Summary
Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.
Abstract
Hücre fonksiyonu hücresel mikroortamda niş özgü faktörlerden etkilendiği gibi, hücre lokalizasyonu ve göç incelemek için yöntemler hücre fonksiyonu hakkında daha fazla fikir sağlayabilir. B-1a hücreleri, sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkan oksidasyona özgü epitoplara karşı koruyucu doğal IgM antikorları üreten farelerde benzersiz bir B hücre alt kümesidir. B-1a hücre igM üretimi B-1a hücre konumuna bağlı olarak değişir, ve bu nedenle yüksek antikor üretimini destekleyen nişler b-1a lokalizasyonu hedef terapötik bir açıdan yararlı olur. Burada C-X-C motifi kemokin reseptör4 (CXCR4) retroviral aracılı aşırı ekspresyonu ile kemik iliği B-1a hücre göçünün hedefsini hedefleyen bir yöntem açıklıyoruz. Primer murine B hücrelerinde gen indüksiyonu zorlu olabilir ve genellikle teknik bağlı olarak %10-20 oranında düşük transfeksiyon verimi verir. Burada primer murine B-1a hücrelerinin retroviral transdüksiyonunun %30-40 transdüksiyon verimi ile sonuçladığını gösterdik. Bu yöntem, donör B-1a hücre göçü ve lokalizasyonu görselleştirilebilmek için transduced B-1a hücrelerinin B hücresi eksikliği alıcı farelere benimseyen hücre transferini kullanır. Bu protokol diğer retroviral yapılar için değiştirilebilir ve donör hücre veya konak hücre fenotip ve fonksiyonunun analizi veya B-1a hücre transferi sonrası salgılanan çözünür faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel tahliller sonrası adoptive transfer, kullanılabilir. CD45.1 ve CD45.2 allotipi ile farklılaşan farklı donör ve alıcı farelerin kullanımı ve retroviral plazmid içinde bir GFP muhabirinin varlığı da endojen B hücre popülasyonları içeren diğer, bağışıklık-yeterli fare modellerinde donör hücrelerinin tespitini sağlayabilir.
Introduction
Son çalışmalar önemli bağışıklık hücresi göstermiştir, ve özellikle B hücre, henotypik ve fonksiyonel heterojenite hücre lokalizasyonuna bağlı olarak1,2,3,4,5. B-1a hücreleri koruyucu IgM antikorları üretmek için heterojen kapasiteye sahip tür bir popülasyondur; kemik iliği B-1a hücreleri igM salgılar ve plazma IgM titreleriönemliölçüde katkıda 6 , periton B-1a hücreleri homeostaz düşük seviyeli IgM salgısı varken ve bunun yerine doğuştan gelen ücretli reseptör ile aktive edilebilir (TLR) veya sitokin aracılı sinyal hızla çoğalmak için, göç, ve gizli IgM7,8,,90.10 B-1a hücreli IgM antikorları patojenlerde, apoptotik hücrelerde ve okside LDL'de bulunan oksidasyona özgü epitoplar (OSE) tanır ve OSE'ye bağlanan IgM, ateroskleroz11gibi hastalıklarda inflamatuar akıntı sinyalini önleyebilir. Bu nedenle, kemik iliği gibi bölgelere peritoneal B-1a hücre göçlerini artırarak IgM üretimini artırma stratejileri terapötik olarak yararlı olabilir. Ancak, bu tür stratejilerin hedef alınması ve hücre tipine özgü olması önemlidir, çünkü hedef dışı etkiler bağışıklık fonksiyonunu veya sağlığını olumsuz etkileyebilir.
Burada primer murine B-1a hücrelerinde CXCR4'ün hedefli ve uzun süreli aşırı ekspresyonu ve hücre göçünü ve fonksiyonel IgM antikor üretimini görselleştirmek için sonraki evlat edinici transfer için bir yöntem açıklıyoruz (Şekil 1). Birincil B hücrelerinin genetik manipülasyonu, dönüştürülmüş hücre hatlarının transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında düşük transfeksiyon verimliliği ile sınırlıdır. Ancak, dönüştürülmüş hücre hatları önemli ölçüde birincil hücrelerden sapma olabilir12,13, birincil hücrelerin kullanımı daha yakından normal fizyolojisi hizalamak sonuçlar sağlamak olasıdır. Çeşitli teknikler retroviral transdüksiyon, adenoviral transdüksiyon, lipofection, ya da elektroporasyon tabanlı transfeksiyon, verimlilik, geçicilik değişen düzeylerde ve hücre sağlığı üzerinde etkisi13,,14,15dahil olmak üzere primer murine B hücrelerinde gen transferi için tanımlanmıştır. Aşağıdaki yöntemde retroviral transdüksiyon ,hücre canlılığını en az düzeyde etkilerken %gt;%30 oranında yeterli gen aktarım verimi vermiştir. CXCR4-ekspres retrovirüs daha önce açıklanan retroviral yapı murine kök hücre virüs-iç ribozomal giriş sitesi-yeşil floresan protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, içine fare CXCR4 gen alt klonlanmış olduğu4. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanılarak üretildi4,14.
