Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Optogenetic Manipulation af Neuronal aktivitet for at modulere adfærd i frit bevægende mus

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61023
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Biology and Chemistry, Synthetic Biology, University of Bremen, 2Advanced Fluorescence Microscopy, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-Universität Bochum

Summary

Med optogenetisk manipulation af specifikke neuronale populationer eller hjerneregioner, adfærd kan ændres med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i frit bevægelige dyr. Ved at bruge forskellige optogenetiske værktøjer i kombination med kronisk implanterede optiske fibre, en række neuronale modulationer og adfærdsmæssige test kan udføres.

Abstract

Optogenetisk modulering af neuronale kredsløb i frit bevægende mus påvirker akut og langvarig adfærd. Denne metode er i stand til at udføre manipulationer af enkelte neuroner og region-specifikke sender frigivelse, op til hele neuronal kredsløb i centralnervesystemet, og giver mulighed for direkte måling af adfærdsmæssige resultater. Neuroner udtrykke optogenetiske værktøjer via en injektion af virale vektorer bærer DNA valg, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2). Lys bringes ind i specifikke hjerneregioner via kroniske optiske implantater, der ender direkte over målregionen. Efter to ugers restitution og korrekt værktøjsudtryk, mus kan gentagne gange anvendes til adfærdsmæssige tests med optogenetisk stimulation af neuroner af interesse.

Optogenetisk graduering har en høj tidsmæssig og rumlig opløsning, der kan opnås med høj cellespecificitet, sammenlignet med de almindeligt anvendte metoder såsom kemisk eller elektrisk stimulation. Lyset skader ikke neuronalt væv og kan derfor bruges til langsigtede eksperimenter samt til flere adfærdsmæssige eksperimenter i en mus. Mulighederne for optogenetiske værktøjer er næsten ubegrænset og gør det muligt aktivering eller lyddæmning af hele neuroner, eller endda manipulation af en bestemt receptor type ved lys.

Resultaterne af sådanne adfærdsmæssige eksperimenter med integreret optogenetisk stimulation visualiserer direkte ændringer i adfærd forårsaget af manipulation. Adfærden af det samme dyr uden lys stimulation som en baseline er en god kontrol for inducerede ændringer. Dette giver en detaljeret oversigt over neuronal typer eller neurotransmitter systemer involveret i specifikke adfærd, såsom angst. Plasticiteten af neuronale netværk kan også undersøges i detaljer gennem langsigtet stimulation eller adfærdsmæssige observationer efter optisk stimulation. Optogenetics vil bidrage til at oplyse neuronal signalering i flere former for neurologiske sygdomme.

Introduction

Gradueringen af neuronal kredsløb i centralnervesystemet og deres adfærdsmæssige resultater er vigtige for at forstå, hvordan hjernen fungerer, især i psykiatriske sygdomme og kognitive opgaver såsom læring og hukommelse. Med optogenetik kan enkelte celler eller cellepopulationer op til hele kredsløb moduleres af lys. Fælles optogenetiske værktøjer som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) er i stand til at aktivere eller lukke munden på neuroner, eller øge eller hæmme sender frigivelse på axon terminaler projicere til forskellige hjerne regioner1,2,3,4. Arch skal dog bruges omhyggeligt, da det blev påvist, at dens aktivering på præsynaptiske terminaler øger spontan sender frigivelse5. Arch er en ydre korrigerende protonpumpe, der ændrer pH-værdien inde i cellen. Denne alkaliske miljø inducerer calcium tilstrømning og forbedrer sender frigivelse5. For specifikt at modulere intracellulære signalveje kan receptorklokker, der består af et let aktivereligt optogenetisk værktøj, såsom rhodopsin eller kegle opsin, sammen med en passende G-proteinkoblet receptor, oprettes6,,7,,8. Mængden og variationen af de optogenetiske værktøjer , der er til rådighed , er steget betydeligt i løbet af det sidste årti9.

Formålet med optogenetics er at manipulere neuronal kredsløb under adfærd. Optogenetik gør det muligt for eksempel at måle akutte adfærdsændringer såsom ændringer i angstadfærd. Optogenetiske værktøjer leveres til målområder i hjernen via virale vektorer. Ved hjælp af særlige initiativtagere og smagsforstærkere eller Cre-loxP-systemet kan der sikres celletypespecificitet til udtryk for optogenetiske værktøjer (figur 1A). Der er flere genetisk modificerede muselinjer, der udtrykker enzymet Cre-Recombinase i specifikke celletyper. For eksempel, Nex-Cre mus udtrykke Cre-Recombinase i pyramideformede neuroner i cortex og hippocampus under kontrol af Nex-promotor10. Dette enzym er i stand til at invertere DNA-sekvenser, som er flankeret af loxP sider11. Derfor kan DNA-sekvensen af et dobbelt-floxet optogenetisk værktøj, som er omvendt og flankeret af loxP sider, kun transskriberes af neuroner, der besidder Cre-Recombinase, men ikke af andre neuronale typer12,13. I tilfælde af Nex-Cre mus, vil det optogenetiske værktøj udelukkende udtrykkes i pyramideale neuroner. Lysstimulation af visse hjerneregioner opnås derefter via kronisk implantation af optiske fibre direkte over regionen af interesse. Dyr kan derefter kobles til en passende lyskilde og frit opføre sig i næsten alle former for adfærdsmæssige tests.

Figure 1
Figur 1: Injektion og implantation. A) Cre-loxP system til ChR2-YFP. Dobbelt floxed optogenetisk værktøj er pakket i en adeno associeret virus (AAV) til injektion i hjernevævet. B)Sagittal syn på virusinjektion og implantation af en optisk neuronal grænseflade til/over IL-regionen i mPFC. Injektion og implantation blev udført ovenfra. Alle interesseregioner, IL, BLA og DRN, vises. C)Detaljeret visning af den implanterede optiske fiber, ærme og lyskilde. D)Spredning af blåt og rødt laserlysstimulation i gråt stof hjernevæv fra en 200 μm lysfiber (Yizhar et al. 2011). Blåt lys spreder, ved maksimum, 0,5 mm ind i vævet, rødt lys omkring 1 mm. Farvekodning: rød 50%, gul 10%, grøn 5%, blå 1%, hvis lyset når dette område. E)Koronal opfattelse af den ensidige implantation direkte over venstre IL med en 200 μm optisk fiber. IL-området har en bredde på 0,25 mm på hver halvkugle og en dybde på 0,2 mm. Blå og røde pærer er boarder af 5% lys spredning og overføres fra Yizhar et al til den rigtige størrelse. LoxP: locus af X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gult fluorescerende protein; dflox: dobbelt floxed; IL: infralimbe cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kerner; PrL: prelimbic region. Dette tal er blevet ændret fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.

Optogenetiske tilgange udnyttes, da det muliggør både høj tidsmæssig og rumlig opløsning14 og celletype specifik graduering. Derudover er det muligt gentagne gange at bruge den implanterede enhed uden yderligere behandling. Efter en stereotaktisk operation, hvor injektion af en adeno-associeret virus bærer optogenetiske værktøj og implantation af den optiske fiber udføres, mus kan komme sig i to uger. Vi har valgt en restitutionstid på kun 2 uger, fordi det er tid nok til at komme sig efter operationen og for virus til at udtrykke. Da de adfærdsmæssige eksperimenter efterfølges af immunhisemi, er vi nødt til at sikre, at mus ikke bliver for gamle under eksperimentet; ellers er vævskvaliteten nedsat. De viser ingen åbenlyse adfærdsmæssige svækkelser fra implantatet og engagere sig i typiske bur adfærd. Selvfølgelig er implantationen ledsaget af en betydelig kirurgisk læsion; derfor overvåges musene intensivt. Efter operationen skal mus være enkelt anbragt, da gruppeop husede mus har tendens til at skade hinandens friske sår og implantater. Men, boligforhold har en stor indvirkning på angst niveau af mandlige mus, som enkelt huse mus viser lavere angst niveauer15 og generelt mindre depressive-lignende symptomer16.

Kemisk eller elektrisk manipulation af hjernekredsløb mangler den høje celletype specificitet af optogenetik og har en lavere tidsmæssig og rumligopløsning 14,17,18. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål, elektrisk eller kemisk stimulation kan have forskellige fordele. Når du passerer fiber terminaler i en bestemt region også skal stimuleres, elektrisk stimulation er den bedste metode. Kemisk stimulation er et godt valg, når senderspecifikke receptorer i en hel region skal aktiveres af agonister. En anden stor fordel ved optogenetik i forhold til kemisk eller elektrisk stimulation er, at endogent, neuroner ikke er følsomme over for lys, som undgår forekomsten af bivirkninger19. Faktisk kan høje lysintensiteter fremkalde varmeeffekter8,20, men på grund af ordentlig kontrolgrupper, kan de adfærdsmæssige virkninger på grund af optogenetisk manipulation elimineres.

Undersøgelse gnaver adfærd, især med hensyn til psykiatriske sygdomme, har i høj grad forbedret med optogenetik i frit bevægelige dyr, da det gør det muligt direkte graduering af enkelt receptorer op til specifikke cellepopulationer21 og kredsløb22. Muligheden for at måle de akutte virkninger af sådanne modulationer, samt de langsigtede adfærdsmæssige virkninger efter en defineret tid23 eller efter kronisk stimulation24, giver en bred fleksibilitet af eksperimentelle design og giver meget detaljeret indsigt i hjernen kredsløb. Lysstimulering kan bruges til at modulere neuroner placeret på injektionsstedet for det optogenetiske værktøj. Når både injektion og implantation adresse samme hjerne region, celle organer og ryg fremskrettede axoner af princip neuroner og interneuroner i denne region kan målrettes3,,6,8. Men, den lette fiber kan også implanteres i en region forskellig fra den injicerede en. I dette tilfælde kan lysstimulering modulere senderudløsning ved axonterminaler i projektionsområder i det injicerede område25,26,27.

I undersøgelsen her, optogenetik bruges i kombination med eksperimenter til at analysere angst-relaterede adfærd. Angstrelaterede psykiatriske sygdomme rammer mere end en tredjedel af verdensbefolkning 28,29,30 ogforårsager en stor økonomisk byrde31. De berørte lider af en følelse af ophidselse, spænding og bekymring efterfulgt af undgåelse adfærd32,33. Disse kronisk forekommende negative følelser, som primært er fokuseret på fremtidige begivenheder34, stærkt forstyrre dagligdagen for patienter. Almindelige behandlinger som benzodiazepiner eller selektive serotonin reuptake hæmmere (SSR-præparater) er kun en succes i nogle af patienterne. En stor mængde mennesker reagerer ikke på behandlingen på alle35, viser, at den mekanisme, der ligger til grund for sådanne sygdomme er endnu ikke fuldt forstået. Den mediale præfrontale cortex (mPFC) er kendt for at spille en vigtig rolle i udviklingen og manifestation af angst21,,25,,27,,36,37,38. Specifikt, overaktivering af den infralimbe cortex (IL) region i mPFC kan være en del af angst-relaterede lidelser39,40. Det eksempel eksperiment, der er beskrevet her kunne hjælpe med at forstå, hvordan modulationer i IL-regionen af mPFC påvirke angst adfærd. Derudover kan udviklingen af nye terapeutiske strategier for angstrelaterede psykiatriske sygdomme også potentielt støttes.

2-6 måneder gamle mandlige Nex-Cre mus bruges til at udtrykke ChR2 specifikt i pyramideformede neuroner i IL-regionen i mPFC41. Nex-Cre mus har en C57Bl/6 baggrund og udtrykke enzymet Cre-recombinase specifikt i pyramideformede neuroner. Under en stereotaktisk operation injiceres dobbelt floxed ChR2-DNA i IL-regionen via adeno-tilknyttede virusvektorer. Det optiske implantat placeres direkte over interesseområdet (Figur 1B), og implantatet fastgøres med tandcement. Kontroldyr får en injektion af dobbelt floxed tdTomato-DNA i samme region for at efterligne cellespecifikke udtryk.

Dyr er gruppe-opstærret indtil dagen for operationen og bagefter er enkelt opstærret for at undgå skader fra andre mus. Mus er anbragt i individuelle ventilerede bur (IVC) stativer i TypI-L bure til enkelt opsatte mus. Den lyse-mørke cyklus følger en 12:12 h rytme, lyset fase starter ved 10 AM. Alle adfærdsmæssige eksperimenter udføres i den mørke fase, som ligner den aktive fase af gnavere. Vand og standard mad pellets er tilgængelige ad libitum. Efter to ugers restitution, som sikrer et tilstrækkeligt udtryk for ChR2 i pyramideale neuroner, bruges mus til adfærdsmæssige eksperimenter.

Open Field (OF) er en 50 cm x 50 cm firkantet labyrint med sandblæste 40 cm høje vægge. Jorden er opdelt i 16 felter, hvor den indre 4 repræsenterer midten. Den målte funktionsmåde er: 1) tid brugt i midten, 2) antal centerposter og 3) samlet tilbagelagt distance. Under dette eksperiment er der 4 forsøg på i alt 20 minutter. I forsøg 1 og 3 sker der ingen lysstimulering, og i forsøg 2 og 4 udføres en 20 Hz stimulering med 5 ms lysimpuls og 1 mW lysintensitet på 473 nm (Figur 2A). I de senere forsøg blev der taget hensyn til tilvænning til testområdet, men brugen af sham-injicerede kontroldyr angiver, hvordan tilvænning udtrykkes.

Barnes Maze er et eksperiment for læring og hukommelse. Det er en cirkulær platform, der er 92 cm i diameter og indeholder 20 lige store huller omkring omkredsen. 19 af hullerne er lukket, og under et hul en flugtkasse præsenteres. I 4 på hinanden følgende dage har mus 4 træningsforsøg for at lære, hvor flugtboksen er. På den5. dag fjernes flugtboksen, og musene testes for, hvor meget tid de har brug for til at finde det rigtige hul. Den målte adfærd er: 1) Tid, indtil flugtboksen / det korrekte hul er fundet, 2) Antal målbesøg og fejl og 3) Afstand flyttet til i flugtboksen. Lysstimuleringen i forskellige grupper sker enten under erhvervelse eller konsolidering, som finder sted på træningsdagen 1-4, eller under hentning på testdagen, som er dag 5 (Figur 2D).

Figure 2
Figur 2: Adfærdsmæssige eksperimenter med optogenetiske protokoller. A)Skematisk tegning af Open Field eksperiment med den tilsvarende lys stimulation protokol. C)Skematisk tegning af Elevated-Plus Maze eksperiment med den tilsvarende lysstimuleringsprotokol. D)Skematisk tegning af Barnes Maze eksperiment med den tilsvarende lys stimulation protokol. EPM: Forhøjet Plus Labyrint; AF: Åbent felt; BM: Barnes labyrint test. Dette tal er blevet ændret fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.

For optogenetisk stimulation skal lysintensiteten og -hyppigheden tilpasses det optogenetiske værktøj og den neuronale type, der undersøges. Den lavest mulige lysintensitet bør anvendes for at undgå beskadigelse af vævet, da flere undersøgelser har vist, at der er mulige varmeeffekter på grund af stærklysintensitet 8,20. For ChR2 anvendes en 20 Hz stimulation med en lyspuls på 5 ms almindeligt2. Da ChR2 er ret lysfølsom, er 1 mW lysintensitet tilstrækkelig. Lysstimuleringsprotokollen veksler mellem lys fra og på forsøg for direkte at måle adfærdsændringer. De eksterne rumbetingelser for adfærdsmæssige eksperimenter bør forblive stabile for hele gruppen af dyr. Vigtige betingelser at overveje er støj (husk på, at enhederne selv kan gøre støj), lugten (altid rense adfærdsmæssige opsætninger med ethanol), lysintensiteten, og eksperimentatoren. Eksperimentatoren skal altid være den samme person. Desuden bør tidspunktet på dagen for forsøgene være det samme for alle dyr i en gruppe, et par timer efter starten på den mørke fase i anlægget foretrækkes.

Målet med dette eksperiment er at øge excitation / hæmning (E / I) forholdet i IL-regionen gennem stærk aktivering af excitatoriske pyramideformede neuroner. En forbedret E / I forholdet i denne særlige cortex region er kendt for at øge angst niveauer i mus40,,42,,43,,44.

Protocol

Forsøg med forsøg på forsøg på forsøg efter forsøg på dyr er blevet godkendt af det institutionelle dyreforskningsanlæg og "Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz" ved Universitetet i Bremen (#146)

1. Forberedelse af det optiskeimplantat 9 (Figur 1C)

  1. Placer en keramisk ferrule flad side op i en bænk skruestik.
  2. Strip pelsen af en 200 μm diameter glasfiber med en fiber stripping værktøj og skæres 2-3 cm lange stykker med en keramisk fiber skriver.
  3. Placer stykke glasfiber i den keramiske ferrule med en jævn udhæng på begge sider.
  4. Placer en dråbe superlim på den flade side af den keramiske ferrule med en injektionsdyle.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
  5. Tag præimplantatet ud af bænkstingen og på den runde side af den keramiske ferrule, skær glasfiberen så kort som muligt med den keramiske fiberskriber.
  6. Præimplantatet sættes på en ferrulepolerings puck, og den runde side poleres på 4 forskellige polerpapirer ved at tegne otte 20 gange pr. papir (30 μm grus, 6 μm grus, 1 μm grus og til sidst 0,02 μm grus).
  7. Tag præimplantatet ud af ferrulepolerings pucken og skær glasfiberen på den flade side af den keramiske ferrule til den længde, der er nødvendig for implantation. Begynd at måle længden bag fremspringende superlim.
    1. For en jævn skæreflade bare ridse glasfiber 2-3 gange og derefter bryde den.
      BEMÆRK: Brug musehjjernens atlas fra Paxinos og Franklin45 til at beregne længden af implantatet. Implantatet skal ende direkte over området af interesse og tykkelsen af kraniet skal indgå i længden beregning. For at stimulere IL-regionen har glasfiberen en længde på 1,8 mm (Figur 3).

Figure 3
Figur 3: Mus hjerne atlas (Paxinos og Franklin) med repræsentativ længde af implantatet for at nå IL-regionen. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Desinficere det færdige implantat i 10 minutter i ethanol og lad det lufttørre før implantation.

2. Injektion og implantation

  1. Transporter en enkelt mus til operationsrummet og afvej den. Anæstesi med intraperitoneal (i.p.) injektion af Ketamin/Xylazine (Ketamin 0,12 mg/g, Xylazin 0,01 mg/g).
    1. Fastgør musen med venstre hånd og drej den på ryggen med hovedet holdt lavt.
    2. Målret mod den nederste nederste kvadrant af maven med sprøjten og indtast injektionskanlen 1 cm under huden.
    3. Injicer anæstesi i en langsom og konstant bevægelse i bughulen.
    4. Placer musen tilbage i sit bur og vente, indtil den når en dyb tilstand af anæstesi.
      BEMÆRK: Dybden af anæstesi kan bestemmes af fraværet af blinkende og mellem tæer reflekser.
  2. Placer musen på en varmeplade og fastgør hovedet i en stereotaktisk ramme. Fix næse og tænder i front, og ørerne på begge sider.
    BEMÆRK: Hovedet skal være lige på venstre-højre- og rostral-caudal-aksen for at sikre korrekte stereotaktiske koordinater.
  3. Analgesi med 2 mg/kg Carprofen subkutanet ind i bagsiden af musen og påfør uigennemsigtig øjensald på begge øjne for at beskytte dem mod tørring.
  4. Fugt håret på hovedbunden med en våd køkkenrulle og skær det derefter af ved hjælp af en saks. Sørg for at fjerne alt det løse hår med det våde køkkenrulle. At desinficere hovedbunden, skal du bruge en bomuldspind og tage op 0,5 ml af en tinktur indeholdende jod (Betaisodona 100 mg/ml Povidon jod og 11 mg/ml jod) og lad det lufttørre.
    BEMÆRK: I stedet for saks, også en elektrisk clipper kan bruges til korrekt hårfjerning.
  5. Hæv hovedbunden over regionen af interesse med en pincet og skær 1 cm langs midterlinjen. Brug to pincet til at skubbe huden til side for at afsløre kraniet. Sørg for også at fjerne den tynde hud over kraniet og lad det eksponerede kranium tørre.
  6. Ru kraniet til senere implantation.
    1. Påfør en 2 mm x 2 mm dråbe fosforsyre (37%) fra klæbesættet (f.eks.
    2. Fjern al syre med en bomuldspind og skyl kraniet med 1 ml 0,9% NaCl to gange.
    3. Tør kraniet med en bomuldspind og trykluft.
      Forsigtig: Fosforsyre er farligt og skal fjernes helt for at undgå vævsskader.
  7. Beregn F-Factor for individuelle koordinater.
    1. Placer en glastabakel i den stereotaktiske ramme og find den direkte over bregma.
    2. Nul koordinatsystemet og flyt glaskanulaen til lambda.
    3. BeregnF-faktor 46 med følgende formel:
      Equation 1
    4. Multiplicer F-Factor med koordinaterne fra musehjjernets atlas for at tilpasse dem til den enkelte mus.
  8. Bor et hul i kraniet til injektion.
    1. Brug de justerede koordinater til at finde placeringen på kraniet direkte over strukturen af interesse og markere det ved hjælp af spidsen af en injektion kanula ved at ridse det over knoglens overflade.
    2. Brug injektionsdylen til at bore et hul i kraniet på det markerede sted ved at dreje kanulaen på stedet. Hvis blodet siver ud af grathullet, skylles med 1 ml 0,9% NaCl og tør kraniet bagefter.
  9. Opstænt virusopløsningen i glasdylen.
    1. Placer en dråbe på 100 μL på 0,9% NaCl på kraniet og et stykke parafilm (1 cm x 1 cm) på toppen, steril side op.
    2. Anslå 1-2 μL virusopløsning på parafilmen, og sænk spidsen af glasdålen ind i den.
    3. Tilslut glaskanulaen til en sprøjte, påfør minimalt undertryk, og vent, indtil virusopløsningen er taget op af kanylen (inden for få sekunder).
      BEMÆRK: Det er vigtigt at stoppe anvendelsen af undertryk, før der opfanges luft i kanylen. Derfor vil der altid være en lille rest af virusopløsningen.
  10. Injicer virusopløsningen i den region, der er af interesse.
    1. Anstå den virusfyldte glasaula over grathullet.
    2. Sænk langsomt kanylen ned i grathullet og nul z-koordinaten, når spidsen af kanylen er på niveau med kraniet.
    3. Sænk kanylen forsigtigt til injektionsstedets laveste position.
    4. Fokuser kikkerten på menisken af virusopløsningen i kanylen.
    5. Påfør en lille mængde positivt tryk med sprøjten, indtil menisken sænkes marginalt.
    6. Lad virus spredes i 2-3 min, før du flytter glasdyslen opad til næste position.
    7. Påfør virusopløsningen for hver 200-300 μm i hele interesseregionen.
    8. Fjern glasdålen meget langsomt og kassér den efter den sidste injektion.
  11. Gør kraniet klar til implantation med vedhæftningssættetTM(f.eks.
    1. Tør kraniet med trykluft.
    2. Påfør 5 μL primer (f.eks. Optibond, 1-30% (Ethanol, Silicic syre, Glycerinphosphatdimethacrylat, 2-(2-(Methacryloyloxy)ethoxycarbonyl)benzoesäure, 2-Hydroxyethylmethacrylat)) med den tilsvarende pind og lad den tørre i 15 s.
    3. Påfør 5 μL obligation (f.eks.
      BEMÆRK: Det er vigtigt, at kraniet er tørt, og at primeren og bindingen påføres i et meget tyndt lag.
      Forsigtig: Kig ikke direkte ind i UV-lyset, da UV-lys kan skade øjnene.
  12. Placer implantatet direkte over området af interesse.
    1. Fastgør implantatet i den tilsvarende holder.
    2. Tør kraniet med trykluft.
    3. Placer spidsen af glasfiberen direkte over grathullet og sænk det forsigtigt.
    4. Stop sænke implantatet, når den resterende pære superlim rører kraniet. Tryk ikke på kraniet!
      BEMÆRK: Hvis injektionen og implantationen foretages i forskellige områder (f.eks. dorsale raphe og hippocampus), bores alle de nødvendige huller efter påføring af fosforsyre, men før 2-komponentvedhæftningen, skal du følge anvisningerne som tidligere beskrevet (trin 2.8-2.14).
  13. Fastgør implantatet.
    1. Tjek om kraniet stadig er helt tørt.
    2. Påfør flydende tandcement (f.eks Gradia direkte flo) omkring implantatet og i det omkringliggende område og hærde i 20 s med UV-lys (420-480 nm).
      BEMÆRK: Mængden af tandcement afhænger af det frie kranieområde. Hele kraniet skal være dækket af dental cement.
    3. Påfør yderligere to lag cement og helt fylde den frie og tørrede kraniet område. Hærde hvert lag med UV-lys (420-480 nm).
  14. Gør operationen færdig.
    1. Der påføres 0,5 g jodsal (Betaisodona 100 mg/ml povidonedodi og 11 mg/ml jod) ved hele såret.
    2. Injicer 0,1 ml glukose opløst i 0,9% NaCl subkutigt i nakken for hurtig helbredelse.
    3. Slip næse- og ørefikseringen, bring musen ind i et nyt bur og læg den under en varmelampe for at undgå tab af kropsvarme.
    4. Når musen vågner, bringe det tilbage i anlægget.
    5. Tjek dens helbredstilstand mindst en gang om dagen. Udfør passende foranstaltninger, hvis mus udviser dårlige forfatninger (f.eks. sikre postoperativ analgesi med Carprofen i op til 3 dage, hvis musene viser tegn på smerte).
      BEMÆRK: Efter to ugers restitution kan mus bruges til adfærdsmæssige eksperimenter.

3. Opsætning af et nyt eksperiment (Eksempel ChR2 stimulation og Open Field)

  1. Pulser
    1. Programmer pulseren (f.eks. Prizmatix) til let stimulering.
    2. Åbn softwaren, og vælg den USB COM-port, som lyskilden er tilsluttet.
    3. Vælg Vælg driftstilstand (3) | Udfør pulssekvensen efter udløserEN HIGH, og stop derefter, når LOW tillader en ekstern software at styre lyskilden.
    4. Programmer lysprotokollen. For en 20 Hz stimulation med 5 ms lys puls: Vælg TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms og P2D = 0 ms.
    5. Tryk på Start sekvens. Denne status forbliver, indtil forsøgene er færdige.
      BEMÆRK: Pulser-softwaren (Prizmatix Pulser) skal lanceres før videosporingssoftwaren. ellers kan videosporingssoftware ikke genkende enheden.
  2. Videosporingssoftware (f.eks.
    1. Opret et nyt eksperiment ud fra en foruddefineret skabelon.
      1. Åbn softwaren, gå til Filer ,vælg Ny fra skabelon. Vælg Anvend en foruddefineret skabelon.
      2. Vælg Live tracking og vælg kameraet ved at trykke på Source og bekræfte den tilsluttede Basler GenICam.
        BEMÆRK: Kameraets livebillede vises nu i vinduet øverst til højre.
      3. Tryk på Næste og vælg det dyr, der skal registreres( Gnavere, Mus).
      4. Tryk på Næste, og vælg arenaskabelonen Open Field, firkantet. Vælg zoneskabelonen Center, Kant, Hjørner, og bekræft med Næste.
      5. Bekræft 1 emne, der skal spores med Næste.
      6. Vælg Centerpunkt, næsepunkt og halebase, og bekræft dyrefarven sammenlignet med baggrunden som mørkere med Næste.
      7. Bekræft den anbefalede prøvehastighed på 12,5 med Næste, og afslut trinnet.
      8. Navnd eksperimentet passende og vælg en placering for at gemme.
    2. Definer de eksperimentelle indstillinger.
      1. Gå til Opsætnings- og eksperimentelle indstillinger. Vælg Center-point, næsepunkt og hale-base detektion som Sporede funktioner.
      2. Vælg Brug af prøvekontrolhardware, og gå til Indstillinger.
      3. Vælg Noldus USB-IO boks og bekræft med Ok.
      4. Vælg Brugerdefineret hardware som enhedstype på TTL-porten, som er tilsluttet pulserenheden, og bekræft med Ok.
    3. Definer arenaindstillingerne.
      1. Gå til ArenaIndstillinger, og vælg Indstillinger for Arena 1.
        BEMÆRK: Kameraet åbner nu automatisk et baggrundsbillede.
      2. Bekræft billedet med Grab.
      3. Tilpas de foruddefinerede zoner til den virkelige arena ved at ændre deres størrelse. Brug pilen og de to symboler til højre. Hvis nogle zoner er unødvendige, skal du slette dem.
      4. Tryk på 1. Tegn skaler for at kalibrere og trække en linje fra det ene hjørne af labyrinten til det andet. Indtast længden af den reelle afstand i cm.
      5. Gentag det for den anden akse.
    4. Test, om lysstimuleringen virker.
      1. Gå til Arena - Hardware Mapping, og vælg Test på den grå bjælke.
      2. Vælg Kommandooutput 1 Høj, og tryk på Test.
        BEMÆRK: Der skal være lys, der udsender fra enden af den optiske fiber. Når du vælger Output 1 Lav og Test, skal stimuleringen stoppe.
    5. Definer indstillingerne for prøvekontrol i 20 minutters eksperiment. Sæt forsøg Off1, On1, Off2 og On2 til hver være 5 minutter lang.
      1. Gå til Indstilling af prøvekontrol, og vælg Spor varighed 30 minutter.
      2. Forbered hovedreglen ved at justere betingelsen: Tid til 20 minutter ved at vælge Indstillinger, og skift 30 til 20 minutter. Bekræft med Ok.
        BEMÆRK: Betingelsen for start spor bør være, når motivet er i arena i 2 sekunder. På den måde vil systemet automatisk begynde at spore, når musen er i arenaen.
      3. Opret en underregel for lysstimulering: Gå til Strukturer, mere , og vælg Underregel.
      4. Giv det et navn, såsom lys stimulation protokol.
      5. Placer den under hovedreglen, og spred de to bokse ud ved at vælge det blå område med muse courseren.
      6. Gå til Betingelser, Tid og give det et navn som lys på 1.
      7. Juster Betingelse er opfyldt med efter 5 minutter. Bekræft med Ok.
      8. Placer boksen direkte bag feltet Regel begynd af underreglen ved at trække den til den sorte linje.
      9. Gå til handling | Brugerdefineret hardware og navngive det: lys PÅ 1.
      10. Vælg Handling, der skal udføres som Output 1 Høj, og bekræft med Ok.
      11. Placer boksen direkte bag feltet Betingelse.
        BEMÆRK: Nu efter 5 minutter af forsøget lyset stimulation bør starte.
      12. Gentag trinnene for at definere tidstilstanden Efter 5 minutter og handlingen Output 1 Lav for at stoppe lysstimuleringen efter yderligere 5 minutter.
      13. Gentag trinnene igen for at programmere et andet lys fra og lys Ved prøveversionen.
      14. Gå til Strukturer | Underregelreference, og kontroller, at referencen tilhører den korrekte underregel.
      15. Vælg Startbetingelser som Uden forsinkelse og Stop betingelser som Udfør én gang pr. start-betingelse. Bekræft med Ok.
      16. Placer referenceboksen mellem handlingsboks 1 og betingelsesboks 2 i hovedreglen, og tegn en linje fra Handling - start spor til reference .
        BEMÆRK: Nu starter hovedreglen direkte underreglen, når sporet startes.
    6. Definer registreringsindstillingerne for at vise systemet, hvad det skal spore.
      1. Gå til Registreringsindstillinger, og vælg Registreringsindstillinger 1.
      2. Placer en testmus i arenaen, og vælg Automatiseret opsætning.
      3. Vælg Gnaver som dyr type og bruge musen curser at tegne en boks omkring musen i arenaen. Bekræft resultaterne OK? spørgsmål med Ja.
    7. Definer forsøgslisten for alle forsøgsdyr, der skal spores.
      1. Gå til prøveliste, og planlæg alle dyr, der skal optages i dag: Vælg tilføj forsøg, og vælg et tal.
      2. Vælg alle de betingelser, der er defineret før for hver mus.
      3. Navngerne dyre-id'et og behandlingen korrekt for senere at forenkle analysen.
        BEMÆRK: Dyre-ID'et er irrelevant for systemet og kun vigtigt for senere dataanalyse af eksperimentatoren. Gruppering i gruppen Behandling og Kontrol er vigtig for systemet at vide, hvordan man grupperer og sammenligner alle sporene i senere analysetrin.
    8. Gå til Anskaffelse og start med eksperimentet.

4. Open Field eksperiment (angst)

  1. Bring den eksperimentelle mus til adfærdsmæssige rum lige før eksperimentet for at sikre en ordentlig grad af angst.
    BEMÆRK: De adfærdsmæssige eksperimenter bør udføres i den mørke fase, når mus er vågne, og altid på samme tid slot for at sikre sammenlignelighed.
  2. Par musen via et ærme til lyskilden ved at trykke den forsigtigt på nettet af buret.
  3. Placer den i et ventebur med frisk strøelse i 10 minutter for at få akklimatiseret til lyskablet.
  4. Start anskaffelse ved at trykke på knappen Start i videosporingssoftwaren (f.eks.
  5. Overfør musen fra venteburet ind i venstre øverste hjørne af det åbne felt. Fjern armen inden for 2 sekunder for at undgå at spore en arm i stedet for musen.
  6. Lad det visuelle felt af musen under eksperimentet og bevare roen.
  7. Efter 20 minutter, når eksperimentet er færdigt, skal du fjerne musen fra labyrinten, afbryde lyskablet og sætte det tilbage i sit hjem bur.
  8. Bring musen tilbage til anlægget.

5. Barnes Maze (læring)

  1. Bring alle eksperimentelle mus ind i adfærdsrummet omkring 1 time før eksperimentet.
  2. Forbered Barnes Maze ved at lukke alle huller undtagen én, hvorunder en flugtkasse er placeret. Placer en væg af karton i midten af platformen, som er startområdet for musen.
  3. Tilslut en mus til lyskilden (ærme på et let kabel) ved begge implantater.
  4. Placer musen direkte ind i midten af Barnes Maze ind i væggen af karton, som forhindrer musen i at løbe rundt, før forsøget starter.
  5. Tryk på Start i videosporingssoftwaren (f.eks.
    BEMÆRK: Softwaren sporer musen, indtil det korrekte hul er nået, men vær forberedt på at stoppe forsøget manuelt, hvis softwaren ikke genkender hulovergangen.
  6. Tag musen ud af labyrinten og fjern forbindelsen til lyskablet.
    BEMÆRK: Hvis dette er en træningsdag med flere forsøg pr. mus, skal du lade musen være i venteværelset ved siden af adfærdsrummet, indtil den næste træningssession starter. Hvis dette var testdagen med kun én testversion pr. mus, skal du bringe musen tilbage til anlægget.

6. Dataanalyse (eksempel på data om åbne felter med 4 prøveversioner, der kan skelnes fra)

  1. Videosporingssoftware (f.eks.
    1. Definer de eksperimentelle grupper og forsøg i dataprofilen.
      1. Gå til Dataprofiler til venstre, og vælg Behandlet vs. Kontrol.
      2. Gå til Indlejring i det nye vindue i midten af venstre, og vælg Tilstand for prøvekontrol.
      3. Vælg tilstandsintervallet fra elementhandlingen: Start Spor til elementhandlingen: Lyset tændes 1.
      4. Placer indlejringsboksen mellem filterboksen Behandling og den tilsvarende resultatboks.
        BEMÆRK: Dette definerede interval er Off1, som beskriver de første 2,5 minutter af forsøget, hvor der ikke er lysstimulering.
      5. Gentag trinene for intervaller On1 (fra element Handling: lys går på 1 til elementet Handling: lys går ud 1), Off2 (fra elementet Handling: lys går ud 1 til elementet lys går på 2) og On2 (fra elementet Handling: lys går på 2 til elementet Handling: stop spor).
      6. Gentag de 4 intervaller for kontrolfiltergruppen.
        BEMÆRK: Hver indlejringsboks har brug for sin egen resultatboks med navnene Off1, On1, Off2, On2. Nu er både behandlings- og kontrolgruppen opdelt i 4 forskellige lysstimuleringsforsøg, som analyseres separat.
    2. Definer de parametre, der skal analyseres i analyseprofilen.
      1. Gå til Analyseprofiler til venstre, og vælg I zoner.
      2. Vælg den afhængige variabel i zone, og vælg Centrer som zone.
      3. Dobbeltklik på I midten og vælg et af de valgte punkter, og vælg kun i midten.
      4. Før du forlader vinduet, skal du gå til Prøvestatistik og vælge Hyppighed, Akkumuleret varighed og Ventetid til først.
      5. Tilføj den flyttede afhængige variabelafstand.
        BEMÆRK: I Gruppestatistik skaldu vælge, om standardfejlen eller standardafvigelsen skal bruges som fejl. Med denne profil er dataene for Tid, der er brugt i center, Centerposter og Samlet distance flyttet, tilgængelige.
    3. Uddrage data
      1. Gå til Resultater, og vælg Statistik og diagrammer.
      2. Tryk på Beregn for at se de analyserede data.
        BEMÆRK: Forsøgsstatistikken giver oplysninger om hver enkelt mus og gruppestatistik analyserer middelværdien og fejlen for begge grupper, opdelt i 4 forsøg med det tilsvarende søjleplot.
      3. Tryk på Eksportér data, og vælg prøvestatistikken og den placering, der skal gemmes.
        BEMÆRK: De eksporterede data gemmes som en Excel-fil og med individuelle værdier for hver mus. I denne Excel-fil hjælper Animal-ID med at identificere musene.
      4. Gå til Heatmap Visualization og tryk Plot Heatmaps.
      5. Vælg Forsøg til højre for at se individuelle heatmaps for hver mus og prøveversion.
      6. Gør et højreklik på musen og eksportere heatmaps som billeder.
  2. Plotte
    1. Åbn regnearksfilen ved computeren, og beregn middel- og standardfejl (SEM) for alle 4 forsøg i hver målt tilstand og gruppe.
    2. Generér grafer i et statistikprogram (f.eks.
      1. Kopier midlerne og SEM i den korrekte rækkefølge fra regnearksfilen til Sigma Plot. Rækkerne skal indeholde data for Off1, On1 etc. og kolonnerne indeholder trial, mean og SEM som hoveder.
      2. Marker alle tre kolonner, og gå til Opret diagram.
      3. Markér feltet Søjle, og vælg ikke-grupperede søjler med fejl (øverste række, tredje boks).
      4. Bekræft med Udfør for at åbne en ny diagramside.
      5. Mærl hele grafen, og gå derefter til Startside, markér feltet Diagram til venstre, og tryk på Eksportér. Vælg en destinationsmappe, og vælg MetaFile (*.wmf) som format.
        BEMÆRK: .wmf-formatet kan behandles senere i en grafisk software som CorelDraw.
    3. Beregn statistik for indhentede data.
      1. Kopier rådata fra regnearket (Fra1, On1 osv.) til enkelte kolonner i Sigma Plot.
      2. Markér de kolonner, der skal sammenlignes, og gå til Analyse, vælg t-test , og tryk på Kør.
      3. Bekræft dataformatet Raw med Næste, og kør testen med Udfør.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at måle ændringer i adfærden af genetisk modificerede mus under en optogenetisk eksperiment. Optogenetisk manipulation sker ved injektion af en adeno associeret viral vektor. Lysstimulation i frit bevægende mus er muligt via implantation af en lys fiber direkte over området af interesse.

I figur 4præsenteres resultaterne af et optogenetisk eksperiment. En stærk aktivering af excitatoriske pyramideformede neuroner i IL-regionen via ChR2 øget angst-relateret adfærd i Open Field. ChR2 blev injiceret i IL-regionen i mPFC i Nex-Cre mus for udtryk i pyramideale neuroner (Figur 4A). Under to angsttest stimuleres Open Field (Figur 4B,C) og den nyhed undertrykte fodringstest (Figur 4F,G), ChR2 med blåt lys og aktiveres pyramideformede neuroner. Som kontrol fik en anden gruppe mus en injektion af fluorophore tdTomato i stedet for ChR2 (Figur 4D,G). I et sådant eksperiment, er angst defineret som undgåelse af lysere centrale område. Mus viser en iboende undgåelse af åbne områder, fordi de er bekymrede for rovdyr.

I Open Field eksperiment, vist i figur 4B, mus udført 4 forsøg på 5 minutter hver. I forsøg 1 og 3 opstod der ingen lysstimulering (Off1,2) og i forsøg 2 og 4 blev der udført blåt lysstimulering med 20 Hz (5 ms lysimpuls) og 1 mW-intensitet (On1,2). Heatmaps viser, at i den eksperimentelle gruppe, centret varighed varierede mellem Off og On forsøg. Under lysstimulering bliver mus fortrinsret i grænseområdet. Kontrol dyr foretrækker også grænsen, men ændrer ikke deres adfærd ved lysstimulering. I figur 4Cvises de vigtigste adfærdsmæssige målinger under open field-eksperimentet for forsøgsgruppen. Hvis dataene bestod Shapiro-Wilk-testen for normalitet, blev statistikkerne udført med en uafhængig tosidet t-test. Hvis normalitetstesten mislykkedes, blev Mann-Whitney-Rank Sum testen brugt som ikke-parametrisk alternativ. For disse former for eksperimenter, en inden for gruppen sammenligning blev valgt til at undersøge, om lys stimulation direkte kan ændre angst adfærd over tid, uafhængigt af baseline angst af eksperimentelle og kontrol dyr. Centrets varighed faldt betydeligt under begge lysstimuleringsforsøg, hvilket indikerer øget angstniveau. Den samlede afstand flyttet blev ikke ændret, viser, at locomotor adfærd ikke blev påvirket. Antallet af centerindgange blev øget, men ikke væsentligt. I figur 4Dvises data for kontrolgruppen. Kontroldyr viste ingen adfærdsændringer mellem Off og On-forsøg i nogen af de analyserede parametre, hvilket viste, at lysstimulering eller implantation ikke forårsagede de observerede virkninger. Alt i alt viser denne test øget angst under lysstimulering af IL pyramideale neuroner via ChR2.

I figur 5vises dataene for et mislykket optogenetisk eksperiment for Den Forhøjede Plus-labyrint. Under Elevated-Plus Maze eksperiment, som præsenteres i figur 5A, mus afsluttet 6 forsøg på 3 minutter hver. I forsøg 1, 3 og 5 blev der ikke udført lysstimulation (Off1, Off2, Off3) og i forsøg 2, 4 og 6, blåt lysstimulering med 20 Hz (5 ms lysimpuls) og 1 mW intensitet blev udført (On1, On2, On3). I disse eksemplariske resultater var længden af den optogenetiske protokol og selve labyrintens konstruktion ikke egnet til den transgene muselinje. I figur 5Bkan det ses, at flere mus gled ud af labyrinten med deres rygpoter eller endda faldt ned. Da dette skete, mus fik en ny chance for at udføre EPM en dag senere. Hvis de faldt ned igen, blev de udelukket fra analysen. Når mus gled ud flere gange, men formåede at blive på labyrinten, data blev analyseret normalt. Ikke desto mindre skal dataene fortolkes meget omhyggeligt, og kontroldyrene får større betydning. Nex-Cre mus havde motoriske vanskeligheder med at blive på de smalle åbne arme. For at undgå dette, små vægge, med en højde på 1 cm, ville have hjulpet til et sikkert greb om ryggen poter på armene af labyrinten. Både heatmaps og graferne viser, at eksperimentelle, samt kontrol mus, begyndte at undgå de åbne arme fra forsøg 2 (On1) på (Figur 5C-E). Tiden på de åbne arme er betydeligt reduceret for begge grupper, som er de åbne arm poster. Analyse af den eksperimentelle gruppe opnåede kun data, der implicerer en stor angstbaseret effekt af lysstimuleringen, da tiden på den åbne arm og åbne armindgange reduceres betydeligt under On1-forsøget. Men når man sammenligner disse data med kontrolgruppen, som viser den samme adfærd, bliver det klart, at den observerede adfærd ikke er medieret af den optogenetiske stimulation, men ved at undgå de åbne arme i almindelighed på grund af tilvænning til labyrinten. Disse data understreger vigtigheden af en korrekt kontrolgruppe for at skelne mellem adfærdsmæssige effekter medieret af optogenetisk stimulation og mulig adfærdsmæssig tilpasning. Også, denne data kaster lys over betydningen af korrekt tilpasning af en eksperimentel opsætning, der passer til den specifikke mousse linje og eksperimentelle spørgsmål.

For at validere og styrke indsamlede adfærdsdata fjernes hjerner af mus efter det sidste eksperiment for at kontrollere for den korrekte injektion og implantation (Figur 6). Hjerner er fastsat i 4% paraformaldehyd og fjernet fra kraniet. Hjerner er dehydreret i 30% saccharose i 1-2 dage og kryosliced bagefter. De 40 μm tykke koronale hjerneskiver vaskes og monteres på superfrostmålsdias med et monteringsmedium, der indeholder DAPI, som pletter cellekerner. Dette gør det muligt at identificere målområder i koronale skiver. Fluorescens af YFP-tag eller tdTomato selv angiver placeringen af virus injektion. I figur 6B præsenteres de eksemplariske injektionssteder for ChR2-YFP til venstre (gul) og tdTomato til højre (rød). Ved hjælp af en skabelon, tilpasset fra Paxinos og Franklin45 mus hjernen atlas, kan IL-regionen identificeres. I begge dias udtrykkes det optogenetiske værktøj i IL-regionen, men også i tilstødende hjerneregioner. For en korrekt fortolkning konsulteres spredningen af blåt lys i hjernevæv8 (Figur 1D,E). Det kan ses, at det blå lys vil nå DP-regionen under IL med kun mindre end 5% af den oprindelige 1 mW lysintensitet ved fiberspidsen (Blå linje i figur 1D)8. Derudover kan en lille mængde lys gå opad til PrL-regionen på grund af back-scattering47. Derfor kan man sige, at IL-regionen er belyst mest, men tilstødende regioner som DP og PrL-regionen kan også være lidt stimuleret. Derfor er IL-celle specifik stimulering ikke garanteret, og immunhiskemisk analyse af de tilstødende regioner bør udføres for at se, om aktiviteten af PrL- og DP-celler moduleres via lys. I figur 6Cvises en anden vigtig kontrolkontrol: specificiteten af Nex-Cre-muselinjen. Via antistof farvning mod de to celletyper i IL-regionen, glutamatergic princip neuroner og GABAergic interneurons, Det kan ses, at ChR2-YFP udtryk kun forekommer i glutamatergic neuroner og ikke med GABAergic dem.

Alt i alt viser vores eksperimenter, at med optogenetisk manipulation under adfærdstest, kan ændringer i angst-relateret adfærd observeres. Ved at bruge mere end én test for den samme adfærd, kan en pålidelig konklusion drages. Desuden bekræfter immunhisistokemisk analyse de opnåede data. Vores eksperimenter tyder på, at den specifikke aktivering af pyramideale neuroner i den infralimbic cortex øget angst-relaterede adfærd i visse analyser.

Figure 4
Figur 4: Optogenetisk aktivering af IL pyramideformede neuroner øger angst adfærd. Lysstimulering under forsøg: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A)Skematisk tegning af injektions- og implantationsstedet for ChR2-YFP eller tdTomato til IL. Under eksperimentet aktiveres pyramideuroner i IL-regionen i mPFC af ChR2. Saggital hjerne skiver tilpasset fra Paxinos og Franklin mus hjerne atlas, saggital: lateral o,6. B)Open Field labyrint med lys stimulation protokol (20 min med 4x5 min skiftevis Off og On forsøg; venstre) og varme kort over eksemplarisk ChR2-injiceret (EXP) og tdTomato-injiceret (CT) mus i alle 4 forsøg af forsøget (højre). EXP dyr bruger mindre tid i midten af OF, når stimuleret med blåt laserlys. For CT-dyr varierer den tid, der bruges i midten, ikke mellem let off og on-forsøg. C) Gruppedata for EXP-dyr i OF, n=11. Mus bruger betydeligt mindre tid i midten af OF, når stimuleret med blåt lys (Off1 39,49±6,9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Afstand flyttes ikke påvirkes (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # af center poster falde med tiden, men viser ingen væsentlige forskelle (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D)Gruppedata for CT-dyr i OF, n=15. Tid mus tilbringer i midten af OF, den afstand flyttet, # af center poster ændrer ikke mellem lys Til og Fra forsøg (Tid i midten Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Afstand Fra 1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; # af center poster Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-mus viser signifikant højere baseline angst (Off1 EXP: CT, MWRS, p = 0,005, **). Værdier er middelværdi±S.E.M. * angiver signifikante forskelle (p≤0,05), ** angiver signifikante forskelle (p≤0,01). t-test altid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbe cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kerner; AF: Åbent felt; CT: kontroldyr EXP: forsøgsdyr L: lys. Dette tal er ændret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: EPM-eksperimentet viste ikke adfærdsmæssige effekter i Nex-Cre-mus. Lysstimulering under forsøg: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A)Forhøjet-Plus Maze med lys stimulation protokol (18 min, 6x3 min, skiftevis Off og On forsøg). B)Gruppedata for mus, der "glider af" er inkluderet i dataene, i alt n=23. Nex-Cre mus havde en tendens til at glide ud af den åbne arm med deres ryg poter, uafhængig af den eksperimentelle gruppe (venstre). Kun mus, der blev på labyrinten i alle 6 forsøg, blev overvejet i senere analyser. Slip off's i den første Off1 fase er grund til senere undgåelse af de åbne arme (Off1 EXP 1,63±0,6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Cirkeldiagram (til højre) viser mus, der falder ned fra labyrinten i løbet af 18 min med 42,42%. Kun 57,57% afsluttede eksperimentet. C)Heat kort over eksemplariske EXP og CT mus i alle 6 forsøg med forsøget. Begge grupper viser et fald i åben arm varighed efter Off1 retssagen. D)Gruppedata for EXP-dyr i EPM, n=12. Tid brugt i de åbne arme faldt betydeligt i løbet af de første to forsøg og konstant bagefter (Off1 73,91±12,22 s, On1 36,15±14,65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Den tilbagelagte afstand påvirkes ikke (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm. Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). Mængden af åbne armindgange falder betydeligt fra 1 til On1 og forbliver derefter konstant (Fra1 8,08± 1,08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Fra1:On1, t-test, p=0,002, **). Den tid, der bruges i midten af EPM falder langs forsøg, men viser ingen væsentlig forskel fra Off til On retssag (Off1 41,71±5,34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E)Gruppedata for CT-dyr i EPM, n=11. CT-data viser de samme betydelige fald som EXP-data, hvilket indikerer, at eksperimentet ikke har fungeret korrekt (Tid i åbne arme Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Afstand 1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm; Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Åbne armposter Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0,01, *; Tid bruger i centrum Off1 35,89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Værdier er gennemsnitlige ± S.E.M. * angiver signifikante forskelle (p≤0,05), ** angiver signifikante forskelle (p≤0,01). t-test er altid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Forhøjet Plus Labyrint; CT: kontroldyr EXP: forsøgsdyr OA: åbne arme. Dette tal er ændret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Injektionsside af ChR2 og tdTomato i IL- og Nex-Cre-specificiteten. A)Skematisk tegning af implantationsstedet på koronale hjerneskiver ved AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, med ensidig injektion og implantation (tilpasset fra mus hjerne atlas, Paxinos og Franklin, Bregma +1.54 mm). B)Eksemplariske injektionssteder af ChR2-YFP (venstre, gul) og tdTomato (højre, rød) fusioneret med DAPI farvede cellekerner (blå) i Nex-Cre mus. Skalabar 1 mm. Indlæg viser høj forstørrelse af IL-regionen. Skalabar 150 μm. Hvide bokse angiver placeringen af indlæg. C)Øverste række: konfokale billeder af den venstre IL-region af en Nex-Cre-mus, der er plettet med CamKII som markør for glutamatergic neuroner (blå) og ChR2-YFP (gul) eller Gad67 som markør for GABAergic neuroner (grøn), af en Nex-Cre-mus. Nederste række: colocalization af ChR2-YFP (gul) med CamKII (venstre, blå), men ikke med Gad67 (højre, grøn), viser specificitet af Nex-Cre mus for glutamatergic neuroner. Skalabar 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbe cortex; DP: dorsal peduncular cortex. Dette tal er ændret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Brug af lys til at manipulere neuronal signalering har været den foretrukne metode i næsten et årti nu. Siden 2005 er antallet af offentliggjorte artikler om udvikling af nye optogenetiske værktøjer4,6,8,14,49,,50,51 ogundersøgelser, hvor sådanne værktøjer anvendes til at undersøge hjernekredsløb21,23,40,43,52,steg kraftigt. På den ene side, med den enorme mangfoldighed af injicerbare optogenetiske værktøjer, implantation varianter, transgene muselinjer og adfærdsmæssige eksperimenter, muligheden for eksperimenter er mangfoldig og ubegrænset. På den anden side er muligheden for at lave fejl i valget af forsøgsbetingelser meget høj, og forsøgene er så specifikke, at sammenligneligheden med andre undersøgelser ofte er vanskelig.

Kritiske trin
Et vigtigt kritisk skridt i denne protokol er korrekt planlægning. Valget af det optogenetiske værktøj bør svare til det videnskabelige spørgsmål. Er det kun nødvendigt at manipulere den samlede aktivitet af en neuron eller synapse? Så kommercielt forudsat værktøjer som ChR221,,25,,27 og Arch37 er et godt valg. Men bortset fra det, hvis en særlig neurotransmitter system eller endda en enkelt receptor bør manipuleres, en individuel receptor kimær er ofte det bedre valg3,6. Flere receptor kimærer med GPCRs, de såkaldte Opto-XRs, og retningslinjer for at producere dem er allerede tilgængelige4,50. Ud over valget af optogenetiske værktøjer er muselinjen i kombination med adfærdseksperimentet også kritisk. Forskellige baggrundsstammer, som for eksempel C57Bl/6 og BALB/cByJ, viser forskellige adfærdsmæssige fænotyper i noglehenseender 53,54. C57Bl/6 mus har en lav baseline angst og kan bruges til angstdæmpende manipulation, mens BALB/cByJ viser højere angst niveauer og er derfor mere følsomme over for angstdæmpende medicin. Derudover kan de transgene varianter af disse baggrundsstammer også variere i deres fænotype48. Med en ordentlig kombination af specifikke initiativtagere i forbindelse med en optogenetisk værktøj og transgene muselinje, kan næsten alle ønskede cellepopulation målrettes.

Et kritisk skridt under operationen er rettet mod den korrekte placering. Ved hjælp af musen hjernen atlas, passende koordinater for den forreste-posterior akse, og mediale-laterale akse, og dybden af strukturen kan etableres45. I virkeligheden har hvert kranium en lidt anden form og størrelse. Således F-faktor46 til at justere stereotaktiske koordinater er ganske vigtigt, som er den korrekte næse og øre fiksering under stereotaktisk kirurgi. Hvis hovedet af musen vippes, vil injektionsdylen ikke målrette den ønskede region af interesse.

Derudover er diameteren af injektionsdylen også kritisk. Hvis det er for lille, ingen virus kan frigives i vævet, hvis det er for bredt, kanylen vil lække virus løsning på vej til regionen af interesse. Hvis den implanterede optiske fiber ender direkte over målregionen, virusudtryk i cortex regioner ovenfor betyder ikke noget. Men hvis implantatet er placeret over andre regioner for at stimulere axon terminaler, axonerne i øvre cortex regioner vil også blive aktiveret af lys og forfalske indhentede data. Som et eksempel: IL-regionen og den prælimske (PrL) region både projekt til basal amygdala55,56, men har helt forskellige funktioner og roller i graduering af angst26,57., Hvis implantatet placeres over amygdala for at aktivere axonterminaler fra IL-regionen, og under injektionsvirusopløsningen også blev placeret i PrL på grund af den forkerte injektionsdyle, er risikoen for også at aktivere axonterminaler fra PrL meget høj.

Under udarbejdelsen af kraniet til fiksering af implantatet er den sparsomme brug af primer og binding afgørende for en pålidelig og holdbar fiksering. Hvis 2-komponent vedhæftning system ikke anvendes tyndt, kan dental cement løsne sig fra kraniet efter et par dage eller uger. Derudover skal kraniet også tørres helt, før implantatet fastgøres, da cementen ellers ikke vil fastgøre korrekt til kraniet.

Der findes også kritiske trin i den adfærdsmæssige del af denne protokol. For det første er opførelsen af labyrinten meget vigtig. I hver adfærdsmæssig opsætning findes der flere varianter i litteraturen vedrørende størrelse og form samt for selve proceduren58,59,60. Det er vigtigt at vælge en variant, der gør dataene sammenlignelige og reproducerbare. Der bør også tages hensyn til særlige krav til udnyttede muselinjer43,48. I de repræsentative data for EPM kan det ses, at flere Nex-Cre mus faldt ned fra labyrinten eller gled af flere gange (Figur 2b). For disse mus ville en labyrint med en lille væg omkring de åbne arme have været et bedre alternativ.

For det andet er det afgørende at holde alle eksterne rumforhold konstante61, ellers ville forskellige grupper af mus slet ikke være sammenlignelige. I den forbindelse er det meget vigtigt at vælge tidspunktet for eksperimentet som et tidspunkt, hvor den eksperimentelle opsætning er ledig, og eksperimentatoren altid er til stede. Endvidere bør hændelser i bygningen, såsom byggearbejde, afprøvning af systemer (brandalarm) eller rengøringsdagen for museanlægget, overvejes for at undgå interferens med de opnåede data.

Endelig er håndterings- og boligforhold afgørende for adfærdsmæssige eksperimenter. Når en implantation udføres, mus skal være enkelt ophus på grund af risikoen for skade fra andre mus. For at sikre god sammenlignelighed mellem grupper og en lav fejl inden for en gruppe skal hver mus have samme burstørrelse og berigelse. For angst-relaterede eksperimenter, enkelt boliger har nogle fordele som singe opsatte mandlige mus viser en lavere baseline angst niveau, mindre variation i deres angst niveau, og mindre depressive-lignende symptomer15,16. Gruppe husede hanmus kan være meget forskellige i deres angstniveau på grund af hierarkiet blandt musene. Udover huset er en konstant og lige håndtering af alle mus og grupper også vigtig. Sensationsprægede musen for at forbinde lyset fiber på implantatet er meget stressende. Derfor skal denne procedure være den samme for hver mus, hvilket betyder den samme teknik og den samme eksperimentator. Desuden skal tilvænningstiden i venteburet, som skal berolige musen fra den stressende forbindelsesprocedure, også have lige vilkår i varighed, strøelse og position til labyrinten. Håndteringen i musefaciliteten er også afgørende for senere adfærdsmæssige ydeevne. Forsøgs- og kontroldyr bør ikke rengøres på forskellige dage eller af forskellige mennesker, da dette også er stressende for mus. Derudover bør rengøringsdagen ikke være den eksperimentelle dag for at undgå forskelle i adfærd.

Fejlfinding
Der kan opstå flere problemer under protokollen. For eksempel, boring en helhed i kraniet under stereotaktisk kirurgi kan skade blodkarrene. Normalt, stærk blødning opstår, især over bregma og lambda. Hvis dette sker, skal du ikke forsøge at stoppe blødningen med bomuldspinde, da de har tendens til at udvide endnu mere blødning ud af beholderen på grund af deres sugelighed, i stedet, direkte skyl med NaCl.

Det kan også ske, at trykinjektion af virusopløsningen ikke virker. I dette tilfælde kan det være, at parafilm, en skurv fra burr hul eller hjernevæv, er tilstopning spidsen af kanylen. I dette tilfælde skal du fjerne kanulaen langsomt ud af hjernen uden at ændre x- eller y-aksen og bruge en pincet til at fjerne 1-2 mm af den forreste del af kanylespidsen. Før du sænker kanylen igen, test for funktionalitet ved at anvende lille mængde pres for at se, om virus kommer ud af kanylen spidsen. For at undgå forstoppelse skal du sænke kaninen med en konstant hastighed og ikke stoppe bevægelsen, før injektionssidens dybeste dybde er nået. Hvis for meget af kanylen spidsen fjernes, og diameteren er for stor, kanylen vil skade væv og risikoen for at anvende virus på én gang vil blive øget. Sørg således for, at kun den tilstoppede del af spidsen fjernes omhyggeligt.

Under adfærdseksperimentet kan opsætningen af eksperimentet i videosporingssoftwaren (f.eks. Hvis for eksempel lysudgangen ikke fungerer korrekt, kan det skyldes flere årsager. Pulseren skal åbnes, programmeres og startes, før Ethovision XT åbnes. Hardwaren skal vælges korrekt i "Eksperimentel opsætning" (trin 3.2.2.4). Hvis den forkerte IO-Box, eller andet end "Costume Hardware" er valgt, pulser enheden kan ikke styres af Ethovision. Hvis testen af lysoutputtet lykkes, men den programmerede lysprotokol i "Indstillinger for prøvekontrol" ikke fungerer under anskaffelsen, kan underreglen eller underregelreferencen være placeret forkert, eller betingelserne og handlingerne er uklare. For eksempel: Hører referencen til den korrekte underregel? Er referencen programmeret korrekt (f.eks. hvor ofte udføres underreglen)?

Derudover kan det ske, at dyret under "detektionsindstillinger" spores tilstrækkeligt, men under erhvervelsen er der prøver, hvor emnet ikke findes. I dette tilfælde skal du kontrollere, om belysningen i det eksperimentelle rum blev ændret, eller om noget producerede uønskede skygger i labyrinten. Hele bunden af labyrinten skal have samme farve, da indstillingen kun vil fungere for en bestemt kombination. Hvis uanset af hvilken grund forskellige nederste farver eller skygger ikke kan undgås, definere detektion indstilling i den mørkeste del af labyrinten.

Hvis du vil ændre indstillinger efter erhvervelsen af de første dyr, skal du ikke anvende disse ændringer i de allerede anvendte indstillinger. Duplikere dem for at justere dem. Det betyder også, at det allerede registrerede forsøg ikke længere er gyldigt til dataanalyse. I et sådant tilfælde skal du registrere alle dyr for denne eksperimentelle gruppe med de oprindelige indstillinger og oprette et nyt eksperiment bagefter, hvor de optagede videoer analyseres i stedet for live sporing. I dette "fra video"-eksperiment kan flere indstillinger bruges til analyse uden at miste sammenlignelighed mellem dyr eller endda data.

Begrænsninger og fremtidige applikationer
Denne metode til at manipulere adfærd med optogenetik i frit bevægelige dyr omfatter også begrænsninger. Under operationen er nærheden af de to implantater begrænset. Ved dobbelt implantation skal afstanden mellem de to implantater minimalt være bredden af apparatet for at holde implantatet. Apparatet skal sænke det andet implantat ind i grathullet, mens de første implantater allerede er fastgjort. En løsning til dette kan være en vinklet implantation, hvor spidsen af glasfiber kan være meget tæt, mens de keramiske ferler over kraniet har større afstand23,,55,,56,57,62,63. En ulempe ved en vinklet implantation er lysspredningen. Når fiberspidsen er skråt i stedet for fra lige over, er det stimulerede område anderledes. I tilfælde af to målregioner i umiddelbar nærhed skal der tages hensyn til den ændrede position for lysstimuleringen.

Under adfærdseksperimentet kan konstruktionen af labyrinten forstyrre det optiske kabel, der er forbundet til dyret. Nogle adfærdsmæssige tests, såsom lys-mørk boks, indeholder et indendørs område64,65, og andre labyrinter indeholder rum, som musen skal indtaste. Sådanne eksperimenter kan ikke udføres med denne opsætning. Alternativt kan et trådløst system være en mulighed22,26,66. Men heldigvis nogle labyrinter, såsom Barnes Maze, kan arrangeres på en sådan måde, at musene er i stand til at komme ind i de relevante rum67.

Ud over dem med lukkede zoner, labyrinter, der er for bred kan forårsage også problemer. Jo større området af labyrinten, jo længere kablet skal være at tillade dyret at gå til alle positioner i labyrinten. Man skal passe på, at dyret ikke er i stand til at træde på kablet eller få fat i det og bide det. En løsning for det kan være en konstruktion, der ruller op overflødige kabel. En ulempe er, at træk for at rulle kablet er svært for mus. Denne løsning ville bedre passer egnet til rotter. En anden mulig mulighed kunne være at gøre lyset stimulation på forhånd, i stedet for under forsøget, selvfølgelig er dette kun muligt, hvis en langsigtet effekt på grund af lysstimuleringopstår 23.

Sammenligning med eksisterende/alternative metoder
Alternative metoder ville være kemisk eller elektrisk stimulation under adfærd8,18. Kemiske agonister eller antagonister er i stand til at aktivere eller tavshed neuroner via specifikke receptorer og kan også manipulere enkelt neurotransmittersystemer 38,68. På den ene side, receptor-specificitet er ganske høj for kemikalier, fordi specifikke agonist eller antagonist kun aktivere visse receptorer39. På den anden side, specificitet for receptor undertyper af samme neurotransmitter gruppe er ofte utilstrækkelig. De fleste kemikalier binder sig til mindst to undertyper med forskellige sandsynligheder69. Derudover, kemikalier kan ikke skelne mellem neuronal celletyper, så længe de besidder de samme receptor typer. Ud over dette, tidsmæssige og rumlige opløsning er dårlig for kemiske manipulationer i forhold til optogenetik. Agonister eller antagonister administreres ofte oralt35 eller via systemiskeinjektioner 57,70. Hvis infusion af kemikaliet sker direkte i hjernevævet, virkninger vises hurtigere end med mundtlige anvendelser, men stadig på en langsommere tidshorisont end med lys stimulation. Som de administrerede kemikalier diffuse i hjernen og er ikke specifikke for neuronale typer eller hjerne regioner, manipulation af specifikke hjernekredsløb det ikke muligt.

Elektrisk stimulering har en højere tidsopløsning end kemisk stimulation9,14. Spredningen i neuronal væv er mindre end med kemisk stimulation og den rumlige opløsning er bedre end med kemisk stimulation. Men elektrisk stimulation mangler mulighed for specifikt at behandle forskellige neuronal celletyper eller receptor typer, som hver neuron i nærheden af elektroden vil reagere på den elektriske stimulation.

Alternative metoder til adfærd i frit bevægende mus er for eksempel elektrofysiologiske optagelser i hjernen skiver, hvor enkelt neuroner eller axoner kan moduleres med optogenetik og fremkaldte effekter kan måles via optagelse elektroder6,71. In vitro-eksperimenter giver mulighed for at undersøge det molekylære og cellulære grundlag af optogenetiske stimulationer, men har den begrænsning, at der mangler iboende forbindelse og input fra andre hjerneregioner. En anden mulighed er at bruge optogenetic i forbindelse med multiphoton imaging1,72. I dette tilfælde har mus deres hoved fast og kan bedøves eller være vågen til at løse simple opgaver.

For at udføre en vellykket optogenetisk eksperiment, en bred vifte af værktøjer og applikationer er tilgængelige i dag. Udvælgelsen af optogenetiske værktøjer og den adfærdsmæssige set-up er afgørende for at besvare specifikke forskningsspørgsmål. Hvis den rigtige kombination af værktøjer og eksperimenter er valgt, optogenetics giver mulighed for en hidtil uset, dybdegående undersøgelse af neuronal kredsløb med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette vil bidrage til at forstå og udvikle nye terapeutiske strategier for psykiatriske sygdomme og kognition.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Stor tak til prof. Klaus-Armin Narve og Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) for venligt at levere Nex-Cre mus. Også, vi takker vores video-team Yunus Dikici og Ruben Wiesner for optagelse og behandling af JoVE video til denne artikel. Desuden stor tak til Kristin Claussen for hendes voice-over og Kimberly Anne Go for korrekturlæsning af manuskriptet.

De præsenterede resultater blev opnået på Ruhr-universitetet i Bochum og videoen blev optaget på universitetet i Bremen.

Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 og DFG MA 4692/3-2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamin Sigma-Aldrich K2753-64 Anestasia
20 % Glucose AlleMan Pharma Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes Costum made Measure anxiety
Bepanthen Bayer Ophthalmic oinment
Betaisodona Monodipharma Sterilant containing iodine
Betaisodona Monodipharma Iodine oinment
Binocular Olympus SZ52, 110AL0.62x WD160 Surgery
Ceramic ferrules Thorlabs CFLC230-10 Implant
Ceramic Fiber Scribe Thorlabs CSW12.5 Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus Penn Vector Core Addgene 20298 Optogenetic tool
Compressed air Kontakt Chemie Druckluft 67 Drying of the skull
Coordinate system Stoelting Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw Graphical software version 13
Cryoslicer MICROM HM500OM Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14 Noldus Software for behavioral tracking
Exel Statistical Software
Ferrule Polishing Puck Thorlabs D50-F Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool Thorlabs T06S13 Stripping glass fiber for implant
Filter paper VWR European 516-0300 Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets Mühle Levers Höveler Nagerfutter Nutrition for the mice
Glass pipettes Harvard Apparatus GC150-10 Injection pipettes
Gradia direct-Flo Henry Schein 103322 Fluid dental cementum
Heating lamp efbe-Schott/Phillips R95E Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate Stoelting Integrated into coordinate system
Injection canula Braun 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 All injections and to bore hole into the skull
Litter T 1350 Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages Zoonlab 405 cm^2 Single housing for experiments
Optibond FL Kerr 26684E Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber Thorlabs FT200EMT Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI Prizmatix Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit Thorlabs LFCF Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit Thorlabs LF1D Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit Thorlabs LF30D Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit Thorlabs LF6D Polishing implants round side
Pulser Software Prizmatix Software for light device control
Rimadyl-Carprofen Zoetis Analgesia
Sigma Plot Software for statistics
Sleeve Thorlabs FT200EMT Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl) Braun 3570410 Rinsing of the skull
Superglue Pattex Henkel To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus Penn Vector Core Addgene 51503 Optogenetic tool
UV light KoQGHJ wireless, 1200 mW/cm^2 Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin cp pharma Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature Letters. 463, 98-102 (2010).
  2. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
  3. Spoida, K., Masseck, O. A., Deneris, E. S., Herlitze, S. Gq/5-HT2c receptor signals activate a local GABAergic inhibitory feedback circuit to modulate serotonergic firing and anxiety in mice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 111, 6479-6484 (2014).
  4. Kleinlogel, S. Optogenetic user's guide to Opto-GPCRs modified GPCRs. Frontiers in Bioscience. 21, 794-805 (2016).
  5. Mahn, M., Prigge, M., Ron, S., Levy, R., Yizhar, O. Biophysical constraints of optogenetic inhibition at presynaptic terminals. Nature Neuroscience. 19, 554-556 (2016).
  6. Masseck, O. A., et al. Vertebrate Cone Opsins Enable Sustained and Highly Sensitive Rapid Control of Gi/o Signaling in Anxiety Circuitry. Neuron. 81, 1263-1273 (2014).
  7. Oh, E., Maejima, T., Liu, C., Deneris, E., Herlitze, S. Substitution of 5-HT 1A Receptor signaling by a light-activated G protein-coupled receptor. Journal of Biological Chemistry. 285, 30825-30836 (2010).
  8. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron Primer. 71, 9-34 (2011).
  9. Masseck, O. A. A Guide to Optogenetic Applications, With special Focus on Behavioral and In Vivo Electrophysiological Experiments. HandboOk of In Vivo Neural Plasticity Techniques - A Systems Neuroscheince Approach to the Neural Basis of Memory and Cognition. Manahan-Vaughan, D. , Academic Press. 557 (2019).
  10. Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. , 611-621 (2006).
  11. Yang, Y. S., Hughes, T. E. Cre Stoplight: A red/green fluorescent reporter of Cre recombinase expression in living cells. Biotechniques. 31, 1036-1041 (2001).
  12. Schnütgen, F., et al. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse. Nature Biotechnology. 21, 562-565 (2003).
  13. Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  14. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 268-273 (2011).
  15. Palanza, P., Gioiosa, L., Parmigiani, S. Social stress in mice: Gender differences and effects of estrous cycle and social dominance. Physiology and Behavior. 73, 411-420 (2001).
  16. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415, 197-201 (2001).
  17. Masseck, O. A., Rubelowski, J. M., Spoida, K., Herlitze, S. Light- and drug-activated G-protein-coupled receptors to control intracellular signalling. Experimental Physiology. 96, 51-56 (2011).
  18. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4, (2007).
  19. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature Article. 446, 633-639 (2007).
  20. Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22, 1061-1065 (2019).
  21. Hare, B. D., et al. Optogenetic stimulation of medial prefrontal cortex Drd1 neurons produces rapid and long-lasting antidepressant effects. Nature Communication. 10, 1-12 (2019).
  22. Allsop, S. A., Vander Weele, C. M., Wichmann, R., Tye, K. M. Optogenetic insights on the relationship between anxiety-related behaviors and social deficits. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-14 (2014).
  23. Fuchikami, M., et al. Optogenetic stimulation of infralimbic PFC reproduces ketamine's rapid and sustained antidepressant actions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 8106-8111 (2015).
  24. Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. Elife. 6, 1-26 (2017).
  25. Felix-Ortiz, A. C., Burgos-Robles, A., Bhagat, N. D., Leppla, C. A., Tye, K. M. Bidirectional modulation of anxiety-related and social behaviors by amygdala projections to the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 321, 197-209 (2016).
  26. Marek, R., Xu, L., Sullivan, R. K. P., Sah, P. Excitatory connections between the prelimbic and infralimbic medial prefrontal cortex show a role for the prelimbic cortex in fear extinction. Nature Brief Communication. , (2018).
  27. Parfitt, G. M., et al. Bidirectional Control of Anxiety-Related Behaviors in Mice: Role of Inputs Arising from the Ventral Hippocampus to the Lateral Septum and Medial Prefrontal Cortex. Neuropsychopharmacology. 42, 1715-1728 (2017).
  28. Bandelow, B., Michaelis, S. Epidemiology of anxiety disorders in the 21st century. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17, 327-335 (2015).
  29. Kessler, R. C., et al. Lifetime Prevalence and Age-of-Onset Distributions of DSM-IV Disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62, 593-602 (2005).
  30. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the United States. International Journal of Methods Psychiatric Research. 21, 169-184 (2014).
  31. Andlin-Sobocki, P., Wittchen, H. U. Cost of anxiety disorders in Europe. European Journal of Neurology. 12, 39-44 (2005).
  32. Forster, G. L., Novick, A. M., Scholl, J. L., Wall, M. J. The Role of the Amygdala in Anxiety Disorders. Intech. , 61-102 (2012).
  33. Liberzon, I. Neural circuits in anxiety and stress disorders a focused review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 11, 115-126 (2015).
  34. Sylvers, P., Lilienfeld, S. O., LaPrairie, J. L. Differences between trait fear and trait anxiety: Implications for psychopathology. Clinical Psychology Review. 31, 122-137 (2011).
  35. Daws, L. C., Koek, W., Mitchell, N. C. Revisiting Serotonin Reuptake Inhibitors and the Therapeutic Potential of 'Uptake-2' in Psychiatric Disorders. ACS Chemical Neuroscience. 4, 16-21 (2013).
  36. Felix-Ortiz, A. C., et al. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron Report. 79, 658-664 (2013).
  37. Padilla-Coreano, N., et al. Direct Ventral Hippocampal-Prefrontal Input Is Required for Anxiety-Related Neural Activity and Behavior. Neuron Article. 89, 857-866 (2016).
  38. Lisboa, S. F., Stecchini, M. F., Corrêa, F. M. A., Guimarães, F. S., Resstel, L. B. M. Different role of the ventral medial prefrontal cortex on modulation of innate and associative learned fear. Neuroscience. 171, 760-768 (2010).
  39. Bi, L. L., et al. Enhanced excitability in the infralimbic cortex produces anxiety-like behaviors. Neuropharmacology. 72, 148-156 (2013).
  40. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature Article. 477, 171-178 (2011).
  41. Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
  42. Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/ inhibition in key neural systems. Genes, Brain and Behavior. 2, 255-267 (2003).
  43. Berg, L., Eckardt, J., A, M. O. Enhanced activity of pyramidal neurons in the infralimbic cortex drives anxiety behavior. PLoS One. 14, 1-19 (2019).
  44. Meunier, C. N. J., Amar, M., Lanfumey, L., Hamon, M., Fossier, P. 5-HT1A receptors direct the orientation of plasticity in layer 5 pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. Neuropharmacology. 71, 37-45 (2013).
  45. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2, Academic Press. (2004).
  46. Gore, B. B., Soden, M. E., Zweifel, L. S. Manipulating gene expression in projection-specific neuronal populations using combinatorial viral approaches. Current Protocols in Neuroscience. 435, 1-6 (2014).
  47. Stujenske, J. M., Spellman, T., Gordon, J. A. Modeling the Spatiotemporal Dynamics of Light and Heat Propagation for InVivo Optogenetics. Cell Report. 12, 525-534 (2015).
  48. Berg, L. Imbalance of excitation and inhibition within the prefrontal cortex supports anxiety behavior. Ruhr-University Bochum. , Doctoral dissertation (2019).
  49. Boyden, E. S. A history of optogenetics: The development of tools for controlling brain circuits with light. F1000 Biology Reports. 3, 1-12 (2011).
  50. Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
  51. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7, 12-23 (2012).
  52. Covington, H. E., et al. Antidepressant Effect of Optogenetic Stimulation of the Medial Prefrontal Cortex. Journal of Neuroscience. 30, 16082-16090 (2010).
  53. Lepicard, E. M., Joubert, C., Hagneau, I., Perez-Diaz, F., Chapouthier, G. Differences in anxiety-related behavior and response to diazepam in BALB/cByJ and C57BL/6J strains of mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 67, 739-748 (2000).
  54. Schmidt, M. V., Müller, M. B. Animal models of anxiety. Elsevier. 3, 369-374 (2006).
  55. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic Encoding of Fear Extinction in mPFC-amygdala Circuits. Neuron Article. 80, 1491-1507 (2013).
  56. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527, 179-185 (2015).
  57. Suzuki, S., et al. The infralimbic and prelimbic medial prefrontal cortices have differential functions in the expression of anxiety-like behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 304, 120-124 (2016).
  58. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134, 49-57 (2002).
  59. Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: A review. European Journal of Pharmacology. 463, 3-33 (2003).
  60. Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature Letter. 471, 358-362 (2011).
  61. Bouwknecht, J. A., et al. Differential effects of exposure to low-light or high-light open-field on anxiety-related behaviors: Relationship to c-Fos expression in serotonergic and non-serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus. Brain Research Bulletin. 72, 32-43 (2007).
  62. Overstreet, D. H., Knapp, D. J., Angel, R. A., Navarro, M., Breese, G. R. Reduction in repeated ethanol-withdrawal-induced anxiety-like behavior by site-selective injections of 5-HT1A and 5-HT2C ligands. Psychopharmacology. 187, Berlin. 1-12 (2006).
  63. Takahashi, A., et al. Glutamate Input in the Dorsal Raphe Nucleus As a Determinant of Escalated Aggression in Male Mice. Journal of Neuroscience. 35, 6452-6463 (2015).
  64. Klemenhagen, K. C., Gordon, J. A., David, D. J., Hen, R., Gross, C. T. Increased Fear Response to Contextual Cues in Mice Lacking the 5-HT1A Receptor. Neuropsychopharmacology. 31, 101-111 (2006).
  65. Ramos, A. Animal models of anxiety: do I need multiple tests. Trends in Pharmacological Science. 29, 493-498 (2008).
  66. Isosaka, T., et al. Htr2a-Expressing Cells in the Central Amygdala Control the Hierarchy between Innate and Learned Fear. Cell. 163, 1153-1164 (2015).
  67. Regev, L., Goshen, I. Employing Optogenetics in Memory Research. Optogenetics: A Roadmap. , 219-256 (2017).
  68. Shah, A. A., Sjovold, T., Treit, D. Inactivation of the medial prefrontal cortex with the GABA A receptor agonist muscimol increases open-arm activity in the elevated plus-maze and attenuates shock-probe burying in rats. Brain Research. 1028, 112-115 (2004).
  69. Knight, A. R., et al. Pharmacological characterisation of the agonist radioligand binding site of 5-HT2A, 5-HT2B and 5-HT2C receptors. Naunyn-Schmiedebergs Archiv of Pharmacology. 370, 114-123 (2004).
  70. Graeff, F. G., Viana, M. B., Mora, P. O. Dual Role of 5-HT in Defense and Anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21, 791-799 (1997).
  71. Cheriyan, J., Sheets, P. L. Altered Excitability and Local Connectivity of mPFC-PAG Neurons in a Mouse Model of Neuropathic Pain. Journal of Neuroscience. 38, 4829-4839 (2018).
  72. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).

Tags

Adfærd Optogenetik Mus Optisk Fiber Virus Injektion Implantation Angst Adfærd Open Field Nyhed-Undertrykt-Fodring Barnes Maze
Optogenetic Manipulation af Neuronal aktivitet for at modulere adfærd i frit bevægende mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. … More

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (164), e61023, doi:10.3791/61023 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter