изолировать плазму, добавляя 10 л 0,5 М ЭДТА к всей крови, собранной через сердечный прокол во время жертвоприношения животных. Центрифуга цельной крови на 7000 х г и аликвот плазмы в отдельных 1,5 мл центрифуговых труб. Хранить при -80 градусов до выполнения анализа секретных факторов, таких как IgM от ELISA4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор протокола приведен на рисунке 1. Рисунок 2 отображает обогащение перитонеальных клеток B-1a после магнитного истощения других типов перитонеальных клеток. В долях синглетных ячеек после истощения доля клеток CD19'b+ больше, чем у макрофагов F4/80, отсутствие CD5hi CD19- Т-клеток, и содержится повышенная частота CD19и CD5в середине B-1a-клеток по сравнению с фракцией предварительного истощения. На рисунке 3 отображается требование активации В-клеток для успешного ретровирусного трансдукции клеток В, а также дозозависимое увеличение частоты успешно трансцированных подмочек клеток GFP- B с увеличением вируса МВД с помощью ретровируса Ctl-GFP. Таблица 2 отображает повышенную эффективность трансдукции с использованием 96 хорошо круглых нижних пластин по сравнению с 24-ну колойными или 6-колодскими пластинами. Рисунок 4 отображает успешную переэкспрессию CXCR4 (Nogt;40%) на клетках B-1 и увеличение миграции клеток B-1 к CXCL12 in vitro после трансдукции с ретровирусом CXCR4-GFP, без значительного влияния на жизнеспособность вяленых ячеек. На рисунке 5 отображается стратегия сортировки живых, синглетных, CD19 " CD23- ИгМЗ CD5" B-1a-клеток либо из нетрансиндуцированного состояния (GFP-), либо двух трансиндуцированных условий (GFP). Обратите внимание, что клетки CD23 B-2 не присутствуют в этих образцах из-за предыдущего магнитного истощения. Трансиндуцированные живые, синглетные, CD19 " CD23- IgM- CD5- B-1b-клетки также могут быть отсортированы с помощью этой стратегии gating. Рисунок 6 отображает переданы CD45.1 "донорских клеток и устойчивый CXCR4 переэкспрессии на донорские клетки, извлеченные из костного мозга и селезенки CD45.2 реципиента мышей 17 недель после клеточного переноса. Таблица 3 отображает положительную связь между экспрессией CXCR4 и локализацией донорских клеток с костным мозгом, но не селезенкой. Таблица 4 отображает положительную связь между номером донорских клеток в костном мозге и количеством плазмы анти-MDA-LDL IgM.
Рисунок 1: Схема экспериментального проектирования ретровирусной трансдукции и приемной передачи. Перитонеальные клетки, изолированные от CD45.1 аллотиповых мышей, обогащены для клеток B-1 за счет магнитного истощения с использованием биотинилаповых антител и антибиотинных микробусов. Обогащенные перитонеальные клетки B-1 активируются для стимуляции пролиферации клеток с помощью агониста TLR9 CpG олигодеоксинуклеотида. Активированные клетки транссиба с помощью ретровирусных частиц Ctl-GFP или CXCR4-GFP. Успешно трансиндуцированные клетки GFP B-1a сортируются с помощью FACS и переводятся в CD45.2 аллотипные мыши-хозяева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обогащение для перитонеальных ячеек B-1. Представительный поток цитометрии участков перитонеальных клеток домагнитного обогащения (вверху) и постмагнитного обогащения (внизу) для клеток CD19 "B. CD19 "F4/80- клетки В-клетки, CD19- F4/80" клетки макрофагов, CD19 "CD5средних клеток B-1a клетки, и CD19- CD5привет клетки T-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Ретровиральная трансдукция требует активации вклл. Перитонеальные В-клетки были трансумции с Ctl-GFP ретровирус на 5:1, 10:1, или 25:1 МВД или оставили нетрансиндуированных в присутствии или отсутствии TLR9 агонист CpG ODN1668. Частота успешно трансиндуцированных клеток GFP B2, B1, B-1a или B-1b была количественно оценена цитометрией потока 18 ч после трансдукции. Бары ошибок представляют среднее количество SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Подтверждение переэкспрессии CXCR4 и увеличение миграции B-1a in vitro. Перитонеальные В-клетки от ApoE-/- мышей с дефицитом CXCR4, специфичных для клеток, были изолированы и трансумированы с помощью ретровируса Ctl-GFP или CXCR4-GFP, или культивируются без трансдукции. (a) Представитель потока участков CXCR4 и GFP выражение на B-1 клетки из не-трансиндуцированных (вверху слева), Ctl-GFP транс-индуцированных (в левом углу), или CXCR4-GFP трансиндуцированных (нижний правый) условия. FMO-CXCR4 (вверху справа) используется для установки CXCR4 положительные ворота. (b)Количественная оценка МФО CXCR4 на ячейках GFP B-1 из нетрансиндуцированных (n No 1), Ctl-GFP трансиндуцированных (n No 2), или CXCR4-GFP трансиндуцированных (n no 2) условий. (c)Частота нетрансиндуцированных (n no 1), Ctl-GFP трансиндуцированных (n no 2), или CXCR4-GFP трансиндуцированных (n No 2) B-1 ячеек, которые мигрировали в направлении CXCL12 в процентах от общего числа ячеек B-1, загруженных в трансуэлле. (d)Представитель gating стратегия для количественной оценки жизнеспособных клеток в рамках успешно трансцированной популяции В-клеток (CD19-GFP). (e) Частота живых В-клеток после трансдукции с Ctl-GFP (n No 2) или ретровирусом CXCR4-GFP (n No 2). Бары ошибок представляют среднее изначное для SEM. Эта цифра была изменена из нашей предыдущей публикации4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Стратегия Gating для сортировки трансиндуцированных ячеек GFP B-1a. Представительные участки цитометрии потока для сортировки GFP или GFP- B-1a-клеток из нетрансиндуцированного образца (вверху), трансиндуцированного образца Ctl-GFP (средний) и трансиндуцированного образца CXCR4-GFP (внизу). Клетки B-1a, определяемые как живые, синглетные, CD19 " CD23-IgM- CD5". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Количественная оценка переданных донорских клеток. Представитель ный цитометрии потоков участков отображения CD45.1 "CD45.2- донорских клеток из одного управления PBS (вверху), один Ctl-GFP B-1a получателя клеток (средний), и один CXCR4-GFP B-1a получателя клеток (внизу), и последующий анализ cXCR4 выражение на донорских клетках в костном мозге(a), или селезенка (b). Количественная оценка экспрессии CXCR4 (средняя интенсивность флуоресценции, МФО) на донорских клетках из костного мозга(c)или селезенки(d). Количества донорских клеток, обнаруженных в костном мозге(е)или селезенке(f)реципиентов. Злт; 0,05 или Злт; 0,01 по тесту Манн-Уитни. Бары ошибок представляют среднее изначное для SEM. Эта цифра была изменена из нашей предыдущей публикации4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Протокол шаг | Антитела | Окончательная концентрация |
| Шаг 1.8 | Ter119 биотин | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома |
| CD3e биотин | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| Гр-1 биотин | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| CD23 биотин | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| NK1.1 биотин | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| Биотин F4/80 | 2,5 л на 100 л конечного объема | |
| Антитела | Окончательная концентрация | |
| Шаг 4.5 | CD5 PE | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома |
| IgM PECF594 | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| CD23 PECy7 | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| БТР B220 | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| CD19 APCef780 | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| Антитела | Окончательная концентрация | |
| Шаг 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома |
| CD45.2 BV421 | 1 юл на 100 ЛЛ окончательного тома | |
| CXCR4 APC | 2,5 л на 100 л конечного объема |
Таблица 1: Антитела и их окончательные концентрации, используемые в протоколе.
| Состояние | %ГФПЗ от общей численности населения | %ГФПЗ из клеток CD19 "B |
| 96-хорошая круглая нижняя пластина | 30.9% | 52.7% |
| 24-хорошая тарелка | 8.4% | 21.2% |
| 6-хорошая тарелка | 16.2% | 27.3% |
Таблица 2: Оптимизация плит. Частота успешно трансцированных общих клеток GFP или GFP CD19 "B-клеток после трансдукции 6 х 106 обогащенных перитонеальных в-1-х клеток в 96-хорошей круглой нижней пластине (40 скважин при 150,00 0 клеток на скважину), 24-колодная пластина (6 скважин по 1 х 106 ячеек на скважину) или 6-колодец (3 колодца по 2 х 106 ячеек на скважину) при 20:1 МВД с ретровирусом Ctl-GFP.
| Переменной | МФО CXCR4 на донорских клетках B-1a | |
| r-значение | р-значение | |
| - донорские клетки B-1a в костном мозге | 0.71 | *0.014 |
| - донорских клеток B-1a в селезенке | 0.43 | 0.18 |
Таблица 3: Ассоциация между выражением CXCR4 о донорских клетках и локализацией донорских клеток. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CXCR4 на донорских клетках B-1a коррелирует с количеством донорских клеток B-1a в костном мозге или селезенке Rag1-/- ApoE-/- мышей-реципиентов 17 недель после приемной передачи. Данные представлены как коэффициент корреляции (r) и статистическая значимость (р). Эта таблица была изменена из нашей предыдущей публикации4.
| Переменной | донорских клеток костного мозга | |
| r-значение | р-значение | |
| Плазма анти-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Плазма E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Плазма 1,3-экстран IgM | 0.29 | 0.39 |
Таблица 4: Ассоциация между локализацией донорских клеток и количеством плазмы анти-OSE IgM. Количество клеток донора B-1a в костном мозге Rag1-/- ApoE-/- реципиентных мышей 17 недель после принятия передачи коррелирует с циркулирующим количеством анти-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM, или анти-1,3-dextran IgM. Данные представлены как коэффициент корреляции (r) и статистическая значимость (р). Эта таблица была изменена из нашей предыдущей публикации4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предоставляемый здесь метод обеспечивает стабильную и относительно эффективную доставку первичного гена клеток B-1a, приемную передачу vivo, идентификацию и локализацию инъекционных клеток. Клетки были в состоянии быть обнаружены 17 недель после клеточного перевода и сохранили повышенное выражение CXCR4. Ретровирусо-опосредованные поставки дали 30-40% трансдукционной эффективности первичных клеток murine B-1a с минимальным воздействием на жизнеспособность клеток в наших руках (Рисунок 4e). Это соответствует результатам предыдущего исследования Могими и его коллег, которые сравнили методы передачи генов в первичные клетки мурина B, включая ретровирусную инфекцию, аденовирусную инфекцию, нуклеофекцию, или липофектамин15. Тем не менее, мы обнаружили, что диапазон переэкспрессии CXCR4 значительно варьировался в пределах получателей, получающих CXCR4-GFP трансиндуцированных B-1a клеток(рисунок 6c,d). Поэтому мы использовали ассоциативный анализ, чтобы продемонстрировать, что увеличение экспрессии CXCR4 коррелирует с увеличением миграции B-1a и локализации костного мозга, что связано с увеличением плазмы IgM (Таблица 3 и Таблица 4).
Ограничения этого метода включают в себя большое количество мышей, необходимых для получения достаточного количества успешно трансиндуцированных клеток B-1a, и изменчивость эффективности трансдукции от одного эксперимента к другому. Эффективность трансдукции повышается более высокими титрами вирусных запасов, которые должны быть не менее 2 х 107 инфекционных частиц/мл14. Использование пожилых мышей, в возрасте 12-16 недель может также улучшить выход клеток перитонеала B-1, как перитонеальные B-1 число клеток увеличивается с возрастом17.
Важно также отметить, что количество IgM, выделяемых трансиндуцированными клетками B-1a после принятия, было в 5 раз меньше, чем сумма, выделяемых нетрансиндуцированными клетками B-1a после приемной передачи в ту же Rag1-/- ApoE-/- модель (данные не показаны). Это может быть связано с требованием активации клеток B-1 с агонистом TLR9 до ретровирусной трансдукции(рисунок 3), который может ограничить вторичную активацию и производство IgM в ответ на OSE in vivo после приемной передачи. Таким образом, для исследований, которые требуют надежного производства IgM переданных клеток B-1a, альтернативные методы передачи генов, которые не требуют предварительной активации клеток B-1a, таких как лентивирусная доставка18,19, может оказаться полезным. Кроме того, изменений в этом протоколе, которые включают стратегии активации, чтобы вызвать распространение, но не B-1a дифференциации в IgM-секретирующих клеток также может быть достаточно для успешного ретровирусного трансдукции без воздействия вторичной активации В клеток. IL-5 является важным цитокинов посредничество B-1a пролиферации клеток и выживания, и может быть эффективной альтернативой TLR9 стимуляции20,21.
Предыдущие исследования использовали селезенки B-клеток, изолированных через положительные или отрицательные стратегии отбора с использованием антител против B220 (B-клеточный маркер) или Thy1.2 (T-клеток маркер)13,14. Тем не менее, B220 "селезенки B-клеток являются разнородной популяции, содержащей B-1 и B-2 клеточных подмножеств. Кроме того, частота клеток B-1 в общей популяции клеток селезенки CD19 'B низка (1–2%). В отличие от этого, этот метод использует полость перитонеальной полости в качестве источника клетки B-1 для трансдукции, так как клетки B-1 составляют 60-70% от общего количества клеток CD19 в этом отсеке22, и использует CD23 в качестве маркера для истощения перитонеальных ячеек B-2. Последующая сортировка успешно трансиндуцированных клеток B-1a на основе GFP, CD19, B220, CD23, IgM и CD5 позволяет далее передавать более специфически определенный тип ячейки. Стратегия магнитного истощения для обогащения перитонеальных вс-1 клеток эффективно истощается Т-клеток, и снижение F4/80 частоты перитонеального макрофаг на 50% в наших руках (Рисунок 2), хотя дальнейшая оптимизация и устранение неполадок этого критического шага может увеличить эффективность трансдукции. Например, использование более высокой концентрации биотинитарных антител F4/80 для лучшего истощения макрофагов может еще больше повысить эффективность трансдукции клеток B-1a, поскольку будет меньше ретровирусной трансдукции других клеток. Использование 96-хорошо круглых нижних пластин для трансдукции, вместо плоского дна 24-наилучшим образом или 6-нухорошо пластин дополнительно значительно улучшилось эффективность трансдукции(таблица 2), хотя увеличивает обработку и время pipetting.
В целом, этот метод обеспечивает полезный подход, подтверждающий концепцию, для определения того, может ли целевая доставка генов в клетки B-1a изменить локализацию клеток B-1a и функциональное производство IgM. Будущие применения этого метода могут включать в себя ex vivo доставки ретровирусных конструкций, ориентированных на другие белки, и приемной передачи для определения его влияния на донора или принимающих клеток процессов in vivo, в том числе выживание клеток, миграции, распространения или функции. Приемная передача в иммунокомпетентных хостах, а не лимфоцитов дефицитных хостах, также будет возможно с этой техникой, поскольку донорские клетки (CD45.1 " GFP) может быть дифференцирована от клеток-хозяев (CD45.2 "GFP-). Ориентация на другие рецепторы хемокина с помощью этого метода может еще больше поддержать гипотезу о том, что таргетинг миграции клеток B-1a в сторону ниш, разрешительных с высоким уровнем производства IgM, может эффективно повысить уровень защитного IgM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Проект 3 P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) и R01GM100776 (Т.П. Бендер). A. Upadhye была поддержана Американской ассоциацией сердца Предварительная докторская стипендия 16PRE30300002 и 5T32AI007496-20. Мы благодарим Джоан Ланниган, Майка Солгу и Клода Чу из Университета Вирджинии Flow Cytometry Core за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