Başarılı bir şekilde transebed B-1a hücreleri daha sonra intravenöz lenfosit eksikliği Rag1-/- farelere transfer edildi. Hem donör hem de alıcı fareler ayrıca apolipoprotein E (ApoE) geninin nakavtını içeriyordu, bu da OSE birikiminin artması ve aterosklerozla sonuçlanarak in vivo B-1 hücre aktivasyonu ve IgM üretimi için bir model sağladı. Ayrıca, donör ve alıcı fareler CD45 allotype farklı; donör B-1 hücreleri CD45.1+ ApoE-/- farelerden geldi ve Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- alıcılarına transfer edildi. Bu, donör CD45.1'in alıcı CD45.2 B hücrelerinden akış sitometrisi analizi sırasında B hücre belirteçleri için ek olarak lekelemeye gerek kalmadan transfer sonrası farklılaşmasına olanak sağladı. Burada verilen sonuçlar, B-1a hücrelerinde hedeflenen CXCR4 aşırı ekspresyonu, B-1a hücrelerinin kemik iliğine geçiş yapma yeteneğini n arttırdığını ve bu da artmış plazma anti-OSE IgM ile ilişkilendirdiğini göstermektedir. Ayrıca negatif seçim yoluyla periton B-1 hücrelerinin zenginleştirilmesi için bir yöntem sağlamak ta ve verimli transdüksiyon için B-1 hücre aktivasyonu gereksinimini göstermektedir. Bu yöntem, protein aşırı ekspresyonunun B-1a hücre göçü, fenotip veya fonksiyon üzerindeki etkisini incelemek için diğer retroviral yapılara uyarlanabilir. Ayrıca, CD45.1 karşı CD45.2 allotype ayrım kullanımı teorik olarak endojen B hücreleri içeren diğer bağışıklık-yeterli murine modelleri ne transfer izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Periton B-1 hücrelerinin manyetik ayrıştırılması ve zenginleşmesi
- 12−14 haftalık, erkek, CD45.1+ApoE-/- fare CO2kullanarak ötenazi .
- Düz cerrahi makas kullanarak karın yüzeysel bir kesim yapmak ve periton duvarı ortaya çıkarmak için kavisli makas kullanarak geri deri soyma. 10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak 10 mL 37 °C RPMI-1640 orta ile floş periton boşluğu. Kuyruğu kavrayarak ve fareyi 15−20 s boyunca iyice yan lara doğru hareket ettirerek hücreleri devre dışı kaldırmak için fareyi çalkalayın.
NOT: Lavajlı periton masaj da hücre kurtarma maksimize edebilir. - 10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak periton sıvısını, peritonumun sağ alt tarafında, kalça seviyesinin hemen üzerinde, bağırsakların yakınında sıvı oluşturarak toplayın. Epidydimal yağ depoları ve altta yatan organları bozmaktan kaçının. Omental yağ kolayca şırınga içine çizilebilir gibi farenin sol tarafında sıvı çizim kaçının.
- ~6−7 mL sıvı toplandıktan sonra, buz üzerine yerleştirilen 50 mL konik tüpe dağıtın. Daha sonra, kalan sıvının periton boşluğunun alt kısmında kalması için persepskullanarak diyaframın üzerindeki periton duvarını basılı tutarak fareyi dikey olarak yükseltin. Karaciğer üzerinde cerrahi makas kullanarak periton duvarında küçük bir kesim yapmak (karaciğer kesmek için değil emin olun) ve bir cam pipet ve ampul kullanarak kalan periton sıvısı toplamak.
- Tüm CD45.1+ApoE-/- farelerden (n = 15−20) 50 mL konik tüplere havuz periton yıkama hücreleri ve buz üzerinde depolayın.
NOT: Gerekli fare sayısının hesaplanmasıiçin: B-1a hücreleri toplam periton popülasyonunun %5−10'unu oluşturur ve yazarların ellerinde fare başına yaklaşık 2,5−5 x 105 B-1a hücresi verir. Transdüksiyon verimliliği aşağıda gösterildiği gibi ~%30−40'dır. - Trippan mavisi ve hemositometre gibi canlı lık boyası kullanarak canlı hücreleri sayın (seyreltik numuneler 1:5 trippan mavisinde ve hemositometre odasına 10°L yükleyin). Havuz hücreleri tüp başına 1 x 108 hücreye kadar. 4 °C'de 5 dk için 400 x g'de santrifüj hücreleri, daha sonra süpernatant aspire edilir.
- Fc reseptörlerini engellemek için8 1 mL anti-CD16/CD32 antikor(Malzeme Tablosu)içinde 1:50'ye kadar 1x fosfat tamponlu salin [PBS], %0,5 büyükbaş serum albumin [BSA], 2 mM EDTA) seyreltilmiş olarak yeniden askıya alın. Hücre sayısına göre gerektiği gibi ölçeklendirin. 4 °C'de 10 dakika buz üzerinde kuluçka.
- Tükenmesi için ispat tamponunda biyotinylated antikorların(Tablo 1)2x ana karışımını hazırlayın. 2x ana karışım, anti-CD16/CD32 ile kuluçkaya yatıldığında hücrelerin zaten içinde olduğu sıvının hacmini hesaplar. Örneğin, hücreler 500 μL'lik seyreltilmiş anti-CD16/CD32'de kuluçkaya yatsalar, tablo 1'deverilen son konsantrasyonları elde etmek için 10 μL biyotinylated Ter119, Gr-1, CD23 ve NK1.1 antikoriçeren 500 μL 2x ana karışımı ekleyin. Hücrelere 2x ana karışımı ekleyin ve 4 °C'de 20 dk için leke.
- 4 °C'de 5 dk 400 x g'de 5 mL çıkma tamponu ve santrifüj ile hücreleri yıkayın ve süpernatant aspire edin.
- Anti-biotin mikroboncukları(Malzeme Tablosu)ile hücreleri resuspend ve inkübül, üretici tarafından önerilen konsantrasyon ve protokole göre test tamponu ile seyreltilir.
- 4 °C'de 5 dk 400 x g'da 5 mL çıkma tamponu ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatant aspire edin ve 500 μL'lik bir arabellekte 1 x 108 hücreye kadar yeniden askıya alın.
- 3 mL'lik sayma arabelleği ile asal manyetik seçim sütunları(Malzeme Tablosu). Hücreleri astarlı manyetik seçim sütunlarına aktarın ve buzun üzerindeki 15 mL konik tüpte zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüenttop. Toplanan toplam hacim 10 mL olana kadar manyetik seçim sütununa ek bir çalışma arabelleği yle yıkayın.
NOT: Önceden saflaştırılmış ve arınmış hücre fraksiyonlarının bir aliquot ayrı ayrı CD19 + B hücreleri, F480 + makrofajlar ve CD5 + T hücreleri için boyama tarafından saflaştırma verimliliği için akış sitometri tarafından ayrı ayrı analiz edilmelidir Şekil 2'degösterildiği gibi . - 1.6'daki gibi canlı hücreleri sayarak arınmış hücre fraksiyonu (zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüent) saymak, ve B hücre kültürü orta sında 1 x 106 hücre/mL'de (RPMI-1640, %10 ısı yalıtımlı fetal sığır serumu [FBS], 10 mM HEPES, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pirüuvat, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol).
2. Periton B-1 hücre stimülasyonu
- İki transduced koşullar (Ctl-GFP ve CXCR4-GFP) için bölünmüş havuzlu hücreler, bir kenara ayarı ve transeformasyonsuz kontrol için en az 10 x 106 hücreleri kaplama.
- 96 kuyulu yuvarlak alt plakalara her biri 150 μL'ye (150.000 hücre) kadar plaka koyun.
- Hücre çoğalmasını uyarmak için tüm kuyulara 100 nM TLR9 agonist ODN1668 ekleyin.
- 37 °C'de 16−18 saat, %5 CO2'dekuluçka .
3. Periton B hücrelerinin retroviral transdüksiyonu
- Ctl-GFP (MigR1) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanarak üretin14.
NOT: Bu işlem birkaç gün sürer, bu nedenle retroviral stokları hazırlayın ve titretleyin ve bu protokolü başlatmadan önce -80 °C'de aliquots saklayın. - Buz üzerinde çözülme retrovirüs stokları. Hemen kullanın ve virüs titresi donma-çözülme döngüleri sırasında önemli ölçüde azalır gibi yeniden donma yok. Ctl-GFP veya CXCR4-GFP retroviral süpernatantlarını hücrelere 20:1'de 8 μg/mL polibren ve 55 μM son konsantrasyonda taze β-mercaptoethanol varlığında enfeksiyon (MOI) çokluğuyla ekleyin. Transeolmayan kontrol için ayrılan hücrelere viral stoklar eklemeyin.
- Oda sıcaklığında 90 dk için 800 x g'de santrifüj plakaları ile spenfeksiyon yapın.
- 37 °C'de retrovirüslü kuluçka plakaları, ek 3 saat için %5 CO2.
