Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling ran peptid toksicitet i C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Gentagne ikke-ATG-afhængige translationelle produkter er nye patogene træk ved flere gentage ekspansion-baserede sygdomme. Målet med den beskrevne protokol er at evaluere toksicitet forårsaget af disse peptider ved hjælp af adfærdsmæssige og cellulære analyser i modelsystemet C. elegans.

Abstract

C. elegans er almindeligt anvendt til at modellere aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme forårsaget af gentagne ekspansionsmutationer, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Huntingtons Sygdom. For nylig viste det sig, at gentagne ekspansionsholdige RNA var substratet for en ny type proteinoversættelse kaldet genrelateret ikke-AUG-afhængig (RAN) oversættelse. I modsætning til kanonisk oversættelse kræver RAN-oversættelse ikke en start-codon og forekommer kun, når gentagelser overskrider en tærskellængde. Da der ikke er nogen startfarve til at bestemme læserammen, forekommer RAN-oversættelse i alle læserammer fra både sense- og antisense RNA-skabeloner, der indeholder en gentagelsesudvidelsessekvens. Derfor udvider RAN-oversættelse antallet af mulige sygdomsrelaterede giftige peptider fra en til seks. Hidtil har RAN oversættelse blevet dokumenteret i otte forskellige gentage ekspansion-baserede neurodegenerative og neuromuskulære sygdomme. I hvert tilfælde, dechifrere hvilke RAN produkter er giftige, samt deres mekanismer for toksicitet, er et kritisk skridt i retning af at forstå, hvordan disse peptider bidrager til sygdomspatofysiologi. I dette papir præsenterer vi strategier til at måle toksiciteten af RAN peptider i modelsystemet C. elegans. For det første beskriver vi procedurer til måling af RAN peptid toksicitet på vækst og motilitet af at udvikle C. elegans. For det andet beskriver vi en analyse til måling af postudviklingsmæssige, aldersafhængige virkninger af RAN-peptider på motilitet. Endelig beskriver vi en neurotoksicitetsanalyse til vurdering af virkningerne af RAN-peptider på neuronmorfologi. Disse analyser giver en bred vurdering af RAN peptid toksicitet og kan være nyttige for at udføre store genetiske eller små molekyle skærme til at identificere sygdomsmekanismer eller behandlinger.

Introduction

Den uhensigtsmæssige udvidelse af DNA-gentagelsessekvenser er det genetiske grundlag for flere neurodegenerative sygdomme såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og Huntingtons Sygdom (HS)1. Mens der er etableret cellulære og animalske modeller for disse sygdomme, mekanismer, der ligger til grund for disse betingelser er ikke veldefineret. For eksempel er HS forårsaget af udvidelser af en CAG-gentagelsessekvens i kodningssekvensen for Huntingtinproteinet Htt2. Da CAG koder aminosyren glutamin, resulterer CAG-gentagne ekspansion i indsættelsen af et polyglutamin eller polyQ, sekvens i Htt. Ekspanderet polyQ-proteiner danner længde- og aldersafhængige proteinaggregater, der er forbundet med toksicitet3,4. Overraskende nok tyder to nylige undersøgelser på, at længden af polyQ-sekvensen ikke er den vigtigste drivkraft bag HS-sygdomsdebut, hvilket tyder på, at polyQ-uafhængige faktorer også kan bidrage til sygdommen5,6.

En mulig polyQ-uafhængig mekanisme indebærer en nyopdaget type protein oversættelse kaldet Repeat Associated Non-AUG-afhængige (RAN) oversættelse7. Som navnet antyder, ran oversættelse kun opstår, når en udvidet gentagelse sekvens er til stede og kræver ikke en kanonisk start codon. Derfor forekommer RAN-oversættelse i alle tre læserammer i gentagelsen for at producere tre forskellige polypeptider. Hertil kommer, fordi mange gener også producere en antisense udskrift, der indeholder det modsatte supplement af den udvidede gentage sekvens, RAN oversættelse forekommer også i alle tre læserammer af antisense udskrift. Sammen udvider RAN-oversættelsen antallet af proteiner, der er fremstillet af en udvidet repeat-holdige DNA-sekvens fra et peptid til seks peptider. Til dato, RAN oversættelse er blevet observeret i mindst otte forskellige gentage ekspansion lidelser8. RAN peptider er observeret i postmortem patient prøver og kun i tilfælde, hvor patienten bærer en udvidet gentagelse9,10. Mens disse peptider er klart til stede i patientceller, deres bidrag til sygdomspatofysiologi er uklart.

For bedre at definere den potentielle toksicitet forbundet med RAN peptider, flere grupper har udtrykt hvert peptid i forskellige modelsystemer, såsom gær, fluer, mus, og vævkultur celler11,,12,13,14,15,16. I stedet for at udnytte gentagelsessekvensen for udtryk anvender disse modeller en codon-variation-tilgang, hvor gentagelsessekvensen elimineres, men aminosyresekvensen bevares. Oversættelsesinitiering sker gennem en kanonisk ATG, og peptidet smeltes typisk til et fluorescerende protein ved enten N- eller C-endeinus, hvoraf ingen synes at forstyrre RAN peptidtoksicitet. Derfor overudtrykker hver konstruktion et enkelt RAN-peptid. Modellering af de forskellige RAN-produkter i en flercellet organisme med enkle analyser til måling af RAN peptidtoksicitet er af afgørende betydning for at forstå, hvordan de forskellige RAN-produkter fra hver sygdomsfremkaldende gentagne ekspansion bidrager til cellulær dysfunktion og neurodegeneration.

Ligesom andre modelsystemer giver C. elegans en fleksibel og effektiv eksperimentel platform, der muliggør undersøgelser af nye sygdomsmekanismer, såsom RAN peptidtoksicitet. Orme tilbyder flere unikke eksperimentelle egenskaber, der ikke i øjeblikket er tilgængelige i andre modeller af RAN peptid toksicitet. For det første er C. elegans optisk gennemsigtige fra fødslen til døden. Dette giver mulighed for simpel visualisering af RAN peptid udtryk og lokalisering, samt in vivo analyse af neurodegeneration i levende dyr. For det andet er transgene metoder til generering af RAN peptid udtryksmodeller billige og hurtige. I betragtning af C. eleganskorte tre-dages livscyklus kan stabile transgene linjer, der udtrykker et givet RAN-peptid på en celletypespecifik måde, fremstilles på under en uge. For det tredje kan simple fænotypiske output kombineres med genetiske screeningsmetoder, såsom kemisk mutagenese eller RNAi-screening, for hurtigt at identificere gener, der er afgørende for RAN-peptidtoksicitet. Endelig, den korte levetid af C. elegans (~ 20 dage) giver efterforskere til at bestemme, hvordan aldring, som er den største risikofaktor for de fleste gentage ekspansion sygdomme, påvirker RAN peptid toksicitet. Sammen er denne kombination af eksperimentelle egenskaber uovertruffen i ethvert andet modelsystem og tilbyder en kraftfuld platform for studiet af RAN peptid toksicitet.

Her beskriver vi flere analyser, der udnytter de eksperimentelle fordele ved C. elegans til at måle toksiciteten af RAN peptider og til at identificere genetiske modifikater af denne toksicitet. Den codon-varierede ATG-initierede RAN peptider er mærket med GFP og udtrykt individuelt i enten muskelceller under myo-3 promotor eller i GABAergic motor neuroner under unc-47 promotor. For udtryk i muskelceller er det vigtigt, at giftige RAN peptider er mærket med grønt fluorescerende protein (GFP), eller andre fluorescerende protein (FP) tag, der kan målrettes med en RNAi fodring vektor. Dette skyldes, at giftige RAN peptid udtryk normalt blokerer vækst, rendering sådanne stammer ikke-levedygtige. Brugen af gfp(RNAi) inaktiverer REGEL peptidudtryk på betinget vis og tillader stammevedligeholdelse, genetiske kors osv. For analyser fjernes disse dyr fra gfp(RNAi),som gør det muligt at udtrykke RAN-peptidet og de deraf følgende fænotyper. Ud over den molekylære strategi for design codon-varieret RAN peptid udtryk konstruktioner, beskriver vi analyser til måling af udviklingsmæssige toksicitet (larve motilitet og vækst analyse), post-udviklingsmæssige alder-associeret toksicitet (lammelse assay), og neuron morfologiske defekter (commissure assay).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering codon-varieret RAN peptid udtryk konstruktioner

  1. Design den individuelle RAN peptid kodning sekvens udnytte synonyme codons at fjerne den grundlæggende gentagne DNA / RNA struktur, men bevare den overliggende aminosyre sekvens.
  2. Bestil de brugerdefinerede codon sekvenser kommercielt på gentagelselængder er nødvendige for undersøgelserne (typisk 5-100 gentagelser). Medtag et HindIII-restriktionssted i 5's ende og et BamHI-restriktionssted i 3's ende for at lette kloning til C. elegans ekspressionsvektorer, såsom pPD95.79.
    BEMÆRK: Hvis syntese af større konstruktioner viser sig vanskelig, kan mindre byggestenssekvenser syntetiseres og derefter indbygges i større gentagelser ved hjælp af en retningsbestemt ligationsstrategi17.
  3. Subklon peptid sekvens i en C. elegans udtryk vektor ved hjælp af standard T4 ligation metoder.
  4. Subclone en celletypespecifik promotorsekvens genereret af PCR foran RAN-peptidsekvensen for at drive vævsspecifikt RAN peptid-GFP-udtryk.
  5. Mikropust RAN peptid konstruere i gonade af vilde type C. elegans at generere transgene stammer, der indeholder ekstrachromosomal arrays ved hjælp af standard metoder18. For en co-injektion markør, den muskel-specifikke RFP reporter(myo-3p::RFP (pCFJ104)) blev udnyttet, selv om andre markører kan udnyttes så godt.
  6. Integrer et stabilt transgene i genomet ved hjælp af standard C. elegans integrationsscreeningsmetoder 19.
  7. Hvis RAN-peptidet er giftigt, og transgene dyr ikke overlever, fodres dyr gfp(RNAi) med bakterier før og efter injektionen for at lukke munden på ekspressionen af det giftige protein.
    BEMÆRK: Fjernelse af dyr fra gfp(RNAi) gør det muligt for RAN-peptidudtryk til fænotypiske analyser ved hjælp af nedenstående analyser.

2. Måling af udviklingstoksicitet ran peptider efter RNAi-baserede gen knockdown: Video hastighed analyse protokol

  1. Hæld standard nematode vækstmedium (NGM) RNAi 24 brøndplader med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og 25 μg/ml carbenicillin.
  2. Stribe ud RNAi-fodring kloner i HT115 bakterier, der skal testes på Luria bouillon (LB) + carbenicillin (25 μg/ml) agar plader og vokse bakterier ved 37 °C for 24 h. Medtag tom vektor (RNAi) som positiv kontrol for toksicitet og gfp (RNAi) som den negative kontrol.
  3. For hver klon vælges en enkelt koloni i 1 ml LB + carbenicillinvæskemedier, og der dyrkes bakterier natten over i 18 timer ved 37 °C, mens der rystes ved 250 rotationer i minuttet (RPM).
  4. Der skal være fire individuelle brønde i NGM RNAI 24-brøndene med 20 μL af følgende bakteriekulturer natten over: kolonne 1 brønde = gfp(RNAi); kolonne 2 brønde = (EV)RNAi; kolonner 3-6 brønde = RNAi mod gener, der skal testes. Lad RNAi bakterier til at fremkalde dsRNA produktion natten over ved stuetemperatur (RT).
  5. Isoler æg fra dag ét voksne C. elegans, der udtrykker det integrerede RAN peptid transgene ved hjælp af standard hypochloritmetoden og frø ~30 C. elegans æg i hver brønd af NGM RNAi 24 brøndpladen.
  6. Inkuber de 24 brønde ved 20 °C i 7 dage.
    BEMÆRK: Denne inkubationstid er til stammer, der udtrykker giftige C9orf72 RAN-dipeptider, såsom PR50 eller GR50. Andre stammer kan kræve kortere inkubationstid for at forhindre udmattelse af den bakterielle fødekilde og efterfølgende sult.
  7. Erhverve transmitterede lys videoer ved hjælp af en Leica MZ16FA stereo dissekerer mikroskop udstyret med en DFC345FX monokrom kamera tilsluttet en Windows-kompatibel pc, der kører Leica AF video erhvervelse software (version 2.6.0.7266).
    1. Erhverve to videoer fra to separate brønde for hver RNAi tilstand ved hjælp af konsekvent video erhvervelse indstillinger mellem brønde. For hver video skal du anskaffe 10 sekunder ved opløsning på 800 x 600 pixel og 13,16 billeder pr. sekund (tid stiledimension = 0,076 sekunder) ved hjælp af 18,6 X forstørrelse (1,49 zoomindstilling i AF-software). Indstil billedeksponeringstiden til 4 millisekunder. Mærk straks hver video med stammen, RNAi-tilstanden og et godt nummer.
  8. Blind eksperimentatoren til genotype forbundet med hver videofil ved at randomisere rækkefølgen af videoerne og ændre navnet på videoerne til tal. Gem denne gruppe videoer som en ny fil. Frigør eksperimentatoren, når analysen er afsluttet.
  9. Der måles »tilbagelagt distance« og længden af hvert dyr for 20 forskellige dyr fra hver video, idet der undersøges i alt ~40 orme for hver RNAi-tilstand.
    1. I softwaren skal du vælge knappen anmærkningsværktøjer og derefter tegne tekstværktøjet. Klik på et punkt i midten af ormen, der måles i det første billede af videoen og markere det som et tal. Før videoen til enden, mens du visuelt sporer ormens bevægelsessti. I sidste ramme skal du klikke på et punkt i midten af ormen, der måles, og markere det næste tilsvarende tal. Derefter skal du trække en linje fra det første tal til det andet tal ved hjælp af værktøjet træk skaleringslinje for at registrere "den tilbagelagte distance".
    2. »Tilbagelagt distance« er afstanden mellem de to centroidpunkter. Denne afstand vises ved siden af målelinjen. Registrer denne måling i et regneark. Gentag denne måling for 19 andre orme i videoen, mens hver enkelt måling bevares i analysevinduet.
  10. Foretag målinger fra dyr, der udviser den mest robuste bevægelse for at undgå udvælgelse af dyr, der ikke udviser nogen bevægelse, og biasing dataene mod lammelse. Når målingerne er færdige, skal du tage et øjebliksbillede af det endelige videobillede, der illustrerer alle målelinjerne, så dataene kan spores tilbage til det dyr, hvorfra de stammer.
  11. Analysér dataene ved hjælp af et regneark med fire kolonner. Kolonne et er ormen "identifikator", kolonne to er den tilbagelagte afstand / tid (hastighed).
    1. Tidspunktet for hver video kan findes ved at højreklikke på videoen under eksperimentet og gå til egenskaberne for videoen.
  12. Normalisere hastighedsmålingen ved at finde længden af hvert dyr ved at vælge Kvantificer, derefter Statistik på softwaren. Hvis du klikker på anmærkningsværktøjet på videodisplayet, skal det være muligt at bruge værktøjet "Tegn polylinje". Dette værktøj kan derefter bruges til frit at spore C. elegans fra videoen fra spidsen af hovedet til spidsen af halen. Længden af linjen vil blive registreret i henhold til statistikker.
    1. Tag et øjebliksbillede af den endelige videoramme, der illustrerer alle de polylinje,der anvendes til dimensionering af C. elegans, så dataene kan spores tilbage til det dyr, hvorfra de stammer.
  13. Analysér dataene ved at føje yderligere to kolonner til regnearket. Kolonne tre er "Animal Length", og kolonne fire er "Normaliseret Hastighed" (hastighed / dyrs længde). Analysér de normaliserede hastighedsdata ved hjælp af en envejs ANOVA med posthoc-test i forhold til tom vektor (RNAi).

3. Måling af udviklingstoksicitet af RAN peptid: Vækst analyse

  1. Der plukkes ~30 drimæiske dyr i en 50 μL plet af hypochloritopløsning (10 ml blegemiddel, 2,5 ml 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) på enten en gfp(RNAi), (EV)RNAi eller (genspecifik) 6 cm RNAi-plade.
  2. Efter 24 timer flyttes seks transgene afkom, der er kravlet ud af hypochloritopløsningsstedet, til en ny 6 cm RNAi-plade, der er identisk med RNAi-forholdene på den plade, hvorpå de blev underkastet behandling af hypochloritopløsning. Sæt disse afkom (F1) ved 20 °C for at vokse og reproducere.
  3. Efter 24-48 timer plukkes 10 transgene L4-dyr på 6 cm RNAi, der matcher de RNAi-betingelser, som dyrene har været voksende på. Dyrene skal pulsere med æg i 24 timer i en 20 °C-inkubator.
  4. Efter 24 timer fjernes de voksne dyr, og de kasseres. Tæl antallet af æg og L1-larver, der er lagt i løbet af 24 timer, ved hjælp af en mekanisk håndholdt tæller. Dette er den samlede yngel størrelse.
  5. I løbet af de næste 72 timer, tælle antallet af dyr, der når L4 eller ældre fase. Når hvert dyr tælles, fjernes det fra pladen.
  6. Kvantificer "Procentvækst" som procentdelen af dyr, der når L4 eller ældre etape ud af den samlede yngel størrelse.
  7. Udfør en 2 x 2 Fisher's nøjagtige test versus tom vektor (RNAi) for at afgøre, om procentvæksten er statistisk signifikant. Kategorierne til sammenligning er "Vækst" (# af dyr, der nåede L4 eller ældre fase i 72 h) og "Ingen vækst" (samlet yngel størrelse minus antallet af dyr nå L4 eller ældre fase i 72 h).

4. Post-udviklingsmæssige RAN peptid lammelse assay

  1. Opretholde integrerede C. elegans transgene stammer, der udtrykker RAN peptid-GFP i musklen på gfp(RNAi) ved at placere 4-6 transgene L4's på en 6 cm gfp(RNAi) plade og vokse ormene ved 20 °C.
  2. Hvis eksperimentet udnytter RNAi til at teste for genetiske virkninger på RAN peptid toksicitet, flytte 10 transgene gravide voksne fra en unstarved plade til hver af to 6 cm tom vektor(RNAi) (positiv kontrol for lammelse, negativ kontrol for genetiske virkninger), gfp (RNAi) (negativ kontrol for lammelse, positiv kontrol for genetiske virkninger), gen-specifikke(RNAi) (dvs. 10 gravide voksne pr 6 cm plade).
  3. Hvis mutanter anvendes til at analysere genetiske virkninger på RAN peptid toksicitet, placere 10 gravide WT eller mutant dyr udtrykke samme RAN transgene på hver af to 6 cm tom vektor(RNAi) eller gfp (RNAi) plader. Avl ormene ved 20 °C i 48 timer.
  4. Pick 10 sæt af 10 transgene L4's fra 6 cm RNAi plader og placere hvert sæt på en 3 cm RNAi plade (dvs. n = 100 dyr for hver genotype). Sørg for, at L4's udvalgt til analysen alle har overfladisk normal motilitet. Placer pladerne i en lynlås opbevaringspose for at bevare fugt.
  5. Pladerne anbringes med L4'er i 25 °C-inkubatoren.
  6. Fjern dyrene 24 timer senere fra 25 °C-inkubatoren en stamme ad gangen for at minimere den tid, de er ude ved RT.
  7. Tryk på pladerne på det dissekerende mikroskop for at kontrollere for bevægelse. Hvis dyrene bevæger sig mere end en kropslængde, tælle dyret som mobil og overføre det til en ny 3 cm RNAi plade. Brug en platin pick til at trykke på de resterende orme på hovedet eller halen. Hvis dyret bevæger sig mere end en kropslængde, tælle dyret som mobil og overføre det til en ny 3 cm RNAi plade.
    BEMÆRK: Der må ikke være mere end 10 orme pr. plade, når den overføres. Vær omhyggelig med at undgå at flytte afkom til den nye RNAi plade, fordi analysen afhænger af følgende alderen dyr alene.
  8. Grupper alle de ikke-bevægelige orme sammen, så bevægelse af mere end en kropslængde let kan detekteres. Giv dyret mindst et minut til at bevæge sig mere end én kropslængde. Hvis det stadig ikke bevæger sig, er det lammet, sække (dvs. larver udklækket inde mor), eller døde.
  9. Censor dyr, der udviser sække, udtørre på siderne af pladen, udstille ekstruderet tarme, grave, gå tabt, eller dø af analysen på tidspunktet for påvisning. Lammede orme tælles, efterlades på den gamle RNAi plade, og kasseres.
  10. Tal dyrene for lammelse hver dag i 5-7 dage som beskrevet i trin 4.6-4.9.
  11. Analysér lammelsesdata med en log-rank-test, der er identisk med den, der bruges til at analysere levetiden. I denne statistiske analyse, er bevægelige orme scoret som "Alive", lammede orme er scoret som "Dead", og døde, sække, gut ekstruderet, udtørret, gravet, eller på anden måde tabt orme er scoret som "Censureret".
    BEMÆRK: I denne analyse angiver tallet "Procent i live" dyrene "Procent flytte". Det omvendte repræsenterer "Procent Lammet". Brug onlineanalyseværktøjet OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) til at udføre de statistiske analyser med lograng.

5. Måling neuron patologi: Commissure assay

  1. Generer transgene C. elegans udtrykke RAN peptid af interesse i GABAergic neuroner ved hjælp af unc-47 promotor. Også udtrykke unc-47p::GFP eller unc-47p::RFP at afsløre cellulære morfologi af GABA neuroner.
  2. Der plukkes 50 transgene L4-dyr, og de anbringes på en 6 cm OP50-plade ved 25 °C i 24 timer.
  3. De 50 transgene dyr overføres til en ny OP50-plade på 6 cm ved 25 °C i 24 timer.
  4. Lav agarose puder til billeddannelse dyrene under widefield mikroskopi.
    1. Placer to stykker tape oven på to mikroskopdias. Placer en renset slide uden tape i midten af de to tapede dias.
    2. Dispensere ~ 100 μL (1 dråbe fra en engangs plast Pasteur pipette) på 3% smeltet agarose på den midterste dias med en engangs steril overførsel pipette.
    3. Straks placere en anden ren slide over dråbe smeltet agarose, så det hviler på tapede dias og skaber et tyndt og jævnt lag af agarose mellem dias.
    4. Efter agarose er afkølet og størknet, forsigtigt fjerne de to dias med lag af agarose mellem dem, uden at adskille dem, og læg dem i en plastikpose med et fugtigt stykke papir under dem. Lav en slide pr 10 orme, der skal undersøges sammen med tre ekstra dias.
  5. De transgene C. elegans fjernes fra 25 °C-inkubatoren, og der plukkes 10 transgene C. elegans til en 100 μL dråbe på 10 mM levamisole i et glasfordybningsdias. Inkuber i 10 minutter, eller indtil dyrene er lammet.
  6. Fjern et glidepar fra plastikposen, og adskil dem forsigtigt. Skubet mærkes med agarose med genotypen, og der tilsættes 2 μL på 10 mM levamisole midt i agarose. Flyt de 10 dyr ind i levamisole på agarose pad. Dæk dyrene med en #1 tykkelse dæksel.
  7. Billede dyr, hvor vulva er orienteret, således at det er på højre side af dyret. Hvis vulva er på venstre side af hovedet, commissures af motoriske neuroner vil være under dyrene og ikke så klart synlige, hvilket gør nøjagtig kvantificering vanskelig. Udestår kvantificering fra disse dyr. I denne retning er de motoriske neuroners commissures tættest på dæksedlen og er tydeligt synlige på et omvendt widefield fluorescensmikroskop. Visualiser neuron commissures udtrykke GFP med en Leica DMI4000B omvendt widefield fluorescens mikroskop med en 63X 1,4 X NA olie nedsænkning linse og en Leica L5 GFP filter sæt (Ex480/40nm; Em527/30nm). Hvis neuron commissures udtrykke RFP i stedet for GFP, udnytte en Leica TX2 RFP filter sæt (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualiser neuron commissures udtrykke GFP med en omvendt widefield fluorescens mikroskop med en 63x 1,4 x NA olie nedsænkning linse og en GFP filter sæt (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Hvis neuron commissures udtrykke RFP i stedet for GFP, udnytte en rød fluorescerende protein (RFP) filtersæt (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Billede ormene inden for 45 min for at placere dæksel på orme for at minimere toksicitet fra immobilisering.
  9. For hver orm skal du tælle antallet af synlige commissures. Der er 16 synlige commissures hos vilde dyr af typen. Også tælle antallet af commissures, der har store perler (dvs. blebs) i commissures samt antallet af commissures, der er brudt. For at bekræfte, at kommunikatoren er gået i stykker, skal du følge kommunikationen fra rygledningen til ventilledningen ved at justere brændplanet.
    BEMÆRK: Commissures, hvor unc-47p::GFP fluorescens udviser et hul betragtes som brudt. En brækket commissure typisk har en bleb på hver side af pausen, hjælpe viser, at commissures er brudt. Tæl mængden af blebbing og pauser for 20 orme.
  10. Brøske fraktioner af commissures med blebs eller brud over det samlede antal observerede commissures for hvert dyr. Det absolutte antal commissures tælles pr dyr (herunder vild type, blebbed, og brudte begivenheder) kan også måles.
  11. For hver kategori beregnes middelværdien ± SD og analyseres statistisk med enten en elevs t-test til sammenligning mellem to populationer eller en envejs ANOVA til sammenligninger mellem 3 eller flere populationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte de analyser, der er beskrevet her, til at vurdere effekten af forskellige genhæmninger på toksiciteten af RAN-dipeptider, der findes hos ALS-patienter med en G4C 2-gentagelsesudvidelse.2 Ved hjælp af vækstanalysen til at måle udviklingstoksicitet analyserede vi virkningerne af flere genetiske knockoutmutanter identificeret i en genomdækkende RNAi-skærmsuppressorer af muskel-udtrykt PR50-GFP toksicitet. Mens udtryk for PR50-GFP alene resulterede i en fuldstændig penetrant vækst anholdelse, tab af funktionmutationer i flere gener undertrykt PR udviklingsmæssige toksicitet fra 12-94% (Figur 1A).

Vi målte også effekten af specifikke genknockdowns på den udviklingsmæssige motilitet af PR50-ekspressionerende dyr ved hjælp af videohastighedsanalysemetoden. Som forventet resulterede gfp(RNAi) i en stor stigning i motilitet sammenlignet med tom vektor (RNAi) på grund af hæmning af PR50-GFP-udtryk. Vi opdagede også, at RNAi mod proteasomsubunitrpn-7 resulterede i en betydelig stigning i PR50 motilitet (Figur 1B). rpn-7

ALS, ligesom mange neurodegenerative sygdomme, forekommer hos voksne. Derfor analyserede vi voksne fænotyper ved hjælp af aldersafhængig lammelsesanalyse. PR50-GFP udviste op til 80% lammelse med 5 dages alderen. Men RNAi rettet mod genet cul-6 betydeligt forsinket lammelse, hvilket tyder på, at cul-6 er nødvendig for PR50-GFP toksicitet (Figur 1C). Denne effekt var specifik for cul-6(RNAi), fordi cul-1(RNAi) ikke ændrede PR50-GFP toksicitet.

Neurodegenerative proteiner, såsom giftige RAN peptider, er almindeligt modelleret i kroppen væggen af C. elegans4,20,,21,22. Men, Det er også vigtigt at afgøre, om RAN proteiner forårsage neuropatologi når udtrykt i C. elegans neuroner, fordi neuron-specifik toksicitet er et fælles træk ved mange neurodegenerative sygdomme. Vi undersøgte neuron-specifik toksicitet ved hjælp af commissure assay. I dag 2 voksne, PR50-GFP udtryk i motoriske neuroner førte til en betydelig stigning i motorneuron blebbing. Denne neuropatologi blev signifikant undertrykt af en mutation i insulin/IGF receptor genhomolog daf-2, der forsinker de toksiske egenskaber af flere neurodegenerative proteiner23 (Figur 2B).

Figure 1
Figur 1: Analyser til vurdering af toksiciteten af muskel-udtrykt RAN peptider. (A) RAN peptid vækst assay. De angivne mutanter blev krydset ind i drIs34 (myo-3p::PR50-GFP)genetisk baggrund under gfp(RNAi) betingelser. Tal over hver genotype angiver antallet af afkom scoret for vækst. Alle genotyper har p < 0,05 ved hjælp af Fishers nøjagtige test i forhold til vild type. (B) Video hastighed analyse til måling ran peptid toksicitet under udviklingen. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) dyr blev dyrket under gfp (RNAi), tom vektor (RNAi), eller rpn-7 (RNAi) betingelser og derefter scoret for motilitet som beskrevet. Hastighed blev normaliseret til gfp (RNAi) behandlede dyr. De viste data er middelværdien ± SD, n = 40 for hver genotype. **-p < 0,01, ***- p < 0,001, envejs ANOVA med Tukey post-test. CC) Lammelsesanalyse til måling af toksicitet for aldersdebut. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) dyr blev dyrket på tom vektor (RNAi) ('WT'), cul-1 (RNAi), eller cul-6 (RNAi) og lammelse blev scoret som beskrevet hver 24 timer. ***-p < 0,001, log-rank test med Bonferroni korrektion efter test korrektion vs WT. n = 100 dyr pr genotype. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Analyse til måling af neuropatologi af motorneuron udtrykt RAN peptider. (A) Billeder af voksne C. elegans udtrykke unc-47p::GFP motor neuron reporter i vilde type eller unc-47p::PR50-GFP udtrykke dyr. Billederne for vilde type illustrerer normal commissure morfologi. Billeder repræsenterer flade Z-serie stakke opnået ved Widefield fluorescens mikroskopi. PR50 dyr demonstrere eksempler på commissure brud og blebbing. (B) Effekt af daf-2(e1370) på PR50 commissure blebbing. Punkter repræsenterer den procentvise blebbing commissures fra et enkelt dyr, med den gennemsnitlige og SD vist. n = 20 dyr pr. genotype **-p < 0,01, envejs ANOVA med Dunns post-hoc test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi metoder, der kan bruges til at assay RAN peptid toksicitet modelleret i musklen eller i neuroner af C. elegans. Mens neurodegenerative proteiner har en aldersdebut fænotype hos menneskelige patienter, kan de også udvise udviklingstoksicitet, når de overudtrykkes i modelsystemer. Overekspression har betydelige fortolkende begrænsninger, men det giver også et stærkt udgangspunkt for genetiske eller farmakologiske skærme med henblik på at identificere gener eller lægemidler, der kan vende giftige fænotyper. Dette er især vigtigt, da de mest præcise sygdomsmodeller for dyr enten ikke har fænotype eller svage fænotyper , der ikke er egnede til upartiske screeningsmetoder24,25,26. Vores C. elegans RAN peptid modeller og analyser repræsenterer en kraftfuld, supplerende tilgang til andre RAN peptid model systemer, såsom gær og Drosophila,for at forstå de cellulære veje vigtigt for toksiciteten af disse nyligt beskrevne proteiner.

Betinget toksicitet af muskel-udtrykt RAN peptider
Måling af RAN peptid toksicitet kræver en chase periode for eliminering af virkningerne af gfp (RNAi). Men tiden mellem fjernelse fra gfp (RNAi) og fremkomsten af fænotyper kan være inkonsekvent, hvis man ikke er omhyggelig med præcist at tid indledningen af forsøg, udvælgelse af iscenesatte dyr, temperaturskift, osv. Efterhånden som vi er blevet mere erfarne med disse analyser, er timingen og penetriancen af RAN peptidfænotyper blevet relativt konsekvente. Et af de mest kritiske trin i disse analyser er den korrekte skift af dyr til 25 °C. Uden dette skift udviser RAN peptider betydeligt svagere toksicitet. Dyr kan dog ikke hele tiden dyrkes ved 25 °C, fordi de ikke vokser og formerer sig, formentlig på grund af ran-peptidets højere baselineudtryk. Dette er ikke ulig situationen i gær eller Drosophila, hvor stammer, der udtrykker giftige RAN peptider holdes under eftergivende betingelser (dvs. lav temperatur), men derefter akut flyttet til restriktive betingelser (dvs. højere temperatur) før analysen13,15 for at forbedre peptid udtryk. I sådanne betingede udtrykssystemer kan genetiske tilstande, der forbedrer eller undertrykker toksicitet, skyldes ændringer i peptidekspressionsniveauer. For at afgøre, om genetiske modifikatans af RAN peptid toksicitet handle via ændringer i transgene ekspressionniveauer, vi tager to tilgange. For det første udtrykker mange af vores transgene stammer en anden RFP reporter under kontrol af den samme promotor, der bruges til at drive udtryk for RAN peptid. Ændringer i promotoraktivitet, der forårsager reduceret eller øget RAN peptid udtryk forårsage lignende reduktioner eller stigninger i RFP niveauer. Vi betragter mutanter eller RNAi betingelser, der væsentligt ændrer RFP niveauer til at handle ikke-specifikt. For det andet udfører vi kvantitativ PCR og Western blotting for at afgøre, om niveauet af RAN peptid mRNA eller protein ændres mellem betingelser. Men, Western-baserede påvisning af RAN peptider kan undertiden vise sig vanskeligt eller umuligt, som vi og andre har observeret med C9orf72-afledte RAN peptid PR50-GFP. I sådanne tilfælde kvantificerer vi in vivo GFP-niveauerne for at afgøre, om proteinekspressionen ændres mellem de forhold, der sammenlignes.

Udviklingsmæssige toksicitet: Fordele og begrænsninger
Tvungen overekspression af giftige RAN peptider i musklen fører ofte til udviklingsmæssige anholdelse i C. elegans. Selv om dette tydeligvis ikke efterligner sygdomme patologi, det giver et stærkt udgangspunkt for genetiske suppressor skærme, fordi RAN toksicitet suppressors er let identificeres som dyr, der vokser og reproducere i mangel af gfp (RNAi). Nogle suppressorer vil lette væksten på grund af reduktion af transgene udtryk. For at skelne mellem disse muligheder, vi generelt omfatter en anden RFP reporter drevet af den samme promotor i vores RAN peptid transgene stamme. Suppressors, der reducerer eller dæmper transgene udtryk, vil også udvise reducerede RFP-udtryksniveauer. På den anden side, suppressors, der udviser normale eller forhøjede RFP niveauer er usandsynligt, at fungere via reduktion af transgene udtryk. Meget gerne brugen af gær vækst eller Drosophila øje morfologi13,15,27, disse tilgange, mens ikke præcist modellering aspekter af sygdommen hos mennesker, giver en kraftfuld screening værktøj til den første identifikation af RAN peptid modifikatorer.

Post-udviklingsmæssige toksicitet (lammelse assay): Fordele og begrænsninger
Fordelen ved lammelsesanalysen er, at et relativt stort antal dyr (50-100) kan måles med værktøj til stede i ethvert ormelaboratorium. Lammelse er også en alvorlig fænotype, der er let opdages. Den vigtigste begrænsning af denne analyse er, at der er ufølsom over for bevægelsesfejl, der ikke forårsager fuldstændig lammelse. Sådanne fejl kan kræve mere følsomme og kvantitative metoder til at måle, såsom pryglassays eller kinematiskbevægelsesanalyser28. Lammelsesanalyser bør udføres blindet for genotype, hvis det er muligt, og der skal udvises forsigtighed for at sikre, at orme ikke udsættes for nogen anden form for stress (f.eks. kontaminering, sult), som kan påvirke analyseresultaterne betydeligt. C. elegans udtrykke giftige RAN peptider undertiden undlader at udvise en robust lammelse fænotype. Dette skyldes sandsynligvis vedvarende virkninger af gfp(RNAi) fortsat at undertrykke RAN peptid udtryk. I disse tilfælde, hvis vi ikke observerer signifikant lammelse (>10%) i den tomme vektor (RNAi) kontrol dyr efter dag 2, vi typisk opsige analysen og indlede en anden replikat. En ændring af denne analyse kunne indebære brug af alternative inducible RAN peptid ekspressionssystemer. Den eneste anden almindeligt anvendte uibiliserbare udtryk system for C. elegans er varmechok promotor. Men, den nødvendige varmechok kan forårsage stress reaktioner, der kan påvirke toksiciteten af proteiner. Den fremtidige anvendelse af andre betingede udtrykssystemer, såsom auxin-inducible degron (AID) system29, kunne i væsentlig grad forbedre vores evne til at studere RAN peptid toksicitet.

Neurodegeneration/commissure assay: Fordele og begrænsninger
Motor neuron commissures i C. elegans repræsenterer axon af en motor neuron passerer mellem ventrale og dorsale nervøse snore. Blebbing og brud kan let påvises i de isolerede commissures, så neurodegeneration hurtigt kan kvantificeres i levende dyr (Figur 2). Mens undersøge dyrene, er det vigtigt, at de ikke inkubere i levamisole i en længere periode, da dette kan forårsage for tidlig død af dyr, hvilket fører til neuronal blebbing og brud i mangel af giftige RAN peptid. I nogle tilfælde er commissures helt degenereret og ikke længere synlige. Derfor kan de ikke scores for neuropatologiske funktioner, fordi vores analyse måler procentdelen af commissures brudt eller blebbing ud af det samlede antal observerede commissures. I disse tilfælde kan commissure assay undervurdere effekten af RAN peptid.

Afslutningsvis er de analyser, der er beskrevet i dette dokument, nyttige til måling af toksicitet forårsaget af RAN-peptider i C. elegans. Brug af gfp(RNAi) til at regulere ekspressionen af proteinerne gør det muligt at observere postudviklingsfænotyper. Vores tilgange kan nemt tilpasses til at udføre store genetiske skærme for suppressors eller smagsforstærkere af toksicitet. Sekundære analyser, såsom lammelse assay og commissure assay kan bekræfte, at toksicitet er undertrykt post-udviklingsmæssigt og teste, om mekanismen for undertrykkelse er bevaret i neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Tags

Biologi Problem 158 neurodegeneration ALS Huntingtons Sygdom C9orf72 proteoktoksicitet gentagne ekspansionsforstyrrelser
Måling ran peptid toksicitet i <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N.,… More

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter