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Biology

Mesurer RAN Peptide Toxicity à C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Les produits translationnels non dépendants à l’ATG associés à répétition sont des caractéristiques pathogènes émergentes de plusieurs maladies à base d’expansion répétée. Le but du protocole décrit est d’évaluer la toxicité causée par ces peptides à l’aide d’essais comportementaux et cellulaires dans le système modèle C. elegans.

Abstract

C. elegans est couramment utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives liées à l’âge causées par des mutations d’expansion répétée, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Huntington. Récemment, l’ARN contenant l’expansion répétée s’est avéré être le substrat d’un nouveau type de traduction de protéine appelé traduction non-dépendante de l’AUG (RAN) associée à la répétition. Contrairement à la traduction canonique, la traduction RAN ne nécessite pas de codon de démarrage et ne se produit que lorsque les répétitions dépassent une longueur de seuil. Parce qu’il n’y a pas de codon de démarrage pour déterminer le cadre de lecture, la traduction RAN se produit dans toutes les images de lecture à partir de modèles d’ARN de sens et d’antisense qui contiennent une séquence d’expansion répétée. Par conséquent, la traduction DE RAN augmente le nombre possible de peptides toxiques associés à la maladie possible de un à six. Jusqu’à présent, la traduction RAN a été documentée dans huit différentes maladies neurodégénératives et neuromusculaires basées sur l’expansion récidiviste. Dans chaque cas, le déchiffrement des produits RAN qui sont toxiques, ainsi que leurs mécanismes de toxicité, est une étape critique vers la compréhension de la façon dont ces peptides contribuent à la pathophysiologie de la maladie. Dans cet article, nous présentons des stratégies pour mesurer la toxicité des peptides RAN dans le système modèle C. elegans. Tout d’abord, nous décrivons les procédures pour mesurer la toxicité du peptide RAN sur la croissance et la motilité du développement de C. elegans. Deuxièmement, nous détaillons un essai pour mesurer les effets postdéveloppementaux et dépendants de l’âge des peptides RAN sur la motilité. Enfin, nous décrivons un essai de neurotoxicité pour évaluer les effets des peptides RAN sur la morphologie des neurones. Ces essais fournissent une évaluation large de la toxicité du peptide RAN et peuvent être utiles pour effectuer des écrans génétiques ou à petites molécules à grande échelle pour identifier les mécanismes ou les thérapies de la maladie.

Introduction

L’expansion inappropriée des séquences répétées d’ADN est la base génétique de plusieurs maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (FTD) et la maladie de Huntington (HD)1. Bien qu’il existe des modèles cellulaires et animaux établis pour ces maladies, les mécanismes sous-jacents à ces conditions ne sont pas bien définis. Par exemple, la MH est causée par l’expansion d’une séquence de répétition CAG dans la séquence de codage pour la protéine Huntingtin Htt2. Puisque CAG code la glutamine d’acide aminé, l’expansion de répétition de CAG a comme conséquence l’insertion d’une séquence de polyglutamine, ou polyQ, dans Htt. Les protéines polyQ élargies forment des agrégats de protéine de longueur et d’âge-dépendants qui sont associés à la toxicité3,4. Étonnamment, deux études récentes suggèrent que la longueur de la séquence de polyQ n’est pas le principal moteur de l’apparition de la maladie MH, suggérant que des facteurs polyQ-indépendants peuvent également contribuer à la maladie5,6.

Un mécanisme possible polyQ-indépendant implique un type nouvellement découvert de traduction de protéine appelée Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) traduction7. Comme son nom l’indique, la traduction RAN ne se produit que lorsqu’une séquence de répétition élargie est présente et ne nécessite pas de codon de démarrage canonique. Par conséquent, la traduction RAN se produit dans les trois cadres de lecture de la répétition pour produire trois polypeptides distincts. En outre, parce que de nombreux gènes produisent également une transcription antisense qui contient le complément inverse de la séquence de répétition élargie, la traduction RAN se produit également dans les trois cadres de lecture de la transcription antisense. Ensemble, la traduction DE RAN augmente le nombre de protéines produites à partir d’une séquence d’ADN répétée élargie d’un peptide à six peptides. À ce jour, la traduction RAN a été observée dans au moins huit différents troubles d’expansion de répétition8. Peptides RAN sont observés dans les échantillons post mortem patient et seulement dans les cas où le patient porte une répétition élargie9,10. Tandis que ces peptides sont clairement présents dans les cellules patientes, leur contribution à la pathophysiologie de maladie n’est pas claire.

Pour mieux définir la toxicité potentielle associée aux peptides RAN, plusieurs groupes ont exprimé chaque peptide dans divers systèmes modèles, tels que la levure, les mouches, les souris et les cellules de culture tissulaire11,12,13,14,15,16. Plutôt que d’utiliser la séquence de répétition pour l’expression, ces modèles utilisent une approche de codon-variation dans laquelle la séquence de répétition est éliminée mais la séquence d’acide aminé est préservée. L’initiation de traduction se produit par un ATG canonique et le peptide est généralement fusionné à une protéine fluorescente au N- ou C-terminus, aucun de qui ne semble interférer avec la toxicité du peptide RAN. Par conséquent, chaque construction surexprime un seul peptide RAN. Modéliser les différents produits RAN dans un organisme multicellulaire avec des essais simples pour mesurer la toxicité du peptide RAN est d’une importance vitale pour comprendre comment les différents produits RAN de chaque expansion récidivante causant la maladie contribuent au dysfonctionnement cellulaire et à la neurodégénérescence.

Comme d’autres systèmes modèles, C. elegans fournit une plate-forme expérimentale flexible et efficace qui permet des études de nouveaux mécanismes de maladie, tels que la toxicité du peptide RAN. Les vers offrent plusieurs attributs expérimentaux uniques qui ne sont pas actuellement disponibles dans d’autres modèles de toxicité du peptide RAN. Tout d’abord, C. elegans sont optiquement transparents de la naissance jusqu’à la mort. Cela permet une visualisation simple de l’expression et de la localisation du peptide RAN, ainsi que l’analyse in vivo de la neurodégénérescence chez les animaux vivants. Deuxièmement, les méthodes transgéniques pour générer des modèles d’expression peptide RAN sont peu coûteuses et rapides. Étant donné le cycle de vie court de trois jours de C. elegans, les lignes transgéniques stables exprimant n’importe quel peptide RAN donné d’une manière spécifique de type cellulaire peuvent être produites en moins d’une semaine. Troisièmement, de simples sorties phénotypiques peuvent être combinées avec des méthodes de dépistage génétique, telles que la mutanèse chimique ou le dépistage de l’ARNi, afin d’identifier rapidement les gènes essentiels à la toxicité du peptide RAN. Enfin, la courte durée de vie de C. elegans (20 jours) permet aux chercheurs de déterminer comment le vieillissement, qui est le plus grand facteur de risque pour la plupart des maladies d’expansion répétée, influence la toxicité du peptide RAN. Ensemble, cette combinaison d’attributs expérimentaux est inégalée dans tout autre système modèle et offre une plate-forme puissante pour l’étude de la toxicité du peptide RAN.

Ici, nous décrivons plusieurs essais qui tirent parti des avantages expérimentaux de C. elegans pour mesurer la toxicité des peptides RAN et pour identifier les modificateurs génétiques de cette toxicité. Les peptides RAN codon-variés ATG-initiés sont marqués avec GFP et exprimés individuellement dans les cellules musculaires sous le promoteur de myo-3 ou dans les neurones moteurs GABAergic sous le promoteur unc-47. Pour l’expression dans les cellules musculaires, il est important que les peptides RAN toxiques soient étiquetés avec des protéines fluorescentes vertes (GFP), ou d’autres protéines fluorescentes (FP) qui peuvent être ciblées avec un vecteur d’alimentation RNAi. C’est parce que l’expression toxique de peptide de RAN bloque habituellement la croissance, rendant de telles souches non viables. L’utilisation de gfp (RNAi) inactive sous condition l’expression du peptide RAN et permet l’entretien des souches, les croix génétiques, etc. Pour les essais, ces animaux sont retirés de gfp (RNAi), ce qui permet l’expression du peptide RAN et des phénotypes qui en résultent. En plus de la stratégie moléculaire pour concevoir des constructions d’expression peptide RAN codon-variées, nous décrivons des essais pour mesurer la toxicité développementale (motilité larvaire et analyse de croissance), toxicité post-développementale associée à l’âge (analyse de paralysie), et défauts morphologiques neuronaux (essai de commissure).

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Protocol

1. Génération de constructions d’expression de peptide RAN codon-variées

  1. Concevez la séquence individuelle de codage du peptide RAN en utilisant des codons synonymes pour éliminer la structure fondamentale répétitive de l’ADN et de l’ARN, mais préserver la séquence d’acides aminés qui surlyse.
  2. Commandez les séquences de codon personnalisées commercialement aux durées répétées nécessaires pour les études (généralement 5 à 100 répétitions). Inclure un site de restriction HindIII à l’extrémité 5' et un site de restriction BamHI à la fin 3' pour faciliter le clonage dans les vecteurs d’expression C. elegans, tels que pPD95.79.
    REMARQUE : Si la synthèse de plus grandes constructions s’avère difficile, de plus petites séquences de blocs de construction peuvent être synthétisées puis intégrées dans de plus grandes répétitions à l’aide d’une stratégie de ligature directionnelle17.
  3. Subclone la séquence de peptide dans un vecteur d’expression C. elegans à l’aide de méthodes de ligature T4 standard.
  4. Subclone une séquence de promoteur spécifique au type de cellule générée par PCR devant la séquence de peptide RAN pour conduire l’expression de peptide-GFP spécifique aux tissus.
  5. Microinjecter la construction de peptide RAN dans le gonad de type sauvage C. elegans pour générer des souches transgéniques contenant des tableaux extrachromosomiques en utilisant des méthodes standard18. Pour un marqueur de co-injection, le journaliste de la DP spécifique au muscle(myo-3p::RFP (pCFJ104)) a été utilisé, bien que d’autres marqueurs peuvent être utilisés ainsi.
  6. Intégrer un transgène stable dans le génome à l’aide des méthodes standard de dépistage de l’intégration C. elegans 19.
  7. Si le peptide RAN est toxique et que les animaux transgéniques ne survivent pas, nourrir les animaux gfp (RNAi) exprimant des bactéries avant et après l’injection pour réduire au silence l’expression de la protéine toxique.
    REMARQUE : L’enlèvement des animaux du gfp (RNAi) permet l’expression du peptide RAN pour des analyses phénotypiques à l’aide des essais décrits ci-dessous.

2. Mesurer la toxicité développementale des peptides RAN suite à l’élimination du gène à base de RNAi : Protocole d’analyse de la vitesse vidéo

  1. Verser le milieu de croissance des nématodes standard (NGM) RNAi 24 plaques de puits avec 1 mM isopropyl --D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et 25 'g/mL carbenicillin.
  2. Écartez les clones d’arni-alimentation dans les bactéries HT115 à tester sur le bouillon de Luria (LB) - la carbenicilline (25 g/mL) des plaques d’agar et cultivez des bactéries à 37 oC pendant 24 h. Inclure le vecteur vide (ARI) comme contrôle positif de la toxicité et du gfp (RNAi) comme contrôle négatif.
  3. Pour chaque clone, choisissez une colonie unique en 1 ml de support liquide de LB et de carbenicilline et cultivez des bactéries pendant la nuit pendant 18 heures à 37 oC tout en secouant à 250 rotations par minute (RPM).
  4. Repérer quatre puits individuels des puits NGM RNAI 24 avec 20 l 'L des cultures bactériennes de nuit suivantes: colonne 1 puits 'gfp(RNAi); colonne 2 puits et (EV)RNAi; colonnes 3 à 6 puits et ARNi contre les gènes à tester. Permettre aux bactéries RNAi d’induire la production d’ARRN pendant la nuit à température ambiante (RT).
  5. Isoler les œufs du premier jour adulte C. elegans exprimant le transgene retraçage retragraphié intégré en utilisant la méthode standard d’hypochlorite et la graine de 30 oeufs D’elegans dans chaque puits de la plaque de puits NGM RNAi 24.
  6. Incuber les 24 puits à 20 oC pendant 7 jours.
    REMARQUE : Ce temps d’incubation est pour les souches exprimant des dipeptides toxiques de C9orf72 RAN, tels que PR50 ou GR50. D’autres souches peuvent nécessiter des temps d’incubation plus courts pour prévenir l’épuisement de la source de nourriture bactérienne et la famine subséquente.
  7. Acquérir des vidéos lumineuses transmises à l’aide d’un microscope à disséquer stéréo Leica MZ16FA équipé d’une caméra monochrome DFC345FX connectée à un PC compatible Windows exécutant un logiciel d’acquisition vidéo Leica AF (version 2.6.0.7266).
    1. Acquérir deux vidéos à partir de deux puits distincts pour chaque condition d’ARNi en utilisant des paramètres d’acquisition vidéo cohérents entre les puits. Pour chaque vidéo, acquérez 10 secondes à 800 x 600 pixels de résolution et 13,16 images par seconde (dimension voxel temps - 0,076 secondes) en utilisant 18,6X grossissement (1,49 réglage de zoom dans le logiciel AF). Définissez le temps d’exposition à l’image à 4 millisecondes. Étiquetez chaque vidéo immédiatement avec la souche, l’état d’ARNi, et le nombre de puits.
  8. Aveuglez l’expérimentateur au génotype associé à chaque fichier vidéo en randomisant l’ordre des vidéos et en changeant le nom des vidéos en nombres. Enregistrer ce groupe de vidéos comme un nouveau fichier. Non aveugle l’expérimentateur après l’analyse est terminée.
  9. Mesurer la « distance parcourue » et la longueur de chaque animal pour 20 animaux différents de chaque vidéo, en examinant un total de 40 vers pour chaque condition d’ARNi.
    1. Dans le logiciel, sélectionnez le bouton des outils d’annotation, puis l’outil de texte de tirage. Cliquez sur un point au centre du ver mesuré dans la première image de la vidéo et marquez-le comme un nombre. Avancez la vidéo jusqu’à la fin tout en suivant visuellement le chemin de mouvement du ver. Dans le dernier cadre, cliquez sur un point au centre du ver mesuré et marquez le nombre correspondant suivant. Ensuite, à l’aide de l’outil de barre d’échelle de tirage, tracez une ligne du premier numéro au deuxième numéro pour enregistrer la « distance parcourue ».
    2. 'Distance parcourue' est la distance entre les deux points centroïdes. Cette distance est affichée à côté de la ligne de mesure. Enregistrez cette mesure dans une feuille de calcul. Répétez cette mesure pour 19 autres vers dans la vidéo tout en préservant chaque mesure individuelle dans la fenêtre d’analyse.
  10. Faites des mesures à partir d’animaux présentant le mouvement le plus robuste pour éviter la sélection d’animaux ne présentant aucun mouvement et biaisant les données vers la paralysie. Une fois les mesures terminées, prenez un instantané du cadre vidéo final illustrant toutes les lignes de mesure afin que les données puissent être retracées à l’animal d’où il provient.
  11. Analyser les données à l’aide d’une feuille de calcul à colonnes à quatre colonnes. Colonne un est le ver "identifiant", colonne deux est la distance parcourue / temps (vitesse).
    1. Le temps de chaque vidéo peut être trouvé en cliquant à droite sur la vidéo dans le cadre de l’expérience et en allant aux propriétés de la vidéo.
  12. Normaliser la mesure de vitesse en trouvant la longueur de chaque animal en sélectionnant Quantify, puis statistiques sur le logiciel. En cliquant sur l’icône de l’outil d’annotation sur l’écran vidéo devrait permettre l’utilisation de l’outil "Draw Polyline". Cet outil peut ensuite être utilisé pour tracer librement les C. elegans de la vidéo de la pointe de la tête à la pointe de la queue. La longueur de la ligne sera enregistrée selon les statistiques.
    1. Prenez un instantané du cadre vidéo final illustrant tous les polylines utilisés pour dimensionner le C. elegans afin que les données puissent être retracées à l’animal d’où ils proviennent.
  13. Analyser les données en ajoutant deux colonnes supplémentaires à la feuille de calcul. La colonne trois est la « longueur animale », et la colonne quatre est la « vitesse normalisée » (vitesse/longueur d’animal). Analyser les données de vitesse normalisées à l’aide d’un ANOVA à sens unique avec des tests post-hoc par rapport au vecteur vide (RNAi).

3. Mesurer la toxicité développementale du peptide RAN : analyse de croissance

  1. Choisissez 30 animaux gravidés dans une tache de 50 l de solution hypochlorite (10 ml d’eau de Javel, 2,5 ml de N NaOH, 37,5 ml de dH2O) soit sur une gfp (RNAi), (EV)RNAi, soit (spécifique au gène) 6 cm RNAi.
  2. Après 24 h, déplacez six progéniture transgéniques qui ont rampé hors de la tache de solution d’hypochlorite à une nouvelle plaque de 6 cm d’ARNi identique aux conditions d’ARAi sur la plaque sur laquelle ils ont été soumis au traitement de solution d’hypochlorite. Mettez ces descendants (F1) à 20 oC pour croître et se reproduire.
  3. Après 24-48 h, choisissez 10 animaux transgéniques L4 sur 6 cm RNAi correspondant aux conditions d’ARNi sur lesquelles les animaux ont grandi. Laisser les animaux léguminer pondez des œufs pendant 24 h dans un incubateur de 20 oC.
  4. Après 24 h, retirez les animaux adultes et jetez-les. Comptez le nombre d’œufs et de larves de L1 pondus pendant la période de 24 h à l’aide d’un comptoir portatif mécanique. C’est la taille totale de la couvée.
  5. Au cours des 72 h suivants, compter le nombre d’animaux qui atteignent le stade L4 ou plus. Comme chaque animal est compté, retirez-le de l’assiette.
  6. Quantifiez la « croissance du pourcentage » comme le pourcentage d’animaux qui atteignent le stade L4 ou plus ancien de la taille totale de la couvée.
  7. Effectuez un test exact de 2 x 2 Fisher par rapport au vecteur vide (ARNi) pour déterminer si la croissance en pourcentage est statistiquement significative. Les catégories à comparer sont « Croissance » (d’animaux qui ont atteint le stade L4 ou plus âgé en 72 h) et « Pas de croissance » (taille totale de la couvée moins le nombre d’animaux atteignant L4 ou plus à l’étape en 72 h).

4. Essai de paralysie du peptide RAN post-développemental

  1. Maintenir les souches transgéniques intégrées de C. elegans exprimant le peptide-GFP RAN dans le muscle sur le gfp(RNAi) en plaçant des L4 transgéniques de 4 à 6 cm sur une plaque de 6 cm de gfp(RNAi) et cultivent les vers à 20 oC.
  2. Si l’expérience utilise des ARNI pour tester les effets génétiques sur la toxicité du peptidium RAN, déplacer 10 adultes transgéniques graviés d’une plaque non affamée à chacun des deux vecteurs videsde 6 cm (ARNi) (contrôle positif pour la paralysie, contrôle négatif des effets génétiques), gfp (ARNi) (contrôle négatif pour la paralysie, contrôle positif des effets génétiques), gène spécifique (RNAi) (c.-à-d., 10 adultes gravidés par plaque de 6 cm). gene-specific
  3. Si des mutants sont utilisés pour analyser les effets génétiques sur la toxicité du peptide RAN, placez 10 animaux gravités WT ou mutants exprimant le même transgène RAN sur chacun des deux plaques vides devecteur de 6 cm (ARNI) ou gfp (ARNI). Cultivez les vers à 20 oC pendant 48 h.
  4. Choisissez 10 ensembles de 10 L4 transgéniques des plaques de 6 cm d’ARNi et placez-les sur une plaque de 3 cm d’ARNi (c.-à-d. n - 100 animaux pour chaque génotype). Assurez-vous que le L4 est sélectionné pour l’essai ont tous une motilité superficiellement normale. Placer les plaques dans un sac de rangement à fermeture éclair pour retenir l’humidité.
  5. Placez les assiettes ensachées avec L4 dans l’incubateur de 25 oC.
  6. Retirez les animaux 24 h plus tard de l’incubateur de 25 oC une souche à la fois pour minimiser la durée pendant laquelle ils sont à RT.
  7. Appuyez sur les plaques sur le microscope disséquant pour vérifier le mouvement. Si les animaux se déplacent plus d’une longueur de corps, comptez l’animal comme mobile et transférez-le à une nouvelle plaque d’ARNi de 3 cm. Utilisez un pic de platine pour taper sur les vers restants sur la tête ou la queue. Si l’animal se déplace plus d’une longueur de corps, comptez l’animal comme mobile et transférez-le à une nouvelle plaque d’ARNi de 3 cm.
    REMARQUE : Ne dépassez pas 10 vers par assiette lors du transfert. Veillez à éviter de déplacer la progéniture vers la nouvelle plaque d’ARNi parce que l’essai dépend de suivre les animaux âgés seulement.
  8. Regroupez tous les vers non-mouvants ensemble de sorte que le mouvement de plus d’une longueur de corps peut facilement être détecté. Donnez à l’animal au moins une minute pour déplacer plus d’une longueur du corps. S’il ne bouge toujours pas, il est paralysé, ensaché (c.-à-d. les larves éclos à l’intérieur de la mère), ou mort.
  9. Censurer les animaux qui présentent l’ensachage, desséquer sur les côtés de l’assiette, exposer des intestins extrudés, creuser, se perdre, ou mourir de l’essai au moment de la détection. Les vers paralysés sont comptés, laissés sur l’ancienne plaque d’ARNi, et jetés.
  10. Marquez les animaux pour la paralysie tous les jours pendant 5-7 jours comme décrit dans les étapes 4.6-4.9.
  11. Analyser les données de paralysie avec un test de classement de journal identique à celui utilisé pour analyser la durée de vie. Dans cette analyse statistique, les vers mobiles sont marqués comme "Vivant", les vers paralysés sont marqués comme "Mort", et morts, ensachés, intestin extrudés, desséchés, creusés, creusés, ou autrement perdus vers sont marqués comme "censuré".
    REMARQUE : Dans cette analyse, le nombre « Pourcentage vivant » indique les animaux « En mouvement de pourcentage ». L’inverse représente le "Percent Paralyzed". Utilisez l’outil d’analyse en ligne OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) pour effectuer les analyses statistiques de classement journal.

5. Mesure de la pathologie neuronale : Commissure assay

  1. Générer transgénique C. elegans exprimant le peptide RAN de l’intérêt pour les neurones GABAergic en utilisant le promoteur unc-47. Aussi exprimer unc-47p::GFP ou unc-47p::RFP pour révéler la morphologie cellulaire des neurones GABA.
  2. Choisissez 50 animaux transgéniques L4 et placez-les sur une plaque OP50 de 6 cm à 25 oC pendant 24 h.
  3. Transférer les 50 animaux transgéniques sur une nouvelle plaque OP50 de 6 cm à 25 oC pendant 24 h.
  4. Faire des tampons d’agarose pour l’imagerie des animaux sous microscopie à champ large.
    1. Déposer deux morceaux de ruban adhésif sur deux lames de microscope. Placer une glissière nettoyée sans ruban adhésif au milieu des deux toboggans scotchés.
    2. Distribuer 100 l (1 goutte d’une pipette pasteur en plastique jetable) de 3% d’agarose fondue sur la glissière du milieu avec une pipette de transfert stérile jetable.
    3. Placez immédiatement une deuxième glissière propre sur la goutte d’agarose fondue de sorte qu’elle repose sur les toboggans scotchés et crée une fine couche d’agarose entre les toboggans.
    4. Une fois que l’agarose s’est refroidie et solidifiée, retirez soigneusement les deux diapositives avec la couche d’agarose entre elles, sans les séparer, et placez-les dans un sac en plastique avec un morceau de papier humide sous eux. Faire une diapositive par 10 vers à examiner avec trois diapositives supplémentaires.
  5. Retirez les C. elegans transgéniques de l’incubateur de 25 oC et choisissez 10 C. elegans transgéniques dans une chute de 100 ll de levamisole de 10 mM dans une glissière de dépression de verre. Incuber pendant 10 min ou jusqu’à ce que les animaux soient paralysés.
  6. Retirer une paire de diapositives du sac en plastique et les séparer soigneusement. Étiqueter la la glissière avec l’agarose avec le génotype et ajouter 2 ll de levamisole de 10 mM au milieu de l’agarose. Déplacez les 10 animaux dans le levamisole sur la garniture d’agarose. Couvrir les animaux d’un housse d’épaisseur #1.
  7. Image des animaux dans lesquels la vulve est orientée de telle sorte qu’elle est sur le côté droit de l’animal. Si la vulve est sur le côté gauche de la tête, les commissures des neurones moteurs seront sous les animaux et pas aussi clairement visibles, ce qui rend la quantification précise difficile. Quantification de ces animaux. Dans cette orientation, les commissures des neurones moteurs sont les plus proches du coverlip et sont clairement visibles sur un microscope à fluorescence à champ large inversé. Visualisez les commissures de neurone exprimant GFP avec un microscope à fluorescence large inversé Leica DMI4000B avec une lentille d’immersion d’huile 63X 1.4X NA et un ensemble de filtre Leica L5 GFP (Ex480/40nm ; Em527/30nm). Si les commissaires neuronaux expriment la DP au lieu de la PAF, utilisez un ensemble de filtres Leica TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualisez les commissures de neurone exprimant GFP avec un microscope à fluorescence à champ large inversé avec une lentille d’immersion d’huile 63x 1.4x NA et un ensemble de filtre GFP (Ex480/40 nm ; Em527/30 nm). Si les commissaires neuronaux expriment la DP au lieu de la PAF, utilisez un ensemble de filtres de protéines fluorescentes rouges (DP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Imagez les vers dans les 45 minutes de placer le coverlip sur les vers pour minimiser la toxicité de l’immobilisation.
  9. Pour chaque ver, comptez le nombre de commissaires visibles. Il y a 16 commissaires visibles chez des animaux de type sauvage. Comptez également le nombre de commissaires qui ont de grandes perles (c.-à-d. blebs) dans les commissaires ainsi que le nombre de commissaires qui sont brisés. Pour confirmer que la commissure est cassée, suivez la commissure du cordon dorsal au cordon ventral en ajustant le plan focal.
    REMARQUE : Les commisures dans lesquelles le unc-47p ::GFP fluorescence montre un écart sont considérés comme cassés. Une commissure cassée a généralement une bêle de chaque côté de la pause, aidant à montrer que les commissaires sont cassés. Comptez la quantité de blebbing et de pauses pour 20 vers.
  10. Calculez la fraction des commissures avec des blebs ou des ruptures sur le nombre total de commissaires observés pour chaque animal. Le nombre absolu de commissaires comptés par animal (y compris le type sauvage, le saignement et les événements brisés) peut également être mesuré.
  11. Pour chaque catégorie, calculez la moyenne de DD et analysez statistiquement avec le t-test d’un étudiant pour la comparaison entre deux populations, soit un ANOVA à sens unique pour les comparaisons entre 3 populations ou plus.

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Representative Results

Nous avons utilisé les essais décrits ici pour évaluer l’effet de différentes inhibitions de gène sur la toxicité des dipeptides RAN qui se trouvent dans les patients de SLA présentant une expansion de répétition de G4C2. En utilisant l’essai de croissance pour mesurer la toxicité développementale, nous avons analysé les effets de plusieurs mutants génétiques knock-out identifiés dans un suppresseurs d’écran RNAi à l’échelle du génome de la toxicité PR50-GFP exprimée par muscle. Alors que l’expression de PR50-GFP seul a entraîné une arrêt de croissance complètement pénitencier, la perte de mutations de fonction dans plusieurs gènes supprimé toxicité développementale PR de 12-94% (figure 1A).

Nous avons également mesuré l’effet de chocs génétiques spécifiques sur la motilité développementale des animaux exprimant PR50 en utilisant la méthode d’analyse de vitesse vidéo. Comme prévu, le gfp (ARNi) a entraîné une forte augmentation de la motilité par rapport au vecteur vide (ARNi) dû à l’inhibition de l’expression PR50-GFP. Nous avons également découvert que les ARNi contre le protéasome subunit rpn-7 ont entraîné une augmentation significative de la motilité PR50(figure 1B).

La SLA, comme de nombreuses maladies neurodégénératives, survient chez les adultes. Par conséquent, nous avons analysé les phénotypes adultes utilisant l’essai de paralysie âge-dépendant. PR50-GFP a montré jusqu’à 80% de paralysie par 5 jours d’âge. Cependant, RNAi dirigé vers le gène cul-6 significativement retardé la paralysie, ce qui suggère que cul-6 est nécessaire pour la toxicité PR50-GFP (figure 1C). Cet effet était spécifique au cul-6 (ARNi) parce que cul-1 (ARNi) n’a pas modifié la toxicité PR50-GFP.

Les protéines neurodégénératives, telles que les peptides ran toxiques, sont généralement modélisé dans la paroi du corps de C. elegans4,20,21,22. Cependant, il est également important de déterminer si les protéines RAN causent la neuropathologie lorsqu’elles sont exprimées dans les neurones C. elegans, parce que la toxicité neuronale-spécifique est une caractéristique commune de nombreuses maladies neurodégénératives. Nous avons examiné la toxicité neuronale-spécifique utilisant l’essai de commissure. Dans le jour 2 adultes, l’expression PR50-GFP dans les neurones moteurs a conduit à une augmentation significative de la blebbing de neurone moteur. Cette neuropathologie a été considérablement supprimée par une mutation dans l’homolog de gène de récepteur d’insuline/IGF daf-2 qui retarde les propriétés toxiques de plusieurs protéines neurodégénératives23 (figure 2B).

Figure 1
Figure 1 : Essais pour évaluer la toxicité des peptides RAN exprimés par muscle. (A) RAN peptide croissance assay. Les mutants indiqués ont été croisés dans les drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) fond génétique sous gfp (RNAi) conditions. Les nombres au-dessus de chaque génotype indiquent le nombre de descendants marqués pour la croissance. Tous les génotypes ont p 'lt; 0.05 en utilisant le test exact du pêcheur par rapport au type sauvage. (B) Analyse de vitesse vidéo pour mesurer la toxicité du peptide RAN pendant le développement. les animaux drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) ont été cultivés sous gfp (RNAi), vecteur vide (RNAi), ou rpn-7 (RNAi) conditions, puis marqué pour la motilité comme décrit. La vitesse a été normalisée aux animaux traités par gfp (RNAi). Les données montrées sont moyennes ' SD, n ' 40 pour chaque génotype. ANOVA à sens unique avec Tukey après le test. (C) Essai de paralysie pour mesurer la toxicité de début d’âge. les animaux drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) ont été cultivés sur vecteur vide (RNAi) ('WT'), cul-1 (RNAi), ou cul-6 (RNAi) et la paralysie a été notée comme décrit tous les 24 h. Test de rang de rondins avec Bonferroni post-test contre WT. n. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Assay pour mesurer la neuropathologie du neurone moteur exprimé PEPtides RAN. (A) Images de C. elegans adultes exprimant le unc-47p::GFP moteur neuron reporter dans le type sauvage ou unc-47p::PR50-GFP exprimant des animaux. Les images pour type sauvage illustrent la morphologie normale de commissure. Les images représentent des piles aplaties de la série Z obtenues par microscopie à fluorescence à large champ. Les animaux PR50 démontrent des exemples de rupture de commissure et de blebbing. (B) Effet de daf-2 (e1370) sur PR50 commissure blebbing. Les points représentent les commissures de blebbing pour cent d’un seul animal, avec la moyenne et SD montré. n 20 animaux par génotype '-p’lt; 0.01, ANOVA à sens unique avec le test post-hoc de Dunn. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ici, nous rapportons des méthodes qui peuvent être utilisées pour assayer la toxicité du peptide RAN modélisé dans le muscle ou dans les neurones de C. elegans. Tandis que les protéines neurodégénératives ont un phénotype d’âge de début dans les patients humains, elles peuvent également montrer la toxicité développementnelle une fois surexprimées dans des systèmes modèles. La surexpression a des limitations d’interprétation importantes, mais elle fournit également un point de départ puissant pour les écrans génétiques ou pharmacologiques visant à identifier les gènes ou les médicaments qui peuvent inverser les phénotypes toxiques. Ceci est particulièrement important étant donné que la plupart des modèles animaux précis de la maladie n’ont pas de phénotype ou de phénotypes faibles ne convient pas aux approches impartiales de dépistage24,25,26. Nos modèles de peptide et d’essais C. elegans RAN représentent une approche puissante et complémentaire à d’autres systèmes de modèle de peptide RAN, tels que la levure et Drosophila,pour comprendre les voies cellulaires importantes pour la toxicité de ces protéines nouvellement décrites.

Toxicité conditionnelle des peptides RAN exprimés par les muscles
Mesurer la toxicité du peptide RAN nécessite une période de poursuite pour l’élimination des effets du gfp (RNAi). Cependant, le temps entre l’enlèvement du gfp (ARNI) et l’émergence de phénotypes peut être incohérent si le soin n’est pas pris au moment précis de l’initiation des expériences, la sélection des animaux mis en scène, les changements de température, etc. Comme nous sommes devenus plus expérimentés avec ces essais, le moment et la pénitence des phénotypes de peptide RAN est devenu relativement cohérent. L’une des étapes les plus critiques de ces essais est le bon passage des animaux à 25 oC. Sans ce changement, les peptides RAN présentent une toxicité significativement plus faible. Cependant, les animaux ne peuvent pas être continuellement cultivés à 25 oC parce qu’ils ne poussent pas et ne se reproduisent pas, probablement en raison de l’expression de base plus élevée du peptide RAN. Ce n’est pas sans rappeler la situation dans la levure ou Drosophila où les souches exprimant toxiques peptides RAN sont maintenus dans des conditions permissives (c.-à-d., basse température), mais ensuite aiguement déplacé vers des conditions restrictives (c.-à-d., une température plus élevée) avant l’essai13,15 pour améliorer l’expression peptide. Dans ces systèmes d’expression conditionnelle, les conditions génétiques qui améliorent ou suppriment la toxicité pourraient résulter de changements dans les niveaux d’expression peptide. Pour déterminer si les modificateurs génétiques de la toxicité du peptide RAN agissent par des altérations dans les niveaux d’expression transgène, nous adoptons deux approches. Tout d’abord, beaucoup de nos souches transgéniques expriment un deuxième journaliste de DP sous le contrôle du même promoteur utilisé pour conduire l’expression du peptide RAN. Les changements dans l’activité des promoteurs qui causent une diminution ou une augmentation de l’expression du peptide RAN entraînent des réductions ou des augmentations similaires des niveaux de DP. Nous considérons les mutants ou les conditions d’ARNi qui modifient considérablement les niveaux de DP pour agir de façon non spécifique. Deuxièmement, nous effectuons le PCR quantitatif et le ballonnement occidental pour déterminer si les niveaux de l’ARN du peptide DE RAN ou de protéine sont modifiés entre les conditions. Cependant, la détection occidentale des peptides RAN peut parfois s’avérer difficile ou impossible, comme nous et d’autres l’avons observé avec le PEPtide RAN PR50-GFP dérivé de C9orf72. Dans de tels cas, nous quantifiés les niveaux in vivo GFP pour déterminer si l’expression des protéines est altérée entre les conditions étant comparées.

Toxicité du développement : avantages et limites
La surexpression forcée des peptides toxiques de RAN dans le muscle mène souvent à l’arrêt développemental dans C. elegans. Bien que cela n’imite clairement pas la pathologie des maladies humaines, il fournit un point de départ puissant pour les écrans suppresseurs génétiques, parce que les suppresseurs de toxicité RAN sont facilement identifiés comme des animaux qui se développent et se reproduisent en l’absence de gfp (ARNi). Certains suppresseurs faciliteront la croissance en raison de la réduction de l’expression transgène. Pour différencier ces possibilités, nous incluons généralement un deuxième journaliste de DP conduit par le même promoteur dans notre souche transgénique ran peptide. Les suppresseurs qui réduisent ou réduisent l’expression transgène présenteront également des niveaux réduits d’expression de DP. D’autre part, les suppresseurs qui présentent des niveaux normaux ou élevés de DP sont peu susceptibles de fonctionner par la réduction de l’expression transgène. Tout comme l’utilisation de la croissance de levure ou de la morphologie oculaire Drosophila 13,15,27, ces approches, tout en ne modélisant pas précisément les aspects de la maladie chez l’homme, fournissent un outil de dépistage puissant pour l’identification initiale des modificateurs de peptide RAN.

Toxicité post-développementale (analyse de paralysie) : Avantages et limitations
L’avantage de l’analyse de paralysie est qu’un nombre relativement élevé d’animaux (50-100) peuvent être mesurés avec des outils présents dans n’importe quel laboratoire de ver. La paralysie est également un phénotype grave qui est facilement détecté. La principale limite de cet essai est celle qui est insensible aux défauts de mouvement qui ne causent pas la paralysie complète. De tels défauts peuvent nécessiter des approches plus sensibles et quantitatives à mesurer, telles que les essais de raclée ou les essais de mouvements cinématiques28. Les essais de paralysie doivent être effectués aveuglés au génotype si possible et il faut veiller à ce que les vers ne subissent aucun autre type de stress (p. ex., contamination, famine), qui pourrait avoir un impact significatif sur les résultats de l’essai. C. elegans exprimant des peptides ran toxiques parfois ne parviennent pas à montrer un phénotype de paralysie robuste. Ceci est probablement dû aux effets persistants du gfp (RNAi) continuant à supprimer l’expression de peptide de RAN. Dans ces cas, si nous ne observons pas une paralysie significative (-gt;10%) dans le vecteur vide (ARNi) contrôler les animaux après le jour 2, nous finisons généralement l’essai et initier une autre réplique. Une modification de cet essai pourrait impliquer l’utilisation d’autres systèmes inductibles d’expression peptide RAN. Le seul autre système d’expression inductible couramment utilisé pour C. elegans est le promoteur de choc thermique. Cependant, le choc thermique requis peut provoquer des réactions de stress qui pourraient affecter la toxicité des protéines. L’application future d’autres systèmes d’expression conditionnelle, tels que le système de degron auxin-inductible (AID)29, pourrait améliorer considérablement notre capacité à étudier la toxicité du peptide RAN.

Essai de neurodégénérescence/commissure : Avantages et limites
Les commissures de neurone moteur dans C. elegans représentent l’axone d’un neurone moteur passant entre les cordons nerveux ventral et dorsale. Le blebbing et la rupture peuvent être facilement détectés dans les commissures isolées, ce qui permet de quantifier rapidement la neurodégénérescence chez les animaux vivants(figure 2). Tout en examinant les animaux, il est important qu’ils n’incubent pas dans le levamisole pendant une longue période de temps car cela peut causer la mort prématurée d’animaux, ce qui conduit à la hémorragie neuronale et la rupture en l’absence de tout peptide toxique RAN. Dans certains cas, les commissaires sont complètement dégénérés et ne sont plus visibles. Par conséquent, ils ne peuvent pas être notés pour des dispositifs neuropathologiques parce que notre essai mesure les pourcentages de commissures cassées ou blebbing hors du nombre total de commissaires observés. Dans ces cas, l’analyse de commissure pourrait sous-estimer l’effet du peptide RAN.

En conclusion, les essais décrits dans ce document sont utiles pour mesurer la toxicité causée par les peptides RAN dans C. elegans. L’utilisation du gfp (ARNi) pour réguler l’expression des protéines permet d’observer des phénotypes post-développementaux. Nos approches peuvent être facilement adaptées pour effectuer des écrans génétiques à grande échelle pour les suppresseurs ou les exhausteurs de toxicité. Les essais secondaires, tels que l’analyse de paralysie et l’analyse de commissure peuvent confirmer que la toxicité est supprimée post-développementnellement et tester si le mécanisme de suppression est conservé dans les neurones.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

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Biologie Numéro 158 neurodégénérescence SLA maladie de Huntington C9orf72 protéotoxicité troubles de l’expansion répétée
Mesurer RAN Peptide Toxicity à <em>C. elegans</em>
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Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

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