- Taze B hücresi orta ve kuluçka hücreleri hasat ve replate 37 °C, 5% CO2 gecede.
4. Transekin periton B-1a hücrelerinin hücre sıralaması
- Kültürlenmiş hücreleri ve havuzu her durum için üç ayrı 50 mL konik tüpe ayırın: transere, Ctl-GFP transduced ve CXCR4-GFP transduced.
- 1.6 adımdaki gibi canlı hücreleri sayın, 400 x g'de 4 000 x g'de 4 °C'de 5 dk ve aspire süpernatant.
- Fc reseptörlerini engellemek için 1:50 anti-CD16/CD32 antikor(Malzeme Tablosu)içeren sıra tampon (PBS + %1 BSA) 100.000 hücre/μL'deki hücreleri yeniden askıya alın. 4 °C'de 10 dakika buz üzerinde kuluçka.
- Telafi kontrolleri için Aliquot hücreleri (kompanzasyon kontrolü başına~30.000 hücre): transeedilmemiş numuneden lekesiz ve tek leke kontrolleri aliquot ve transduced numunelerden GFP tek leke kontrolü aliquot için.
NOT: Transeme edilemeyen hücre sayısı düşükse, ticari olarak kullanılabilen kompanse boncuklar tek leke kontrolleri için alternatif olarak kullanılabilir. - Sıra tampon florofor konjuge antikorlar içeren bir 2x antikor ana karışımı hazırlayın(Tablo 1). Transe, CTL-GFP transduced ve CXCR4-GFP transduced örneklerine 2x ana karışım ekleyin. Tek leke kontrolleri için bireysel antikorlar ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 20 dk kuluçka.
NOT: 2x ana karışım, 1.8 adımda olduğu gibi anti-CD16/CD32 ile kuluçkaya yatıldığında hücrelerin zaten içinde olduğu sıvı nın hacmini hesaplar. CXCR4 aşırı ekspresyonunu onaylamak için cxcr4 için her koşuldan bir hücre aliquot ayrı ayrı boyanabilir. - Numuneleri 1 mL tür tamponla yıkayın ve 70 μm filtreler den polipropilen tüplere süzün.
- 4 °C'de 5 dk 400 x g'de santrifüj ve aspire süpernatant. 50.000 hücre/μL'deki numuneleri sıralama tamponunda yeniden askıya alın.
- Hücre sıralamadan önce 1 mL toplama ortamı içeren etiketli floresan aktif hücre sıralama (FACS) toplama tüpleri (RPMI-1640, Her popülasyon için %20 ısı yalıtımlı FBS, 10 mM HEPES, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pirüuvat, 50 μg/mL gentamisin, 55 μM β-mercaptoetanol) sıralanır.
- Hücre ayırıcısında örnekleri çalıştırmadan önce ölü hücre ayrımcılığı için 2x DAPI (sıra tampon1:5000 seyreltme olarak hazırlanan) ekleyin.
- GFP+ B-1a hücrelerini DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ CTL-GFP ve CXCR4-GFP örneklerinden toplama ortamı içeren FACS tüpleri halinde sıralayın. GFP+ kapısını ayarlamak ve DAPI - CD19+ GFP- - B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ transduced olmayan B-1a hücrelerini sıralamak için transize olmayan örneği kullanın.
NOT: Alternatif olarak, transeedilemeyen hücreler de CTL-GFP ve CXCR4-GFP örneklerinden GFP fraksiyonu içindeki B-1a hücrelerini ayrı ayrı ayırarak sıralanabilir. Transduced veya non-transduced B-1b hücreleri de DAPI olarak bu sıralama stratejisi kullanılarak sıralanabilir- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- hücreleri.
5. Evlat edinme transferi
- Hücre ayrıştırma sonra, 4 °C'de 5 dakika 400 x g santrifüj hücreleri ve aspire supernatant dikkatle.
- Soğuk steril 1x PBS'deki hücreleri 1.000 hücre/μL'de yeniden askıya alın.
- Anestezi erkek Rag1-/- ApoE-/- fareler isoflurane kullanarak ve bir ultra-ince insülin şırınga kullanarak intravenöz retro-orbital veya kuyruk damar enjeksiyonu ile fare başına 100 μL (100.000 hücre) enjekte. Kontrol olarak birkaç fareye 1x PBS enjekte edin.
6. Donör hücrelerin ve plazma IgM'nin nicelleştirilmesi
- İstenilen zamanda post-adoptive transfer, kemik iliği ve dalak doku hasat4 ve akış sitometri ile alıcı farelerde transfer hücreleri analiz. CD45.1, CD45.2 ve CXCR4 için boyama yaparak donör hücre lokalizasyonu ve CXCR4 aşırı ekspresyonu ölçün ve Flowjo gibi bir yazılım kullanarak akış sitometri sonuçlarını analiz edin.
NOT: Bu adımda kullanılan antikorlar için Tablo 1'e bakınız. Transedonör hücrelerde GFP mevcut olacağından, FITC kanalındaki floresan bir antikor eşleği kullanmamaya devam edin. - Hayvan kurban sırasında kardiyak delinme ile toplanan tam kana 0,5 M EDTA'nın 10 μL'sini ekleyerek plazmayı izole edin. 7.000 x g ve aliquot plazmada santrifüj tam kan ayrı 1.5 mL santrifüj tüpler içine. ELISA4tarafından IgM gibi salgılanan faktörlerin analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolegenel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2, diğer periton hücre tiplerinin manyetik tükenmesi sonrasında periton B-1a hücrelerinin zenginleşmesini gösterir. Tükenme sonrası fraksiyondaki canlı tekli hücreler F4/80+ makrofajlara göre CD19+ B hücrelerinin daha büyük bir oranına sahiptir, CD5hi CD19- T hücrelerinden yoksundur ve ön tükenme fraksiyonuna göre CD19+ CD5orta B-1a hücrelerinin artan frekansını içerir. Şekil 3 başarılı retroviral B hücre transdüksiyonu için B hücre aktivasyonu gereksinimini ve Ctl-GFP retrovirüs kullanarak artan virüs MOI ile başarılı bir şekilde transe GFP + B hücre alt kümelerinin sıklığında doza bağlı bir artış görüntüler. Tablo 2, 24 kuyulu veya 6 kuyulu plakalara kıyasla 96 iyi yuvarlak alt plaka kullanarak transdüksiyon verimliliğini artırmıştır. Şekil 4 başarılı CXCR4 aşırı ekspresyonu görüntüler (>40%) B-1 hücreleri ve CXCR4-GFP retrovirüs ile transdüksiyon sonrası CXCL12 in vitro doğru B-1 hücre göçü arttı, B hücre canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmadan. Şekil 5, transededilemeyen bir durumdan (GFP-) veya iki transduced durumdan (GFP+) canlı, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a hücrelerinin sıralanması için gating stratejisini görüntüler. Bu örneklerde önceden manyetik tükenme nedeniyle CD23+ B-2 hücrelerinin bulunmadığını unutmayın. Transduced live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b hücreleri de bu gating stratejisi kullanılarak sıralanabilir. Şekil 6, CD45.1+ donör hücrelerini ve CD45.2 alıcı farelerin kemik iliği ve dalaktan kurtarılan donör hücrelerde sürekli CXCR4 aşırı ekspresyonu ile hücre transferinden 17 hafta sonra aktarılır. Tablo 3, CXCR4 ekspresyonu ile donör hücre lokalizasyonu ile kemik iliği arasında pozitif bir ilişki gösterir, ancak dalak değildir. Tablo 4, kemik iliğindeki donör hücre sayısı ile anti-MDA-LDL IgM plazma miktarı arasında pozitif bir ilişki gösterir.
Şekil 1: Retroviral transdüksiyon ve evlat edinici transfer için deneysel tasarım şeması. CD45.1 allotip farelerden izole edilen periton hücreleri, biyotinylated antikorlar ve anti-biyotin mikroboncuklar kullanılarak manyetik tükenme yoluyla B-1 hücreleri için zenginleştirilmiştir. Zenginleştirilmiş periton B-1 hücreleri TLR9 agonist CpG oligodeoxynucleotid ile hücre çoğalmasını uyarmak için aktive edilir. Aktive hücreler Ctl-GFP veya CXCR4-GFP retroviral partikülleri ile transeedilir. Başarılı bir şekilde transekxed GFP + B-1a hücreleri FACS kullanılarak sıralanır ve benimsenen CD45.2 allotype host fareler e aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Periton B-1 hücreleri için zenginleştirme. CD19+ B hücreleri için periton öncesi manyetik zenginleştirme (üst) ve post-manyetik zenginleştirme (altta) temsili akış sitometri çizimleri. CD19+ F4/80- hücreler B hücreleri, CD19- F4/80+ hücreler makrofaj, CD19+ CD5orta hücreleri B-1a hücreleri, CD19- CD5hi hücreleri Ise T hücreleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Retroviral transdüksiyon B hücre aktivasyonu gerektirir. Periton B hücreleri 5:1, 10:1 veya 25:1 MOI'de Ctl-GFP retrovirüsü ile transeneden veya TLR9 agonist CpG ODN1668 varlığında veya yokluğunda transemeden bırakıldı. GFP+ B2, B1, B-1a veya B-1b hücrelerinin başarıyla transesonucu sıklığı akış sitometrisi 18 saat post-transdüksiyon ile ölçüldü. Hata çubukları ortalama ± SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CXCR4 aşırı ekspresyonunun ve in vitro B-1a göçünün arttırılmış teyidi. CXCR4 B hücresine özgü eksikliği olan ApoE-/- farelerden periton B hücreleri izole edildi ve Ctl-GFP veya CXCR4-GFP retrovirüsü ile veya transdüksiyon olmadan kültürlendi. (a) Transeedilemeyen (sol üst), Ctl-GFP transduced (sol alt) veya CXCR4-GFP transduced (sağ alt) koşullardan B-1 hücreleri üzerinde CXCR4 ve GFP ekspresyonu temsili akış çizimleri. CXCR4 pozitif kapıyı ayarlamak için kullanılan FMO-CXCR4 (sağ üst). (b) GFP+ B-1 hücrelerinde CXCR4'ün MFI'sinin transemeden (n = 1), Ctl-GFP transduced (n = 2) veya CXCR4-GFP transduced (n = 2) koşullarından ölçülmesi. (c) Transeme edilemeyen (n = 1), Ctl-GFP transduced (n = 2) veya CXCR4-GFP transduced (n = 2) Transwell yüklü b-1 hücrelerinin toplam sayısının yüzdesi olarak CXCL12 doğru göç B-1 hücreleri. (d)Başarılı bir şekilde aktarılan B hücre popülasyonu içinde canlı hücrelerin sayısallaştırılması için temsili gating stratejisi (CD19+GFP+). (e) Ctl-GFP (n = 2) veya CXCR4-GFP retrovirüs (n = 2) ile transdüksiyon sonrası canlı B hücrelerinin sıklığı. Hata çubukları ortalama ± SEM'i temsil ediyor. Bu rakam önceki yayınımızdan değiştirilmiştir4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Transe gfp+ B-1a hücrelerini sıralamak için gating stratejisi. GFP+ veya GFP-B-1a hücrelerini transeedilemeyen bir örnekten (üstte), Ctl-GFP transduced örnekten (orta) ve CXCR4-GFP transduced örnekten (altta) sıralamak için temsili akış sitometri çizimleri. Canlı, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ hücreleri olarak tanımlanan B-1a hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Transfer edilen donör hücrelerinin sayısallaştırılması. Bir PBS kontrolünden CD45.1+ CD45.2- donör hücreleri gösteren temsili akış sitometri çizimleri (üst), bir Ctl-GFP+ B-1a hücre alıcısı (orta) ve bir CXCR4-GFP+ B-1a hücre alıcısı (altta) ve kemik iliğindeki donör hücrelerde CXCR4 ifadesinin sonraki analizi (a), veya dalak (b). CXCR4 ekspresyonunun (ortalama floresan yoğunluğu, MFI) kemik iliğiveyadalaktan donör hücrelerde sayısallaştırılması (d). Alıcıların kemik iliğinde(e)veya dalak(f)içinde bulunan donör hücrelerinin sayısının ölçülmesi. *P < 0.05 veya **P < 0.01 Mann-Whitney testi ile. Hata çubukları ortalama ± SEM'i temsil ediyor. Bu rakam önceki yayınımızdan değiştirilmiştir4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Protokol adımı | Antikor | Son konsantrasyon |
| Adım 1.8 | Ter119 biotin | 100°L son hacimde 1 μL |
| CD3e biotin | 100°L son hacimde 1 μL | |
| Gr-1 biotin | 100°L son hacimde 1 μL | |
| CD23 biotin | 100°L son hacimde 1 μL | |
| NK1.1 biotin | 100°L son hacimde 1 μL | |
| F4/80 biotin | 100°L son hacimde 2,5 μL | |
| Antikor | Son konsantrasyon | |
| Adım 4.5 | CD5 PE | 100°L son hacimde 1 μL |
| IgM PECF594 | 100°L son hacimde 1 μL | |
| CD23 PECy7 | 100°L son hacimde 1 μL | |
| B220 APC | 100°L son hacimde 1 μL | |
| CD19 APCef780 | 100°L son hacimde 1 μL | |
| Antikor | Son konsantrasyon | |
| Adım 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 100°L son hacimde 1 μL |
| CD45.2 BV421 | 100°L son hacimde 1 μL | |
| CXCR4 APC | 100°L son hacimde 2,5 μL |
Tablo 1: Protokolde kullanılan antikorlar ve son konsantrasyonları.
| Durum | Toplam popülasyonun %GFP+ | CD19+ B hücrelerinin %GFP+ |
| 96-iyi yuvarlak alt plaka | 30.9% | 52.7% |
| 24-iyi plaka | 8.4% | 21.2% |
| 6-iyi plaka | 16.2% | 27.3% |
Tablo 2: Plaka optimizasyonu. 96 kuyulu yuvarlak alt tabakada 6 x 106 zenginleştirilmiş periton B-1 hücrelerinin transdüksiyonundan sonra başarılı bir şekilde toplam GFP+ hücrelerinin veya GFP+ CD19+ B hücrelerinin sıklığı (150,00'de 40 kuyu kuyu başına 0 hücre), 24 kuyulu bir plaka (kuyu başına 1 x 106 hücrede 6 kuyu), veya Ctl-GFP retrovirüslü 20:1 MOI'de 6 kuyu (kuyu başına 2 x 106 hücrede 3 kuyu).
| Değişken | Donör B-1a hücrelerinde CXCR4 MFI | |
| r değeri | p değeri | |
| # kemik iliğinde donör B-1a hücrelerinin | 0.71 | *0.014 |
| # dalak donör B-1a hücrelerinin | 0.43 | 0.18 |
Tablo 3: Donör hücreler de CXCR4 ekspresyonu ile donör hücre lokalizasyonu arasındaki ilişki. Donör B-1a hücrelerinde CXCR4'ün ortalama floresan yoğunluğu (MFI), kemik iliğindeki veya Rag1-/- ApoE-/- alıcı farelerin donör B-1a hücrelerinin sayısı ile ilişkili 17 hafta sonra evlat edinen transfer. Korelasyon katsayısı (r) ve istatistiksel anlamlılık (p) olarak sunulan veriler. Bu tablo önceki yayınımızdan değiştirilmiştir4.
| Değişken | # kemik iliğindeki donör hücrelerin | |
| r değeri | p değeri | |
| Plazma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plazma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plazma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tablo 4: Donör hücre lokalizasyonu ile anti-OSE IgM plazma miktarı arasındaki ilişki. Rag1 kemik iliğinde donör B-1a hücrelerinin sayısı-/- ApoE-/- alıcı fareler 17 hafta post-adoptive transfer anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM veya anti-1,3-dextran IgM dolaşan miktarı ile ilişkilidir. Korelasyon katsayısı (r) ve istatistiksel anlamlılık (p) olarak sunulan veriler. Bu tablo önceki yayınımızdan değiştirilmiştir4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sağlanan yöntem, kararlı ve nispeten verimli primer B-1a hücre gen idamı, in vivo adoptive transferi ve enjekte edilen hücrelerin tanımlanması ve lokalizasyonu sağlar. Hücreler hücre transferi sonrası 17 hafta saptandı ve artmış CXCR4 ekspresyonu tutuldu. Retrovirüs aracılı doğum, elelerimizdeki hücre canlılığı üzerinde en az etkiye sahip primer murine B-1a hücrelerinin %30-40 transdüksiyon verimi elde etti(Şekil 4e). Bu retroviral enfeksiyon, adenoviral enfeksiyon, nükleofection veya lipofektamin15dahil olmak üzere primer minyon B hücrelerine gen transferi için teknikleri karşılaştırıldığında Moghimi ve meslektaşları tarafından önceki bir çalışmadan elde edilen sonuçlar doğrultusunda. Ancak, CXCR4-GFP transduced B-1a hücreleri alan alıcılar da CXCR4 aşırı ekspresyon aralığı önemli ölçüde değişti bulundu(Şekil 6c,d). Bu nedenle, artmış CXCR4 ekspresyonunun artmış B-1a göçü ve kemik iliği lokalizasyonu ile ilişkili olduğunu ve artmış plazma IgM ile ilişkili olduğunu göstermek için ilişkisel analizden yararlandık (Tablo 3 ve Tablo 4).
Bu yöntemin sınırlamaları, başarılı bir şekilde transeb edilen B-1A hücrelerinin yeterli sayıda almak için gereken çok sayıda fareyi ve bir deneyden diğerine transdüksiyon verimliliğindeki değişkenliği içerir. Transdüksiyon verimliliği en az 2 x 107 enfeksiyöz partikül/mL14olmalıdır viral stokların yüksek titreleri ile geliştirilmiştir. 12−16 haftalık yaşlı farelerin kullanımı da periton B-1 hücre verimini artırabilir, periton B-1 hücre sayıları17yaşla birlikte arttıkça.
Ayrıca, transeked B-1a hücreleri tarafından salgılanan IgM miktarının, aynı Rag1-/- ApoE-/- modeline (gösterilmeyen veriler) transedönüşen olmayan B-1a hücreleri tarafından salgılanan miktardan ~5 kat daha az olduğunu da belirtmek önemlidir. Bunun nedeni, retroviral transdüksiyon(Şekil 3)öncesinde TLR9 agonist ile B-1 hücre aktivasyonu gereksinimi olabilir ve bu gereksinim, OSE'ye in vivo post-adoptive transferine yanıt olarak ikincil aktivasyonu ve IgM üretimini sınırlandırabilir. Bu nedenle, transfer B-1a hücreleri tarafından sağlam IgM üretimi gerektiren çalışmalar için, lentiviral teslimat gibi önceden B-1a hücre aktivasyonu gerektirmeyen alternatif gen transferi teknikleri, yararlı olabilir18,19, yararlı olabilir. Alternatif olarak, bu protokolde proliferasyona neden olmak için aktivasyon stratejileri içeren ancak IgM salgılayan hücrelere B-1a farklılaşması nı içermeyen değişiklikler de ikincil B hücre aktivasyonunu etkilemeden başarılı retroviral transdüksiyon için yeterli olabilir. IL-5, B-1a hücre çoğalması ve sağkalımını aracılık etmek için önemli bir sitokindir ve TLR9 stimülasyonuna etkili bir alternatif olabilir20,21.
Daha önceki çalışmalarda B220 (B hücre belirteci) veya Thy1.2 (T hücre belirteci)13,14karşı antikorlar kullanarak pozitif veya negatif seçim stratejileri ile izole dalak B hücreleri kullanılmıştır. Ancak B220+ dalak B hücreleri B-1 ve B-2 hücre alt kümelerini içeren heterojen bir popülasyondur. Ayrıca toplam dalak CD19+ B hücre popülasyonu içinde B-1 hücre sıklığı düşüktür (%1−2). Buna karşılık, bu yöntem transdüksiyon için Bir B-1 hücre kaynağı olarak periton boşluğu kullanır, B-1 hücreleri bu bölmede toplam CD19 + B hücrelerinin% 60−70 oluşur gibi22, ve periton B-2 hücrelerinin tükenmesi için bir belirteç olarak CD23 kullanır. GFP, CD19, B220, CD23, IgM ve CD5 ekspresyonuna dayalı olarak başarılı bir şekilde aktarılan B-1a hücrelerinin sonraki sıralamaları daha özel olarak tanımlanmış bir hücre tipinin aktarılmasını sağlar. Periton B-1 hücrelerini etkili bir şekilde tüketen Manyetik tükenme stratejisi T hücrelerini etkin bir şekilde tüketmiş ve F4/80 periton makrofaj frekansını ellerimizdeki ~%50 oranında azaltmıştır(Şekil 2),ancak bu kritik adımın daha fazla optimizasyonu ve sorun giderme işlemi transdüksiyon verimliliğini artırabilir. Örneğin, daha iyi makrofaj tükenmesi için daha yüksek bir biyotinylated F4/80 antikor konsantrasyonu kullanarak daha b-1a hücre transdüksiyon verimliliğini artırabilir, diğer hücre türlerinin daha az "off-hedef" retroviral transdüksiyon olurdu gibi. Transdüksiyon için 96 kuyulu yuvarlak alt plakaların kullanılması, düz alt 24-iyi veya 6-iyi plakalar yerine ayrıca önemli ölçüde geliştirilmiş transdüksiyon verimliliği(Tablo 2),ancak taşıma ve pipetleme süresini artırır.
Genel olarak, bu yöntem B-1a hücrelerine hedeflenen gen iletiminin B-1a hücre lokalizasyonunu ve fonksiyonel IgM üretimini değiştirip değiştiremeyeceğini belirlemek için yararlı bir kavram kanıtı yaklaşımı sağlar. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları, diğer proteinleri hedefleyen retroviral yapıların ex vivo teslimini ve hücre sağkalımı, göç, çoğalma veya fonksiyon da dahil olmak üzere, donör veya konak hücre süreçleri üzerindeki etkisini belirlemek için benimseyici transferi içerebilir. Donör hücreler (CD45.1+ GFP+) konak hücrelerinden (CD45.2+ GFP-) ayırt edilebildiği için, immünobeceriksiz konaklara, lenfosit eksikliği konakları yerine evlat edinilebilir transfer de bu teknikle mümkün olacaktır. Bu yöntemi kullanarak diğer kemokin reseptörlerinin hedeflenebildiği, B-1a hücre göçünün yüksek IgM üretimine izin veren nişlere doğru yöneltilmesinin koruyucu IgM düzeylerini etkili bir şekilde artırabileceği hipotezini daha da destekleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) ve R01GM100776 (T.P. Bender) Proje 3 tarafından desteklenmiştir. A. Upadhye Amerikan Kalp Derneği Ön doktora bursu 16PRE30300002 ve 5T32AI007496-20 tarafından desteklendi. Biz Joanne Lannigan, Mike Solga ve Claude Chew Virginia Flow Cytometry Core Üniversitesi onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
