Summary
重复相关非ATG相关转化产品是几种重复扩张性疾病的病原特征。所述协议的目的是使用模型系统C.elegans的行为和细胞测定来评估这些肽引起的毒性。
Abstract
C. elegans通常用于模拟由重复扩张突变引起的与年龄相关的神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 和亨廷顿舞蹈症。最近，含有重复膨胀的RNA被证明是一种新型蛋白质翻译的基质，称为重复相关非AUG依赖性（RAN）翻译。与规范翻译不同，RAN 翻译不需要启动协和，并且仅在重复超过阈值长度时发生。由于没有开始协理来确定读取帧，RAN 翻译出现在包含重复扩展序列的感知和反感觉 RNA 模板的所有读取帧中。因此，RAN 翻译将可能的疾病相关有毒肽的数量从 1 扩展到 6。到目前为止，RAN翻译已经记录在八种不同的重复扩张为基础的神经退行性疾病和神经肌肉疾病。在每种情况下，破译哪些RAN产品是有毒的，以及它们的毒性机制，是了解这些肽如何促进疾病病理生理学的关键步骤。本文提出了在模型系统C.elegans中测量RAN肽毒性的策略。首先，我们描述了测量RAN肽毒性的程序，对发育的C.elegans的生长和活力。其次，我们详细介绍了一种用于测量RAN肽在运动性上发育后、年龄依赖作用的测定方法。最后，我们描述了一种神经毒性测定，用于评估RAN肽对神经元形态的影响。这些测定提供了RAN肽毒性的广泛评估，可用于执行大规模遗传或小分子屏幕，以确定疾病机制或疗法。
Introduction
DNA重复序列的不当扩展是几种神经退行性疾病的遗传基础，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、前额痴呆症（FTD）和亨廷顿舞蹈症（HD）1。虽然这些疾病已建立细胞和动物模型，但这些条件背后的机制没有明确界定。例如，HD 是由亨廷顿蛋白 Htt2的编码序列中 CAG 重复序列的扩展引起的。由于CAG编码氨基酸谷氨酰胺，CAG重复膨胀导致在Htt内插入多谷氨酰胺或聚Q序列。 膨胀的聚Q蛋白形成长度和年龄相关蛋白聚合体，与毒性33，44相关。令人惊讶的是，最近的两项研究表明，聚Q序列的长度不是导致HD疾病发病的主要原因，这表明与多Q无关的因素也可能导致这种疾病55，6。6
一种可能的聚Q无关机制涉及一种新发现的蛋白质翻译类型，称为Repeat A分离N对AUG依赖（RAN）翻译7。顾名思义，RAN 翻译仅在存在扩展重复序列且不需要规范启动子序时发生。因此，RAN转换发生在重复的所有三个读取帧中，以产生三个不同的多肽。此外，由于许多基因还产生一个反感觉转录，其中包含扩展重复序列的反向补充，RAN翻译也发生在反意义笔录的所有三个阅读帧中。RAN 翻译共同将从扩大的含重复性 DNA 序列中产生的蛋白质数量从一个肽扩展到六种肽。迄今为止，RAN翻译已经观察到至少8个不同的重复膨胀障碍8。RAN肽在验尸病人样本中观察到，并且仅在患者进行扩大的重复99，1010的情况下。虽然这些肽在患者细胞中明显存在，但它们对疾病病理生理学的贡献尚不清楚。
为了更好地确定与RAN肽相关的潜在毒性，几个小组在各种模型系统中表示每种肽，如酵母、苍蝇、小鼠和组织培养细胞11、12、13、14、15、16。11,12,13,14,15,16这些模型没有利用重复序列进行表达，而是采用一种共变法，即消除重复序列，但保留氨基酸序列。翻译启动通过规范的ATG发生，肽通常融合到N-或C-terminus的荧光蛋白，这两种蛋白质似乎都不会干扰RAN肽的毒性。因此，每个构造都过度表示单个 RAN 肽。通过简单的测定对多细胞生物体中不同的RAN产品进行建模，以测量RAN肽毒性，对于了解不同RAN产品从每个致病的重复扩张如何导致细胞功能障碍和神经退化至关重要。
与其他模型系统一样，C. elegans提供了一个灵活而高效的实验平台，能够研究新的疾病机制，如 RAN 肽毒性。蠕虫提供了几种独特的实验属性，目前在其他RAN肽毒性模型中不可用。首先，从出生到死亡，C.elegans在光学上是透明的。这允许对RAN肽表达和定位进行简单的可视化，以及活体动物神经退化的体内分析。其次，生成RAN肽表达模型的转基因方法价格低廉，速度快。鉴于C.elegans的短三天生命周期，在一周内可以产生稳定转基因线，以细胞型特定的方式表达任何给定的RAN肽。第三，简单的表皮输出可以与基因筛选方法相结合，如化学诱变或RNAi筛选，以快速识别RAN肽毒性所必需的基因。最后，C. elegans的短寿命（+20天）使研究者能够确定衰老，这是大多数重复扩张性疾病的最大危险因素，如何影响RAN肽毒性。这种实验属性的组合在任何其他模型系统中都是无可比拟的，为RAN肽毒性的研究提供了一个强大的平台。
在这里，我们描述了几个测定，利用C.elegans的实验优势来测量RAN肽的毒性，并确定这种毒性的基因修饰剂。Codon-uns-ATG启动的RAN肽被标记与GFP，并在肌-3启动器下的肌肉细胞或非c-47启动子作用器下的GABAergic运动神经元中单独表达。对于肌肉细胞的表达，重要的是有毒的RAN肽被标记绿色荧光蛋白（GFP），或其他荧光蛋白（FP）标签，可以针对RNAi喂养载体。这是因为有毒的RAN肽表达通常阻止生长，使这种菌株不可行。使用gfp（RNAi）有条件地不激活RAN肽表达，并允许菌株维持，遗传交叉等。对于检测，这些动物从gfp（RNAi）中去除，这允许表达RAN肽和由此产生的表型。除了设计Codon-变型RAN肽表达构造的分子策略外，我们还描述了用于测量发育毒性（幼虫运动和生长测定）、发育后年龄相关毒性（麻痹测定）和神经元形态缺陷（共性测定）的测定。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 生成共性多变的 RAN 肽表达构造
- 利用同义词子共体设计单个 RAN 肽编码序列，以消除基本的重复 DNA/RNA 结构，但保留覆盖氨基酸序列。
- 按研究所需的重复长度（通常为 5-100 个重复）以商业方式订购自定义协当序列。在 5' 末端包括 HindIII 限制站点和 3' 末端的 BamHI 限制站点，以方便克隆到C. elegans表达式载体，如 pPD95.79。
注：如果大型构造的合成证明困难，则可以合成较小的构建基块序列，然后使用方向连接策略17构建成较大的重复。 - 使用标准 T4 连接方法将肽序列子克隆到C. elegans表达式向量中。
- 子克隆由PCR在RAN肽序列前生成的细胞类型特异性促进子体序列，以驱动组织特异性RAN肽-GFP表达。
- 将RAN肽构造微注入野生C型elegans的果子，使用标准方法18生成含有染色体外阵列的转基因菌株。对于共注射标记，使用了肌肉特异性RFP报告器（myo-3p：RFP （pCFJ104），尽管其他标记也可以使用。
- 使用标准的C.elegans集成筛选方法将稳定的转基因集成到基因组中19。
- 如果RAN肽是有毒的，转基因动物不能生存，饲料动物gfp（RNAi）在注射前和注射后表达细菌，以抑制有毒蛋白质的表达。
注：从gfp（RNAi）去除动物，使用下面描述的测定，使RAN肽表达可用于型比分析。
2. 测量基于RNAi的基因敲除后RAN肽的发育毒性：视频速度分析协议
- 倒注标准线虫生长介质 （NGM） RNAi 24 孔板，具有 1 mM 同丙基 β-D-1-硫酰甲酰甲酰（IPTG）和 25 μg/mL 卡白素。
- 将HT115细菌中的RNAi喂养克隆物检测到Luria肉汤（LB）+卡白霉素（25 μg/mL）加盘上，并在37°C下生长细菌24小时。 empty vector(RNAi) gfp(RNAi)
- 对于每个克隆，将单个菌体选入 1 mL LB + 卡白霉素液体介质中，在 37°C 下过夜 18 小时，同时以每分钟 250 次旋转 （RPM） 摇动。
- 发现NGM RNAI 24井的四口井，20 μL的过夜细菌培养：柱1井= gfp（RNAi）;第2列井 = （EV）RNAi;列 3⁄6 井 = RNAi 反对要测试的基因。允许RNAi细菌在室温 （RT） 下诱导 dsRNA 生产过夜。
- 使用标准次氯酸盐法将表达集成 RAN 肽转基因的成年C. elegans与第一天中的卵子分离，并将 #30 C. elegans鸡蛋分离到 NGM RNAi 24 井板的每个孔中。
- 在20°C下孵育24口井7天。
注：此孵育时间为表达有毒 C9orf72 RAN 二肽的菌株，如 PR50 或 GR50。其他菌株可能需要更短的孵育时间，以防止细菌食物来源的耗尽和随后的饥饿。 - 使用配备 DFC345FX 单色摄像机的 Leica MZ16FA 立体解剖显微镜获取传输光视频，该摄像机连接到运行 Leica AF 视频采集软件（版本 2.6.0.7266）的 Windows 兼容 PC 上。
- 使用井之间的一致视频采集设置，为每个 RNAi 条件从两个单独的井中获取两个视频。对于每个视频，使用 18.6 倍的放大倍率（自动对焦软件中的 1.49 变焦设置），以 800 x 600 像素分辨率获取 10 秒，每秒获得 13.16 帧（时间体素尺寸 = 0.076 秒）。将图像曝光时间设置为 4 毫秒。使用应变、RNAi 状况和井号立即标记每个视频。
- 通过随机化视频的顺序并将视频的名称更改为数字，使实验者对与每个视频文件关联的基因型视而不见。将此组视频另存为新文件。分析完成后，对实验者进行不盲。
- 测量每个视频中20种不同动物的"行驶距离"和每种动物的长度，检查每个RNAi状态共40只蠕虫。
- 在软件中，选择注释工具按钮，然后选择绘制文本工具。单击在视频的第一帧中测量的蠕虫中心中的点，并将其标记为数字。在目视跟踪蠕虫的运动路径时，将视频推进到末尾。在最后一帧中，单击要测量的蠕虫中心中的点并标记下一个相应的数字。然后，使用绘制比例尺工具，从第一个数字绘制一条线到第二个数字来记录"行驶距离"。
- "行驶的距离"是两个心心点之间的距离。此距离显示在测量线附近。在电子表格中记录此度量值。在视频中对 19 个其他蠕虫重复此测量，同时在分析窗口中保留每个单独的测量值。
- 从表现出最强劲运动的动物身上进行测量，以避免选择没有运动的动物，并将数据偏向瘫痪。测量完成后，拍摄最后视频帧的快照，说明所有测量线，以便数据可以追溯到它源自的动物。
- 使用四列电子表格分析数据。第一列是蠕虫"标识符"，第二列是行驶距离/时间（速度）。
- 通过右键单击实验下的视频并访问视频的属性，可以找到每个视频的时间。
- 通过选择"量化"，然后选择软件上的统计信息，通过查找每种动物的长度来标准化速度测量。单击视频显示上的注释工具图标应允许使用"绘制折线"工具。然后，此工具可用于从视频从头部尖端到尾部的尖端自由跟踪C. elegans。行的长度将记录在统计信息下。
- 拍摄最终视频帧的快照，说明用于调整C. elegans大小的所有折线，以便数据可以追溯到它们源自的动物。
- 通过向电子表格中添加另外两列来分析数据。第三列是"动物长度"，第四列是"标准化速度"（速度/动物长度）。使用单向 ANOVA 与空矢量 （RNAi）进行后检测，分析标准化速度数据。
3. 测量RAN肽的发育毒性：生长测定
- 在gfp （RNAi）、（EV）RNAi(EV)RNAi,或（基因特异性）6 cm RNAi板上，将 +30 肉汁动物放入 50 μL 的次氯酸盐溶液（10 mL 漂白剂、2.5 mL 10 N NaOH、37.5 mL dH2O）点中。
- 24小时后，将从次氯酸盐溶液点爬出的6个转基因后代移到一个新的6厘米RNAi板，与接受次氯酸盐溶液处理的板上的RNAi条件相同。将这些后代 （F1） 置于 20°C 下，以生长和繁殖。
- 在24~48小时后，将10只转基因L4动物选到6厘米的RNAi上，与动物生长的RNAi条件相匹配。让动物在20°C的培养箱中脉冲产卵24小时。
- 24小时后，取出成年动物并丢弃它们。使用机械手持计数器计算 24 小时期间放置的鸡蛋和 L1 幼虫的数量。这是总育雏大小。
- 在接下来的 72 小时中，计算达到 L4 或更长阶段的动物数量。计算每只动物时，将其从盘子中取出。
- 将"百分比增长"量化为达到L4或更老阶段的动物的百分比，超过总育雏大小。
- 执行 2 x 2 Fisher 与空矢量 （RNAi）的精确测试，以确定百分比增长是否具有统计显著性。比较的类别是"生长"（在72小时达到L4或更老阶段的动物）和"无生长"（总育雏大小减去72小时达到L4或更老阶段的动物数量）。
4. 发育后RAN肽麻痹测定
- 通过将4⁄6个转基因L4放在6厘米gfp（RNAi）的盘子里，在20°C下生长蠕虫，保持合成C.elegans转基因菌株在gfp（RNAi）上的肌肉中表达RAN肽-GFP。 gfp
- 如果实验利用RNAi来测试RAN肽毒性的遗传效应，将10个转基因重力成人从未饥饿的板移动到两个6厘米空载体（RNAi）（瘫痪阳性控制，遗传效应负控制），gfp（RNAi）（瘫痪的负对照，遗传效应的阳性控制），基因特异性（RNAi）（即，每6厘米板10个重力成人）。
- 如果突变体用于分析RAN肽毒性的遗传效应，则将10只重力WT或突变动物在两个6厘米空载体（RNAi）或gfp（RNAi）板上分别表示相同的RAN转基因。在20°C下生长蠕虫48小时。
- 从 6 厘米 RNAi 板中挑选 10 套 10 套 10 个转基因 L4，并将每组放在 3 厘米 RNAi 板上（即，每个基因型为 100 只动物）。确保为测定选择的 L4 都有表面上的正常运动。将板放在拉链存储袋中，以保持水分。
- 将带 L4 的袋装板放入 25°C 培养箱中。
- 24小时后从25°C培养箱中取出一个菌株，以尽量减少它们在RT的出水时间。
- 点击解剖显微镜上的板，检查运动情况。如果动物移动超过身体长度，将动物计数为移动动物，并将其转移到新的 3 厘米 RNAi 板。使用铂金选料敲击头部或尾部的剩余蠕虫。如果动物移动超过身体长度，将动物计数为移动动物，并将其转移到新的 3 厘米 RNAi 板。
注：传输时，每板不要超过 10 个蠕虫。小心避免将后代移至新的RNAi板，因为测定只取决于跟踪年迈的动物。 - 将所有未移动的蠕虫组合在一起，以便可以轻松检测到超过身体长度的移动。给动物至少一分钟移动多个身体长度。如果它仍然不动，它瘫痪，袋袋（即，幼虫孵化在母亲体内），或死亡。
- 检查动物，表现出袋装，在盘子的两侧脱发，表现出挤出的肠子，洞穴，迷路，或死于检测时，检测。瘫痪的蠕虫被计数，留在旧的RNAi板，并丢弃。
- 如步骤 4.6_4.9 所述，每天为动物打麻痹，连续 5-7 天得分。
- 使用与用于分析寿命的日志级测试相同的日志级测试分析瘫痪数据。在此统计分析中，移动蠕虫被评分为"活"，瘫痪蠕虫被打为"死亡"，死、袋、肠挤压、干燥、挖洞或其他丢失的蠕虫被打为"检查"。
注：在此分析中，"活动百分比"数字表示"移动百分比"动物。反向表示"瘫痪百分比"。使用在线分析工具 OASIS （https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/） 执行日志排名统计分析。
5. 测量神经元病理学：共性测定
- 使用unc-47促进剂生成转基因C. elegan表达对 GABAergic 神经元感兴趣的 RAN 肽。也表达unc-47p：：GFP或unc-47p：：RFP，以揭示GABA神经元的细胞形态。
- 挑选50只转基因L4动物，将它们放在6厘米OP50板的25°C下，24小时。
- 将50只转基因动物转移到25°C的6厘米OP50新板上，24小时。
- 制作阿甘丝垫，用于在宽场显微镜下对动物进行成像。
- 将两块胶带放在两张显微镜幻灯片上。将一张没有胶带的清洁幻灯片放在两张带丝幻灯片的中间。
- 使用一次性无菌转移移液器将 3% 熔融琼脂酒的 3% 熔融软糖分配至中间滑轨上，100 μL（从一次性塑料巴斯德移液器中滴1滴）。
- 立即将第二张干净的幻灯片放在熔融的琼脂上，使其停留在贴片幻灯片上，并在幻灯片之间创建一层薄薄的均匀的琼脂。
- 在琼脂冷却和凝固后，小心地将两张幻灯片与两张叠的琼脂层放在它们之间，而不将它们分开，并将其放在一个塑料袋中，下面有一张湿纸。每 10 个蠕虫制作一张幻灯片，并检查三张额外的幻灯片。
- 从25°C培养箱中取出转基因C.elegan，在玻璃凹陷滑移中将10个转基因C.elegans放入100μL的10mMlevamisole中。孵育10分钟或直到动物瘫痪。
- 从塑料袋中取出一对幻灯片，并小心地将它们分开。用基因型标记滑道，并在琼脂中间添加 2 μL 的 10 mM levamisole。将10只动物移到琼玫瑰垫上的莱瓦米索尔。用#1厚度的盖玻片盖住动物。
- 形象动物，其中的外阴是定向，使其在动物的右侧。如果外阴在头部的左侧，运动神经元的共性将位于动物下方，不能看得很清楚，因此很难进行准确的定量。忽略这些动物的定量。在此方向中，运动神经元的共性最接近盖玻片，在倒置的宽场荧光显微镜上清晰可见。使用 63X 1.4X NA 油浸透镜和 Leica L5 GFP 过滤器组（Ex480/40nm;Em527/30nm）。如果神经元共成表示RFP而不是GFP，则使用 Leica TX2 RFP 滤波器集（Ex560/40nm;Em645/75nm）。
- 使用 63x 1.4x NA 油浸透镜和 GFP 滤镜组（Ex480/40 nm;Em527/30 nm）。如果神经元共成表示RFP而不是GFP，则使用红色荧光蛋白（RFP）过滤器集（Ex560/40 nm;Em 645/75 nm）。
- 在将盖玻片放在蠕虫身上的 45 分钟内成像蠕虫，以尽量减少固定造成的毒性。
- 对于每个蠕虫，计算可见共感的数量。野生动物中有16种可见的共性动物。还要计算在逗号中具有大珠子（即 blebs）的共同体数以及损坏的共性数。要确认共性是否损坏，请通过调整焦平面，从背带到心线进行通信。
注：在其中，未c-47p：：GFP荧光显示间隙的共同体被认为是断裂的。破碎的共件通常有一个破损的两侧，帮助显示共融被打破。计算 20 个蠕虫的毛额和断裂量。 - 计算用bbs或断裂的共和分数，而不是每个动物观察到的共性总数。也可以测量每只动物（包括野生类型、污点和破碎事件）的共性的绝对数量。
- 对于每个类别，计算平均值 = SD，并使用学生 t 测试进行统计分析以在两个组之间进行比较，或者使用单向 ANOVA 来比较 3 个或更多组。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们使用此处描述的测定来评估不同基因抑制对在具有 G4C2重复扩张的 ALS 患者中发现的 RAN 二肽毒性的影响。利用生长测定测量发育毒性，我们分析了在全基因组RNAi屏幕抑制器中识别的几种基因敲除突变体对肌肉表达PR50-GFP毒性的影响。虽然仅表达PR50-GFP就导致完全渗透性生长抑制，但几个基因的功能突变的丧失抑制了PR发育毒性的12-94%（图1A）。
我们还利用视频速度分析方法测量了特定基因敲除对PR50表达动物发育活力的影响。不出所料，gfp（RNAi）由于PR50-GFP表达的抑制，与空矢量（RNAi）相比，其活力大大增加。我们还发现，RNAi对蛋白酶体子单元rpn-7导致PR50运动性显著增加（图1B）。
ALS，像许多神经退行性疾病一样，发生在成人身上。因此，我们使用年龄依赖性麻痹测定分析成人表型。PR50-GFP 在 5 天龄前表现出高达 80% 的瘫痪。然而，RNAi针对基因cul-6显著延迟瘫痪，表明cul-6是PR50-GFP毒性所必需的（图1C）。这种效应是针对cul-6（RNAi）的，因为cul-1（RNAi）没有改变PR50-GFP毒性。
神经退行性蛋白质，如有毒的RAN肽，通常模拟在C.elegans4，20，21，22的体壁中。 C. elegans4,20,21,22然而，当在C.elegan神经元中表达时，确定RAN蛋白是否引起神经病理学也很重要，因为神经元特异性毒性是许多神经退行性疾病的常见特征。我们使用共性测定检查了神经元特异性毒性。在第2天成人中，运动神经元中的PR50-GFP表达导致运动神经元的颤动显著增加。这种神经病理学被胰岛素/IGF受体基因同源性daf-2的突变显著抑制，该突变延迟了几种神经退行性蛋白质23的毒性（图2B）。
图1：评估肌肉表达的RAN肽的毒性的测定。（A） RAN肽生长测定。指示的突变体被划入drIs34（myo-3p：:PR50-GFP）遗传背景下gfp（RNAi）条件。 drIs34 myo-3p::PR50-GFP每个基因型上方的数字表示为生长得分的后代数。所有基因型均具有 p < 0.05 使用费舍尔的精确测试与野生类型相比。（B） 视频速度分析，以测量RAN肽在发育过程中的毒性。drIs34 （myo-3p：:PR50-GFP）动物生长在gfp （RNAi）、空矢量 （RNAi）或rpn-7 （RNAi）条件下，然后根据所述获得活力评分。速度被正常化为gfp（RNAi）治疗的动物。显示的数据对于每个基因型均值 = SD、n = 40。*-p < 0.01， #- p < 0.001， 单向 ANOVA 与图基后测试.（C） 麻痹测定，以测量年龄开始毒性。drIs34 （myo-3p：:PR50-GFP）动物生长在空矢量 （RNAi） （'WT'）、cul-1（RNAi） 或cul-1(RNAi)cul-6（RNAi）上，并且每 24 小时对 ±-p < 0.001 进行日志等级测试，与 Bonferroni 测试后校正与 WT. n = 100 只基因型动物进行记录。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：用于测量运动神经元表达RAN肽神经病理学的测定。（A） 成年C. elegans表示非c-47p：：GFP运动神经元报告在野生类型或非c-47p：:PR50-GFP表达动物的图像。野生类型的图像说明了正常的共融形态。图像表示宽场荧光显微镜获得的扁平 Z 系列堆栈。PR50动物展示了共碎和发抖的例子。（B） daf-2（e1370）对 PR50 通信的感言的影响。点表示单个动物的百分比，并显示平均值和 SD。n = 每个基因型 20 只动物 #-p < 0.01， 与邓恩的事后测试的单向 ANOVA.请点击此处查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里，我们报告的方法，可用于测定RAN肽毒性建模在肌肉或神经元的C.elegans。虽然神经退行性蛋白质在人类患者中具有年龄发病表型，但在模型系统中过度表达时，它们也会表现出发育毒性。过度表达有显著的解释性限制，但它也为基因或药理学屏幕提供了一个强有力的起点，旨在识别能够逆转有毒表型的基因或药物。这一点尤其重要，因为大多数精确的动物疾病模型要么没有表型，要么没有弱表型，不适合无偏见筛选方法24、25、26。24,25,26我们的C.elegans RAN肽模型和测定代表了一种强大的，互补的方法，其他RAN肽模型系统，如酵母和果蝇，了解细胞通路是重要的这些新描述的蛋白质的毒性。
肌肉表达的RAN肽的条件毒性
测量RAN肽毒性需要一个追逐期来消除gfp（RNAi）的影响。然而，如果不注意精确地进行实验的开始时间、实验的选择、温度变化等，从gfp（RNAi）去除到表型出现之间的时间可能不一致。随着我们对这些测定越来越有经验的经验，RAN肽表型的时机和渗透性变得相对一致。这些测定中最关键的步骤之一是动物适当转移到25°C。如果没有这种转变，RAN肽的毒性明显较弱。然而，动物不能持续生长在25°C，因为它们不生长和繁殖，大概是由于RAN肽的基线表达较高。这与酵母或果蝇的情况并无二样，即表达有毒RAN肽的菌株在允许条件下（即低温）保持，但在测定13、15,15之前，会急性转向限制性条件（即更高的温度），以提高肽表达能力。在这种有条件的表达系统中，增强或抑制毒性的遗传条件可能由肽表达水平的变化产生。为了确定RAN肽毒性的基因修饰剂是否通过改变转基因表达水平而发生，我们采取了两种方法。首先，我们的许多转基因菌株表示第二个RFP记者在用于驱动RAN肽表达的同一促进剂的控制下。导致 RAN 肽表达减少或增加的启动器活性变化会导致 RFP 水平的类似降低或增加。我们认为突变体或 RNAi 条件会显著改变 RFP 水平，以非具体地执行。其次，我们执行定量PCR和西印迹，以确定RAN肽mRNA或蛋白质的水平在条件之间是否发生变化。然而，基于西方的RAN肽检测有时可能证明是困难的或不可能的，正如我们和其他人已经观察到的C9orf72衍生的RAN肽PR50-GFP。在这种情况下，我们量化体内 GFP 水平，以确定在所比较条件之间蛋白质表达是否发生变化。
发育毒性：优点和局限性
肌肉中毒性RAN肽的强迫过度表达往往导致在C.elegans发育性逮捕。虽然这显然不能模仿人类疾病病理学，但它为基因抑制器屏幕提供了一个强有力的起点，因为RAN毒性抑制者很容易被确定为在没有gfp（RNAi）的情况下生长和繁殖的动物。由于转基因表达的减少，一些抑制器将促进生长。为了区分这些可能性，我们通常包括由同一促进者在我们的RAN肽转基因菌株中驱动的第二个RFP报告器。抑制器减少或沉默转基因表达也将表现出降低的RFP表达水平。另一方面，表现出正常或升高的RFP水平的抑制器不太可能通过减少转基因表达而起作用。很像使用酵母生长或果蝇眼形态13，15，27，这些方法，虽然不精确建模在人类的疾病方面，提供了一个强大的筛选工具，为RAN肽改性剂的初始识别。13,15,27
发育后毒性（麻痹测定）：优点和局限性
麻痹测定的优点是，可以使用任何蠕虫实验室中的工具测量相对数量较大的动物（50–100）。麻痹也是一种容易检测的严重表型。这种测定的主要局限性是，对不会导致完全瘫痪的运动缺陷不敏感。此类缺陷可能需要更敏感和定量的方法来衡量，例如冲击测定或运动运动测定28。麻痹检测应尽可能对基因型视而不见，并应注意确保蠕虫不经历任何可能对检测结果产生重大影响的其他类型的压力（例如污染、饥饿）。表达有毒RAN肽的Elegans有时不能表现出一种健壮的麻痹表型。这可能是由于gfp（RNAi）继续抑制RAN肽表达的持续效应。在这些情况下，如果我们未能观察到严重的瘫痪 （>10%）在空矢量（RNAi）控制动物后的第2天，我们通常终止测定，并启动另一个复制。这种测定的一个修改可能涉及使用替代诱导的RAN肽表达系统。C. elegans唯一常用的可诱导表达系统是热冲击促进剂。然而，所需的热冲击可能导致压力反应，可能会影响蛋白质的毒性。其他条件表达系统，如辅助诱导degron（AID）系统29，未来的应用可以显著提高我们研究RAN肽毒性的能力。
神经退化/共性测定：优点和局限性
C. elegan 中的运动神经元共感代表一个运动神经元的斧头，在腹腔和背神经线之间传递。在分离的共性中很容易检测到出血和破损，从而在活体动物中快速量化神经退化（图2）。在检查动物时，重要的是它们不要长时间在悬浮物中孵育，因为这可能导致动物过早死亡，从而导致在没有任何有毒的RAN肽的情况下神经元出血和破裂。在某些情况下，共性是完全退化的，并且不再可见。因此，它们不能为神经病理学特征打分，因为我们的测定测量了被观察到的共知性总数中破裂或发抖的百分比。在这些情况下，共性测定可能低估了 RAN 肽的效果。
最后，本文描述的测定可用于测量C.elegans中RAN肽引起的毒性。使用gfp（RNAi）调节蛋白质的表达，可以观察到发育后表型。我们的方法可以很容易地适应，以执行大规模基因筛选抑制剂或增强毒性。二次测定，如麻痹测定和共性测定，可以证实毒性在发育后被抑制，并测试抑制机制是否在神经元中得到保存。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
NIH R21NS107797
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
References
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
- Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
- Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
- Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
- Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
- Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
- Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
- Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
- Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
- O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
- Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
