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Biology

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Wiederholte nicht-ATG-abhängige Translationsprodukte sind neu entstehende pathogene Merkmale mehrerer wiederholter, auf Expansionskrankheiten basierender Krankheiten. Das Ziel des beschriebenen Protokolls ist es, die Toxizität zu bewerten, die durch diese Peptide verursacht wird, indem Verhaltens- und Zellassays im Modellsystem C. elegansverwendet werden.

Abstract

C. elegans wird häufig verwendet, um altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, die durch wiederholte Expansionsmutationen verursacht werden, wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Huntington-Krankheit. Kürzlich wurde gezeigt, dass wiederholte, erweiterungshaltige RNA das Substrat für eine neuartige Art von Proteinübersetzung ist, die als repeat-assoziierte nicht-AUG-abhängige (RAN) Translation bezeichnet wird. Im Gegensatz zur kanonischen Übersetzung erfordert die RAN-Übersetzung kein Start-Codon und tritt nur auf, wenn Wiederholungen eine Schwellenwertlänge überschreiten. Da es kein Startcodon gibt, um den Leserahmen zu bestimmen, erfolgt die RAN-Übersetzung in allen Leserahmen sowohl aus Sense- als auch aus Antisense-RNA-Vorlagen, die eine wiederholte Erweiterungssequenz enthalten. Daher erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl möglicher krankheitsassoziierter toxischer Peptide von eins auf sechs. Bisher wurde die RAN-Übersetzung in acht verschiedenen wiederholten, erweiterungsbasierten neurodegenerativen und neuromuskulären Erkrankungen dokumentiert. In jedem Fall ist die Entschlüsselung der AL-Produkte, die toxisch sind, sowie ihrer Toxizitätsmechanismen ein entscheidender Schritt, um zu verstehen, wie diese Peptide zur Krankheitspathophysiologie beitragen. In diesem Beitrag stellen wir Strategien zur Messung der Toxizität von RAN-Peptiden im Modellsystem C. elegansvor. Zunächst beschreiben wir Verfahren zur Messung der RAN-Peptidtoxizität auf das Wachstum und die Beweglichkeit der Entwicklung von C. elegans. Zweitens beschreiben wir einen Test zur Messung postentwicklungsabhängiger, altersabhängiger Wirkungen von RAN-Peptiden auf die Beweglichkeit. Schließlich beschreiben wir einen Neurotoxizitätstest zur Bewertung der Auswirkungen von RAN-Peptiden auf die Neuronenmorphologie. Diese Assays bieten eine umfassende Bewertung der RAN-Peptidtoxizität und können für die Durchführung von groß angelegten genetischen oder kleinen Molekül-Screens nützlich sein, um Krankheitsmechanismen oder Therapien zu identifizieren.

Introduction

Die unangemessene Ausdehnung von DNA-Wiederholungssequenzen ist die genetische Grundlage für mehrere neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und Huntington (HD)1. Zwar gibt es etablierte Zell- und Tiermodelle für diese Krankheiten, Mechanismen, die diesen Bedingungen zugrunde liegen, sind jedoch nicht genau definiert. Beispielsweise wird DIE Huntington-Krankheit durch die Erweiterungeiner einer CAG-Wiederholungssequenz in der Codierungssequenz für das Huntingtin-Protein Htt2verursacht. Da CAG die Aminosäure Glutamin kodiert, führt die CAG-Wiederholungsexpansion zur Insertion einer Polyglutamin- oder PolyQ-Sequenz innerhalb von Htt. Erweiterte PolyQ-Proteine bilden längen- und altersabhängige Proteinaggregate, die mit Toxizität3,4verbunden sind. Überraschenderweise deuten zwei neuere Studien darauf hin, dass die Länge der PolyQ-Sequenz nicht der Haupttreiber des Auftretens von Huntington-Erkrankungen ist, was darauf hindeutet, dass polyQ-unabhängige Faktoren auch zur Krankheit beitragen können5,6.

Ein möglicher polyQ-unabhängiger Mechanismus beinhaltet eine neu entdeckte Art von Proteinübersetzung mit dem Begriff Repeat Associated Non-AUG-abhängige (RAN) Übersetzung7. Wie der Name schon sagt, tritt die RAN-Übersetzung nur auf, wenn eine erweiterte Wiederholungssequenz vorhanden ist und kein kanonisches Start-Codon erfordert. Daher erfolgt die RAN-Übersetzung in allen drei Leserahmen der Wiederholung, um drei unterschiedliche Polypeptide zu erzeugen. Da viele Gene auch ein Antisense-Transkript produzieren, das die umgekehrte Ergänzung der erweiterten Wiederholungssequenz enthält, findet sich die RAN-Übersetzung auch in allen drei Lesebildern des Antisense-Transkripts vor. Zusammen erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl der Proteine, die aus einer erweiterten, wiederholhaltigen DNA-Sequenz von einem Peptid auf sechs Peptide produziert werden. Bis heute wurde die RAN-Übersetzung bei mindestens acht verschiedenen Wiederholungsdehnungsstörungen beobachtet8. RAN-Peptide werden in postmortalen Patientenproben beobachtet und nur in Fällen, in denen der Patient eine erweiterte Wiederholung9,10trägt. Während diese Peptide eindeutig in Patientenzellen vorhanden sind, ist ihr Beitrag zur Krankheitspathophysiologie unklar.

Um die potenzielle Toxizität im Zusammenhang mit RAN-Peptiden besser zu definieren, haben mehrere Gruppen jedes Peptid in verschiedenen Modellsystemen wie Hefe, Fliegen, Mäusen und Gewebekulturzellen11,,12,13,,14,15,16exprimiert. Anstatt die Wiederholungssequenz für den Ausdruck zu verwenden, verwenden diese Modelle einen Codon-Variation-Ansatz, bei dem die Wiederholungssequenz eliminiert wird, aber die Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Die Translationsinitiierung erfolgt durch ein kanonisches ATG und das Peptid wird in der Regel mit einem fluoreszierenden Protein am N- oder C-Terminus verschmolzen, von denen keines die RAN-Peptidtoxizität zu stören scheint. Daher überexpressest jedes Konstrukt ein einzelnes RAN-Peptid. Die Modellierung der verschiedenen RAN-Produkte in einem multizellulären Organismus mit einfachen Assays zur Messung der RAN-Peptidtoxizität ist von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie die verschiedenen RAN-Produkte aus jeder krankheitserregenden Wiederholungsexpansion zu zellulärer Dysfunktion und Neurodegeneration beitragen.

Wie andere Modellsysteme bietet C. elegans eine flexible und effiziente experimentelle Plattform, die Studien neuer Krankheitsmechanismen wie der RAN-Peptidtoxizität ermöglicht. Würmer bieten mehrere einzigartige experimentelle Attribute, die derzeit in anderen Modellen der RAN-Peptidtoxizität nicht verfügbar sind. Erstens sind C. elegans von der Geburt bis zum Tod optisch transparent. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung der RAN-Peptidexpression und -lokalisation sowie eine In-vivo-Analyse der Neurodegeneration bei lebenden Tieren. Zweitens sind transgene Methoden zur Erzeugung von RAN-Peptidexpressionsmodellen kostengünstig und schnell. Angesichts des kurzen dreitägigen Lebenszyklus von C. eleganskönnen stabile transgene Linien, die ein bestimmtes RAN-Peptid zellspezifisch exdrücken, in weniger als einer Woche hergestellt werden. Drittens können einfache phänotypische Outputs mit genetischen Screening-Methoden wie chemischer Mutagenese oder RNAi-Screening kombiniert werden, um Schnell Gene zu identifizieren, die für die RAN-Peptidtoxizität unerlässlich sind. Schließlich ermöglicht die kurze Lebensdauer von C. elegans (ca. 20 Tage) den Forschern zu bestimmen, wie das Altern, das der größte Risikofaktor für die meisten wiederholten Expansionskrankheiten ist, die TOXIZITÄT des RAN-Peptids beeinflusst. Zusammen ist diese Kombination von experimentellen Attributen in jedem anderen Modellsystem unübertroffen und bietet eine leistungsstarke Plattform für die Untersuchung der RAN-Peptidtoxizität.

Hier beschreiben wir mehrere Assays, die die experimentellen Vorteile von C. elegans nutzen, um die Toxizität von RAN-Peptiden zu messen und genetische Modifikatoren dieser Toxizität zu identifizieren. Die kodon-verschiedenen ATG-initiierten RAN-Peptide werden mit GFP markiert und entweder in Muskelzellen unter dem Myo-3-Promotor oder in GABAergen Motorneuronen unter dem unc-47-Promotor einzeln exprimiert. Für die Expression in Muskelzellen ist es wichtig, dass toxische RAN-Peptide mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder einem anderen Fluoreszenzprotein-Tag (FP) markiert werden, das mit einem RNAi-Fütterungsvektor gezielt werden kann. Dies liegt daran, dass die toxische RAN-Peptidexpression in der Regel das Wachstum blockiert und solche Belastungen nicht lebensfähig macht. Die Verwendung von gfp(RNAi) inaktiviert bedingt die RAN-Peptidexpression und ermöglicht Dehnungserhaltung, genetische Kreuze usw. Für Assays werden diese Tiere aus gfp(RNAi)entfernt, was die Expression des RAN-Peptids und der resultierenden Phänotypen ermöglicht. Zusätzlich zu der molekularen Strategie zur Gestaltung kodon-variierter RAN-Peptidexpressionskonstrukte beschreiben wir Assays zur Messung der Entwicklungstoxizität (Larval Motilität und Wachstumstest), post-entwicklungsbedingten altersassoziierten Toxizitäten (Paralyse-Assay) und neuronmorphologischen Defekten (Commissure Assay).

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Protocol

1. Erzeugung von codon-variierten RAN-Peptid-Expressionskonstrukten

  1. Entwerfen Sie die individuelle RAN-Peptid-Codierungssequenz unter Verwendung synonymer Codons, um die grundlegende repetitive DNA/RNA-Struktur zu eliminieren, aber die darüber liegende Aminosäuresequenz zu erhalten.
  2. Bestellen Sie die benutzerdefinierten Codonsequenzen kommerziell zu den Für die Studien benötigten Wiederholungslängen (in der Regel 5–100 Wiederholungen). Schließen Sie eine HindIII-Beschränkungsstelle am 5'-Ende und eine BamHI-Einschränkungsstelle am Ende 3 ein, um das Klonen in C. elegans Expressionsvektoren wie pPD95.79 zu erleichtern.
    HINWEIS: Wenn sich die Synthese größerer Konstrukte als schwierig erweist, können kleinere Bausteinsequenzen synthetisiert und dann mithilfe einer Richtungsligationsstrategie17in größere Wiederholungen integriert werden.
  3. Subklonieren Sie die Peptidsequenz in einen C. elegans Expressionsvektor mit Standard-T4-Ligationsmethoden.
  4. Subklonieren Sie eine zelltypspezifische Promotorsequenz, die von PCR vor der RAN-Peptidsequenz erzeugt wird, um die gewebespezifische RAN-Peptid-GFP-Expression anzutreiben.
  5. Mikroinjizieren Sie das RAN-Peptidkonstrukt in den Gonaden des wilden Typs C. elegans, um transgene Stämme zu erzeugen, die extrachromosomale Arrays mit Standardmethoden18enthalten. Für einen Co-Injektionsmarker wurde der muskelspezifische RFP-Reporter (myo-3p::RFP (pCFJ104)) verwendet, obwohl auch andere Marker verwendet werden können.
  6. Integrieren Sie ein stabiles Transgen in das Genom mit Standard C. elegans Integrationsscreeningmethoden19.
  7. Wenn das RAN-Peptid toxisch ist und transgene Tiere nicht überleben, füttern Tiere gfp(RNAi), die Bakterien vor und nach der Injektion exemittieren, um die Expression des toxischen Proteins zum Schweigen zu bringen.
    ANMERKUNG: Die Entfernung von Tieren aus gfp(RNAi) ermöglicht die RAN-Peptidexpression für phänotypische Analysen mit den unten beschriebenen Assays.

2. Messung der Entwicklungstoxizität von RAN-Peptiden nach RNAi-basiertem Gen-Knockdown: Videogeschwindigkeitsanalyseprotokoll

  1. Gießen Sie Standard-Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) RNAi 24-Wellplatten mit 1 mM Isopropyl-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 25 g/ml Carbenicillin.
  2. Streifen Sie RNAi-Fütterungklone in HT115-Bakterien, die auf Luria-Brühe (LB) getestet werden sollen , + Carbenicillin (25 g/ml) Agarplatten und wachsen Bakterien bei 37 °C für 24 h. Leere Vektor (RNAi) als positive Kontrolle für Toxizität und gfp(RNAi) als Negativkontrolle.
  3. Für jeden Klon eine einzelne Kolonie in 1 ml LB + Carbenicillin flüssige Medien pflücken und Bakterien über Nacht bei 37 °C wachsen, während sie bei 250 Umdrehungen pro Minute (RPM) schütteln.
  4. Entdecken Sie vier einzelne Brunnen der NGM RNAI 24 Brunnen mit 20 l der folgenden über Nacht bakteriellen Kulturen: Spalte 1 Brunnen = gfp(RNAi); Spalte 2 Brunnen = (EV)RNAi; Säulen 3–6 Brunnen = RNAi gegen zu prüfende Gene. RNAi-Bakterien erlauben, die dsRNA-Produktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) zu induzieren.
  5. Isolieren Sie Eier vom ersten Tag C. elegans, die das integrierte RAN-Peptidtransgen nach der Standard-Hypochlorit-Methode ausdrücken, und Samen von 30 C. elegans Eier in jeden Brunnen der NGM RNAi 24 WellPlatte.
  6. Inkubieren Sie die 24 Brunnen bei 20 °C für 7 Tage.
    HINWEIS: Diese Inkubationszeit gilt für Stämme, die giftige C9orf72 RAN-Dipeptide wie PR50 oder GR50 exdrücken. Andere Stämme können kürzere Inkubationszeiten erfordern, um die Erschöpfung der bakteriellen Nahrungsquelle und den anschließenden Hunger zu verhindern.
  7. Erfassen Sie Durchlichtvideos mit einem Leica MZ16FA Stereo-Sezierendesmikroskop, das mit einer DFC345FX Monochromkamera ausgestattet ist, die an einen Windows-kompatiblen PC mit Leica AF Videoaufnahmesoftware (Version 2.6.0.7266) angeschlossen ist.
    1. Erwerben Sie zwei Videos aus zwei separaten Bohrungen für jede RNAi-Bedingung mithilfe konsistenter Videoaufnahmeeinstellungen zwischen Brunnen. Erfassen Sie für jedes Video 10 Sekunden bei 800 x 600 Pixel Auflösung und 13,16 Bildern pro Sekunde (Zeitvoxel-Dimension = 0,076 Sekunden) mit 18,6-facher Vergrößerung (1,49-Zoom-Einstellung in der AF-Software). Legen Sie die Belichtungszeit des Bildes auf 4 Millisekunden fest. Beschriften Sie jedes Video sofort mit der Sorte, RNAi Zustand und Well-Nummer.
  8. Blinden Sie den Experimentator für den Genotyp, der jeder Videodatei zugeordnet ist, indem Sie die Reihenfolge der Videos randomisieren und den Namen der Videos in Zahlen ändern. Speichern Sie diese Gruppe von Videos als neue Datei. Entblinden Sie den Experimentator, nachdem die Analyse abgeschlossen ist.
  9. Messen Sie die "zurückgelegte Entfernung" und die Länge jedes Tieres für 20 verschiedene Tiere aus jedem Video, wobei insgesamt 40 Würmer für jede RNAi-Bedingung untersucht werden.
    1. Wählen Sie in der Software die Schaltfläche "Anmerkungswerkzeuge" und dann das Textwerkzeug zeichnen aus. Klicken Sie auf einen Punkt in der Mitte des Wurms, der im ersten Frame des Videos gemessen wird, und markieren Sie ihn als Zahl. Bewegen Sie das Video bis zum Ende, während Sie den Bewegungspfad des Wurms visuell verfolgen. Klicken Sie im letzten Frame auf einen Punkt in der Mitte des gemessenen Wurms und markieren Sie die nächste entsprechende Zahl. Zeichnen Sie dann mithilfe des Ziehmaßstabswerkzeugs eine Linie von der ersten Zahl zur zweiten Zahl, um die "zurückgelegte Strecke" aufzuzeichnen.
    2. "zurückgelegte Entfernung" ist der Abstand zwischen den beiden Schwerpunktpunkten. Dieser Abstand wird neben der Messlinie angezeigt. Zeichnen Sie diese Messung in einer Kalkulationstabelle auf. Wiederholen Sie diese Messung für 19 andere Würmer im Video, während jede einzelne Messung im Analysefenster beibehalten wird.
  10. Machen Sie Messungen von Tieren mit der robustesten Bewegung, um die Auswahl von Tieren zu vermeiden, die keine Bewegung aufweisen und die Daten in Richtung Lähmung verzerrt. Sobald die Messungen abgeschlossen sind, machen Sie eine Momentaufnahme des endgültigen Videorahmens, der alle Messlinien veranschaulicht, so dass die Daten auf das Tier zurückverfolgt werden können, von dem sie stammen.
  11. Analysieren Sie die Daten mithilfe einer vierspaltigen Kalkulationstabelle. Spalte eins ist der Wurm "Bezeichner", Spalte zwei ist die zurückgelegte Strecke / Zeit (Geschwindigkeit).
    1. Die Uhrzeit jedes Videos kann durch Rechtsklick auf das Video unter dem Experiment und gehen sie zu den Eigenschaften des Videos gefunden werden.
  12. Normalisieren Sie die Geschwindigkeitsmessung, indem Sie die Länge jedes Tieres finden, indem Sie Quantify und dann Statistiken über die Software auswählen. Ein Klick auf das Symbol des Anmerkungswerkzeugs auf der Videoanzeige sollte die Verwendung des Werkzeugs "Polylinie zeichnen" ermöglichen. Dieses Werkzeug kann dann verwendet werden, um die C. elegans vom Video von der Spitze des Kopfes bis zur Schwanzspitze frei zu verfolgen. Die Länge der Strecke wird in der Statistik erfasst.
    1. Erstellen Sie eine Momentaufnahme des endgültigen Videorahmens, der alle Polylins veranschaulicht, die für die Dimensionierung der C. elegans verwendet werden, so dass die Daten auf das Tier zurückverfolgt werden können, von dem sie stammen.
  13. Analysieren Sie die Daten, indem Sie der Kalkulationstabelle zwei zusätzliche Spalten hinzufügen. Spalte drei ist die "Tierlänge", und Spalte vier ist die "Normalisierte Geschwindigkeit" (Geschwindigkeit/Tierlänge). Analysieren Sie die normalisierten Geschwindigkeitsdaten mit einer einwegigen ANOVA mit Post-hoc-Tests im Vergleich zu leeren Vektoren (RNAi).

3. Messung der Entwicklungstoxizität von RAN-Peptid: Wachstumstest

  1. Wählen Sie 30 Gravid-Tiere in einen 50-L-Punkt der Hypochloritlösung (10 ml Bleichmittel, 2,5 ml 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) entweder auf einer gfp(RNAi), (EV)RNAi oder (genspezifisch) 6 cm RNAi-Platte.
  2. Nach 24 h sechs transgene Nachkommen, die aus dem Hypochloritlösungspunkt herausgekrochen sind, auf eine neue 6 cm RNAi-Platte bewegen, die mit den RNAi-Bedingungen auf der Platte identisch ist, auf der sie der Hypochloritlösungsbehandlung unterzogen wurden. Diese Nachkommen (F1) auf 20 °C stellen, um zu wachsen und sich zu vermehren.
  3. Nach 24–48 h pflücken Sie 10 transgene L4-Tiere auf 6 cm RNAi, die den RNAi-Bedingungen entsprechen, auf denen die Tiere wachsen. Lassen Sie die Tiere legen Eier für 24 h in einem 20 °C Inkubator pulsieren.
  4. Nach 24 h die erwachsenen Tiere entfernen und entsorgen. Zählen Sie die Anzahl der Eier und L1-Larven, die während des 24-Stunden-Zeitraums mit einem mechanischen Handzähler gelegt wurden. Dies ist die gesamte Brutgröße.
  5. Zählen Sie in den nächsten 72 Stunden die Anzahl der Tiere, die die L4 oder ältere Stufe erreichen. Wenn jedes Tier gezählt wird, entfernen Sie es von der Platte.
  6. Quantifizieren Sie das "Prozentwachstum" als Prozentsatz der Tiere, die das L4-Stadium oder ein älteres Stadium apreals aus der gesamten Brutgröße erreichen.
  7. Führen Sie einen exakten Test von 2 x 2 Fisher im Vergleich zum leeren Vektor (RNAi) durch, um festzustellen, ob das prozentuale Wachstum statistisch signifikant ist. Die Kategorien zum Vergleich sind "Wachstum" (" der Tiere, die das L4-Stadium erreichthaben oder älter in 72 h) und "Kein Wachstum" (Gesamtbrutgröße abzüglich der Anzahl der Tiere, die L4 oder älter in 72 h erreichen).

4. Post-Developmental RAN Peptid Lähmung Assay

  1. Bewahren Sie integrierte Transgenstämme von C. elegans, die RAN-Peptid-GFP im Muskel auf gfp(RNAi) exemiten, indem Sie 4–6 transgene L4 es auf eine 6 cm gfp(RNAi) Platte legen und die Würmer bei 20 °C anbauen.
  2. Wenn das Experiment RNAi nutzt, um genetische Auswirkungen auf die RAN-Peptidtoxizität zu testen, bewegen Sie 10 transgene gravid Erwachsene von einer ungehungerten Platte auf jeweils zwei 6 cm leere Vektor(RNAi) (positive Kontrolle auf Lähmung, negative Kontrolle für genetische Effekte), gfp(RNAi) (negative Kontrolle für Lähmungen, positive Kontrolle für genetische Effekte), genspezifische(RNAi) (d.h., 10 gravid Erwachsene pro 6 cm Platte).
  3. Wenn Mutanten verwendet werden, um genetische Auswirkungen auf die RAN-Peptidtoxizität zu analysieren, platzieren Sie 10 gravid WT oder mutierte Tiere, die das gleiche RAN-Transgen auf zwei 6 cm leere Vektorplatten(RNAi) oder gfp(RNAi) ausdrücken. Die Würmer bei 20 °C für 48 h anbauen.
  4. Wählen Sie 10 Sets von 10 transgenen L4 aus den 6 cm RNAi-Platten und legen Sie jedes Set auf eine 3 cm RNAi-Platte (d. h. n = 100 Tiere pro Genotyp). Stellen Sie sicher, dass die für den Test ausgewählten L4 alle oberflächlich normale Beweglichkeit enden. Legen Sie die Platten in einen Reißverschluss-Aufbewahrungsbeutel, um Feuchtigkeit zu behalten.
  5. Legen Sie die verpackten Platten mit L4 in den 25 °C-Inkubator.
  6. Entfernen Sie die Tiere 24 h später aus dem 25 °C Inkubator eine Sorte nach der anderen, um die Zeit zu minimieren, die sie bei RT sind.
  7. Tippen Sie auf die Platten am Sezierendes Mikroskop, um die Bewegung zu überprüfen. Wenn sich die Tiere mehr als eine Körperlänge bewegen, zählen Sie das Tier als mobil und übertragen Sie es auf eine neue 3 cm RNAi-Platte. Verwenden Sie eine Platin-Pick, um die verbleibenden Würmer auf den Kopf oder Schwanz tippen. Bewegt sich das Tier mehr als eine Körperlänge, zählen Sie das Tier als mobil und übertragen Sie es auf eine neue 3 cm RNAi-Platte.
    HINWEIS: Nicht mehr als 10 Würmer pro Platte bei der Übertragung. Achten Sie darauf, die Nachkommenschaft nicht auf die neue RNAi-Platte zu verschieben, da der Test nur von der Folgenden alter Tiere abhängt.
  8. Gruppieren Sie alle nicht beweglichen Würmer so, dass Bewegungen von mehr als einer Körperlänge leicht erkannt werden können. Geben Sie dem Tier mindestens eine Minute, um mehr als eine Körperlänge zu bewegen. Wenn es sich immer noch nicht bewegt, ist es gelähmt, eingesackt (d.h. Larven, die in der Mutter geschlüpft sind) oder tot.
  9. Zensierende Tiere, die Absacken aufweisen, an den Seiten des Tellers verachten, extrudierte Därme ausstellen, graben, verloren gehen oder zum Zeitpunkt der Detektion am Test sterben. Gelähmte Würmer werden gezählt, auf der alten RNAi-Platte zurückgelassen und entsorgt.
  10. Erzielen Sie die Tiere jeden Tag für 5-7 Tage, wie in den Schritten 4.6-4.9 beschrieben.
  11. Analysieren Sie Lähmungsdaten mit einem Log-Rank-Test, der mit dem zur Analyse der Lebensdauer identisch ist. In dieser statistischen Analyse werden bewegte Würmer als "Alive" bewertet, gelähmte Würmer als "Tot" und tot, verpackt, darm extrudiert, ausgetrocknet, gegraben oder anderweitig verlorene Würmer als "Zensiert" bewertet.
    HINWEIS: In dieser Analyse gibt die Zahl "Percent Alive" die "Percent Moving"-Tiere an. Das Inverse stellt das "Prozent gelähmt" dar. Verwenden Sie das Online-Analysetool OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/), um statistische Analysen im Log-Rank durchzuführen.

5. Messung der Neuronenpathologie: Commissure-Assay

  1. Generieren Sie transgene C. Elegane, die das RAN-Peptid von Interesse in den GABAergen Neuronen mit dem Unc-47-Promotor ausdrücken. Drücken Sie auch unc-47p::GFP oder unc-47p::RFP, um die zelluläre Morphologie der GABA-Neuronen zu offenbaren.
  2. 50 transgene L4-Tiere pflücken und 24 h auf eine 6 cm OP50 Platte bei 25 °C legen.
  3. Die 50 transgenen Tiere bei 25 °C für 24 h auf eine neue 6 cm OP50 Platte geben.
  4. Machen Sie Agarose-Pads für die Abbildung der Tiere unter Weitfeldmikroskopie.
    1. Legen Sie zwei Klebebandstücke auf zwei Mikroskopschlitten. Legen Sie eine gereinigte Folie ohne Klebeband in die Mitte der beiden geklebten Dias.
    2. Geben Sie 3% geschmolzene Agarose mit einer Steril-Transfer-Einweg-Übertragungspipette auf den mittleren Schlitten (1 Tropfen aus einer Einweg-Kunststoff-Pasteur-Pipette).
    3. Legen Sie sofort eine zweite saubere Rutsche über den Tropfen geschmolzener Agarose, so dass sie auf den verklebten Dias ruht und eine dünne und gleichmäßige Schicht von Agarose zwischen den Dias erzeugt.
    4. Nachdem die Agarose abgekühlt und verfestigt hat, entfernen Sie vorsichtig die beiden Dias mit der Schicht von Agarose zwischen ihnen, ohne sie zu trennen, und legen Sie sie in eine Plastiktüte mit einem feuchten Stück Papier darunter. Machen Sie eine Folie pro 10 Würmer, die untersucht werden soll, zusammen mit drei zusätzlichen Folien.
  5. Entfernen Sie die transgenen C. elegans aus dem 25 °C Inkubator und pflücken Sie 10 transgene C. elegans in einem 100-L-Tropfen von 10 mM Levamisol in einem Glasdepressionsschlitten. 10 min oder bis die Tiere gelähmt sind.
  6. Entfernen Sie ein Diapaar aus der Plastiktüte und trennen Sie es sorgfältig. Beschriften Sie das Dia mit der Agarose mit dem Genotyp und fügen Sie der Mitte der Agarose 2 l von 10 mM Levamisol hinzu. Bewegen Sie die 10 Tiere in die Levamisole auf dem Agarose-Pad. Bedecken Sie die Tiere mit einem #1 Dicken-Abdeckung.
  7. Bildtiere, bei denen die Vulva so ausgerichtet ist, dass sie sich auf der rechten Seite des Tieres befindet. Wenn sich die Vulva auf der linken Seite des Kopfes befindet, werden die Kommissuren der motorischen Neuronen unter den Tieren sein und nicht so deutlich sichtbar sein, was eine genaue Quantifizierung erschwert. Lassen Sie die Quantifizierung von diesen Tieren weg. In dieser Ausrichtung sind die Kommissuren der Motorneuronen dem Coverslip am nächsten und auf einem invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar. Visualisieren Sie die Neuronen-Kommissuren, die GFP exzieren, mit einem Leica DMI4000B invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop mit einem 63X 1.4X NA-Öl-Tauchlinsen und einem Leica L5 GFP-Filterset (Ex480/40nm; Em527/30nm). Wenn die Neuronen-Kommunikation RFP anstelle von GFP ausdrücken, verwenden Sie einen Leica TX2 RFP-Filtersatz (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualisieren Sie die Neuronen-Kommissuren, die GFP exzieren, mit einem invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop mit einer 63x 1,4x NA-Öl-Tauchlinse und einem GFP-Filterset (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Wenn die Neuronen-Kommissuren RFP anstelle von GFP ausdrücken, verwenden Sie ein rotes fluoreszierendes Protein (RFP) Filterset (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Stellen Sie die Würmer innerhalb von 45 min auf, um den Deckelaufschlag auf die Würmer zu legen, um die Toxizität durch Immobilisierung zu minimieren.
  9. Zählen Sie für jeden Wurm die Anzahl der sichtbaren Kommissuren. Es gibt 16 sichtbare Kommissuren bei Wildtieren. Zählen Sie auch die Anzahl der Kommissuren, die große Perlen (d.h. Blebs) in den Kommissuren haben, sowie die Anzahl der Kommissuren, die gebrochen sind. Um zu bestätigen, dass die Kommissure gebrochen ist, folgen Sie der Kommissure von der Dorsalschnur bis zur ventralen Schnur, indem Sie die Brennebene einstellen.
    ANMERKUNG: Mitteilungen, in denen die unc-47p::GFP-Fluoreszenz eine Lücke aufweist, gelten als gebrochen. Eine gebrochene Kommissure hat in der Regel eine Blessur auf beiden Seiten der Pause, was dazu beiträgt, zu zeigen, dass die Kommissuren gebrochen sind. Zählen Sie die Menge an Blödungen und Pausen für 20 Würmer.
  10. Berechnen Sie den Anteil der Kommissuren mit Blebs oder Brüchen über die Gesamtzahl der beobachteten Kommissuren für jedes Tier. Die absolute Anzahl der pro Tier gezählten Kommissuren (einschließlich Wildtyp, Blutungen und gebrochene Ereignisse) kann ebenfalls gemessen werden.
  11. Berechnen Sie für jede Kategorie den Mittelwert sD und analysieren Sie statistisch entweder mit einem Schüler-t-Test für den Vergleich zwischen zwei Populationen oder einer einseitigen ANOVA für Vergleiche zwischen 3 oder mehr Populationen.

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Representative Results

Wir verwendeten die hier beschriebenen Assays, um die Wirkung verschiedener Genhemmungen auf die Toxizität von RAN-Dipeptiden zu bewerten, die bei ALS-Patienten mit einer G4C2-Wiederholungsexpansion gefunden werden. Mit Hilfe des Wachstums-Assays zur Messung der Entwicklungstoxizität analysierten wir die Auswirkungen mehrerer genetischer Knockout-Mutationen, die in einem genomweiten RNAi-Bildschirmsuppressoren der muskelausgedrückten PR50-GFP-Toxizität identifiziert wurden. Während die Expression von PR50-GFP allein zu einem völlig penetranten Wachstumsstillstand führte, unterdrückte der Verlust von Funktionsmutationen in mehreren Genen die PR-Entwicklungstoxizität von 12–94%(Abbildung 1A).

Wir haben auch die Auswirkungen spezifischer Gen-Knockdowns auf die Entwicklungsmotilität von PR50-exemittierenden Tieren mit der Videogeschwindigkeitsanalysemethode gemessen. Wie erwartet führte gfp(RNAi) aufgrund der Hemmung der PR50-GFP-Expression zu einer starken Erhöhung der Beweglichkeit im Vergleich zu leeren Vektoren (RNAi). Wir entdeckten auch, dass RNAi gegen die Proteasome-Untereinheit rpn-7 zu einer signifikanten Zunahme der PR50-Motilität führte (Abbildung 1B).

ALS tritt, wie viele neurodegenerative Erkrankungen, bei Erwachsenen auf. Daher analysierten wir erwachsene Phänotypen mit dem altersabhängigen Lähmungstest. PR50-GFP zeigte bis zu 80% Lähmung im Alter von 5 Tagen. RNAi, das sich jedoch auf das Gen cul-6 richtete, verzögerte die Lähmung signifikant, was darauf hindeutet, dass cul-6 für die PR50-GFP-Toxizität erforderlich ist (Abbildung 1C). Dieser Effekt war spezifisch für cul-6(RNAi), da cul-1(RNAi) die PR50-GFP-Toxizität nicht verändert.

Neurodegenerative Proteine, wie toxische RAN-Peptide, werden häufig in der Körperwand von C. elegans4,20,21,22modelliert. Es ist jedoch auch wichtig zu bestimmen, ob RAN-Proteine Neuropathologie verursachen, wenn sie in C. elegans Neuronen exprimiert werden, da neuronspezifische Toxizität ein häufiges Merkmal vieler neurodegenerativer Erkrankungen ist. Wir untersuchten neuronspezifische Toxizität mit dem Commissure-Assay. In Tag 2 Erwachsene, PR50-GFP-Expression in den motorischen Neuronen führte zu einem signifikanten Anstieg der motorischen Neuronblebbing. Diese Neuropathologie wurde signifikant durch eine Mutation im Insulin/IGF-Rezeptor-Gen Homolog daf-2 unterdrückt, die die toxischen Eigenschaften mehrerer neurodegenerativer Proteine verzögert23 (Abbildung 2B).

Figure 1
Abbildung 1: Assays zur Bewertung der Toxizität von muskelausgedrückten RAN-Peptiden. (A) RAN Peptidwachstumstest. Die angegebenen Mutanten wurden unter gfp(RNAi)-Bedingungen in den genetischen Hintergrund der drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) gekreuzt. Zahlen über jedem Genotyp geben die Anzahl der Nachkommen für Wachstum bewertet. Alle Genotypen haben p < 0,05 mit dem genauen Test des Fishers im Vergleich zum Wildtyp. (B) Videogeschwindigkeitsanalyse zur Messung der RAN-Peptidtoxizität während der Entwicklung. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) Tiere wurden unter gfp(RNAi), empty vector(RNAi)oder rpn-7(RNAi) Bedingungen angebaut und dann für die Beweglichkeit wie beschrieben bewertet. Die Geschwindigkeit wurde auf gfp(RNAi) behandelte Tiere normalisiert. Die angezeigten Daten sind mittelwert sD, n = 40 für jeden Genotyp. **-p < 0.01, ***- p < 0.001, einwegage ANOVA mit Tukey Post-Test. (C) Paralyse-Assay zur Messung der Toxizität des Alters. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) Tiere wurden auf leerem Vektor (RNAi) ('WT'), cul-1(RNAi)oder cul-6(RNAi) angebaut und Lähmung wurde wie beschrieben alle 24 h. ***-p < 0.001, Log-Rank-Test mit Bonferroni Post-Test-Korrektur vs. WT. n = 100 Tiere pro Genotyp bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Assay zur Messung der Neuropathologie der motorischen Neuronen exprimierte RAN-Peptide. (A) Bilder von erwachsenen C. elegans, die den unc-47p ausdrücken::GFP Motorneuron-Reporter in wildem Typ oder unc-47p::PR50-GFP, die Tiere ausdrücken. Die Bilder für wild type veranschaulichen die normale Kommissure-Morphologie. Bilder stellen abgeflachte Stapel der Z-Serie dar, die durch die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden. PR50 Tiere zeigen Beispiele für Kommissurenbruch und Blöberei. (B) Wirkung von daf-2(e1370) auf PR50 Commissure blebbing. Punkte stellen die prozentualen Blessuren eines einzelnen Tieres dar, wobei der Mittelwert und die SD angezeigt werden. n = 20 Tiere pro Genotyp **-p < 0,01, einwegig ANOVA mit Dunns Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Hier berichten wir Methoden, die verwendet werden können, um RAN Peptid Toxizität im Muskel oder in den Neuronen von C. elegansmodelliert assay. Während neurodegenerative Proteine bei menschlichen Patienten einen altersbedingten Phänotyp haben, können sie auch eine entwicklungsfördernde Weise aufweisen, wenn sie in Modellsystemen überexprimiert werden. Überexpression hat erhebliche interpretatole Einschränkungen, aber es bietet auch einen starken Ausgangspunkt für genetische oder pharmakologische Screens zur Identifizierung von Genen oder Medikamenten, die toxische Phänotypen umkehren können. Dies ist besonders wichtig, da die genauesten Tiermodelle der Krankheit entweder keinen Phänotyp oder schwache Phänotypen haben, die nicht für unvoreingenommene Screening-Ansätze geeignet sind24,25,26. Unsere C. elegans RAN Peptidmodelle und Assays stellen einen leistungsstarken, komplementären Ansatz zu anderen RAN-Peptidmodellsystemen wie Hefe und Drosophiladar, um die zellulären Wege zu verstehen, die für die Toxizität dieser neu beschriebenen Proteine wichtig sind.

Bedingte Toxizität von muskelausgedrückten RAN-Peptiden
Die Messung der RAN-Peptidtoxizität erfordert eine Verfolgungsphase zur Beseitigung der Wirkungen von gfp(RNAi). Die Zeit zwischen der Entfernung von gfp(RNAi) und der Entstehung von Phänotypen kann jedoch inkonsistent sein, wenn nicht darauf geachtet wird, die Einleitung von Versuchen, die Auswahl der inszenierten Tiere, Temperaturverschiebungen usw. genau zu terminieren. Da wir mit diesen Assays erfahrener geworden sind, ist das Timing und die Penetranz von RAN-Peptid-Phänotypen relativ konsistent geworden. Einer der wichtigsten Schritte in diesen Tests ist die richtige Verschiebung der Tiere auf 25 °C. Ohne diese Verschiebung weisen RAN-Peptide eine deutlich schwächere Toxizität auf. Tiere können jedoch nicht kontinuierlich bei 25 °C angebaut werden, weil sie nicht wachsen und sich vermehren, vermutlich aufgrund einer höheren Ausgangsexpression des RAN-Peptids. Dies ist nicht unähnlich der Situation bei Hefe oder Drosophila, wo Stämme, die toxische RAN-Peptide exdrücken, unter freizügigen Bedingungen (d. h. niedriger Temperatur) gehalten werden, dann aber akut auf restriktive Bedingungen (d. h. höhere Temperatur) vor dem Test13,15 verschoben werden, um die Peptidexpression zu verbessern. In solchen Systemen der bedingten Expression könnten genetische Bedingungen, die die Toxizität verbessern oder unterdrücken, aus Veränderungen der Peptidexpressionsspiegel resultieren. Um festzustellen, ob genetische Modifikatoren der RAN-Peptidtoxizität über Veränderungen der transgenen Expressionsniveaus wirken, verfolgen wir zwei Ansätze. Erstens drücken viele unserer transgenen Stämme einen zweiten RFP-Reporter unter der Kontrolle desselben Promotors aus, der zur Expression des RAN-Peptids verwendet wird. Veränderungen der Promotoraktivität, die zu einer reduzierten oder erhöhten RAN-Peptidexpression führen, führen zu ähnlichen Reduktionen oder Erhöhungen der RFP-Werte. Wir betrachten Mutanten oder RNAi-Bedingungen, die die RFP-Spiegel erheblich verändern, um nicht spezifisch zu handeln. Zweitens führen wir quantitative PCR und Western Blotting durch, um festzustellen, ob die Konzentrationen von RAN-Peptid-mRNA oder Protein zwischen den Bedingungen verändert sind. Allerdings kann sich der westliche Nachweis von RAN-Peptiden manchmal als schwierig oder unmöglich erweisen, wie wir und andere mit dem Von C9orf72 abgeleiteten RAN-Peptid PR50-GFP beobachtet haben. In solchen Fällen quantifizieren wir in vivo GFP-Spiegel, um festzustellen, ob die Proteinexpression zwischen den verglichenen Bedingungen verändert wird.

Entwicklungstoxizität: Vorteile und Grenzen
Erzwungene Überexpression von toxischen RAN-Peptiden im Muskel führt oft zu einer Entwicklungsverhaftung bei C. elegans. Während dies eindeutig keine menschliche Krankheitspathologie imitiert, bietet es einen starken Ausgangspunkt für genetische Suppressor-Bildschirme, weil RAN-Toxizitätsuppressoren leicht als Tiere identifiziert werden können, die in Abwesenheit von gfp(RNAi)wachsen und sich vermehren. Einige Unterdrücker werden das Wachstum durch die Verringerung der transgenen Expression erleichtern. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, schließen wir in der Regel einen zweiten RFP-Reporter ein, der von demselben Promotor in unseren transgenen RAN-Peptid-Stamm getrieben wird. Unterdrücker, die die Transgenexpression reduzieren oder zum Schweigen bringen, weisen ebenfalls reduzierte RFP-Expressionsniveaus auf. Andererseits ist es unwahrscheinlich, dass Unterdrücker, die normale oder erhöhte RFP-Werte aufweisen, durch eine Reduktion der transgenen Expression funktionieren. Ähnlich wie die Verwendung von Hefewachstum oder Drosophila Augenmorphologie13,15,27, diese Ansätze, während nicht genau Modellierung Aspekte der Krankheit beim Menschen, bieten ein leistungsfähiges Screening-Tool für die anfängliche Identifizierung von RAN-Peptid-Modifikatoren.

Post-Entwicklungstoxizität (Lähmungs-Assay): Vorteile und Einschränkungen
Der Vorteil des Lähmungs-Assays ist, dass eine relativ große Anzahl von Tieren (50–100) mit Werkzeugen gemessen werden kann, die in jedem Wurmlabor vorhanden sind. Lähmung ist auch ein schwerer Phänotyp, der leicht zu erkennen ist. Die Hauptbeschränkung dieses Assays ist, dass unempfindlich gegen Bewegungsdefekte ist, die keine vollständige Lähmung verursachen. Solche Defekte können empfindlichere und quantitativere Messansätze erfordern, wie z. B. die Thrashing-Assays oder kinematischen Bewegungsassays28. Lähmungserscheinungen sollten nach Möglichkeit vor dem Genotyp geblendet durchgeführt werden, und es sollte darauf geachtet werden, dass Würmer keiner anderen Art von Stress (z. B. Kontamination, Hunger), die die Testergebnisse erheblich beeinflussen könnten, unterliegen. C. Elegane, die toxische RAN-Peptide exdrücken, weisen manchmal keinen robusten Lähmungs-Phänotyp auf. Dies ist wahrscheinlich auf anhaltende Effekte von gfp (RNAi) weiterhin zu unterdrücken RAN Peptid-Expression. In diesen Fällen, wenn wir keine signifikante Lähmung beobachten (>10%) in der leeren Vektor (RNAi) Kontrolltiere nach Tag 2, beenden wir in der Regel den Test und initiieren eine andere Replikation. Eine Änderung dieses Assays könnte die Verwendung von alternativen induzierbaren RAN-Peptidexpressionssystemen beinhalten. Das einzige andere häufig verwendete induzierbare Expressionssystem für C. elegans ist der Hitzeschockpromotor. Der erforderliche Hitzeschock kann jedoch Stressreaktionen verursachen, die die Toxizität der Proteine beeinflussen könnten. Die zukünftige Anwendung anderer systeme für bedingte Expression, wie das auxin-induzierbare Degron(AID)-System29, könnte unsere Fähigkeit, DIE TOXIZITÄT von RAN-Peptid zu untersuchen, erheblich verbessern.

Neurodegeneration/Commissure-Assay: Vorteile und Einschränkungen
Motorneuronen-Commissures in C. elegans stellen das Axon eines motorischen Neurons dar, das zwischen den ventralen und dorsalen Nervenschnüren hin- und herreicht. Blebbing und Bruch können leicht in den isolierten Kommissuren nachgewiesen werden, so dass die Neurodegeneration bei lebenden Tieren schnell quantifiziert werden kann (Abbildung 2). Bei der Untersuchung der Tiere ist es wichtig, dass sie nicht für einen längeren Zeitraum in Levamisol brüten, da dies zu einem vorzeitigen Tod von Tieren führen kann, was zu neuronalen Blebbeln und Bruch führt, wenn kein giftiges RAN-Peptid vorhanden ist. In einigen Fällen sind Kommissuren vollständig degeneriert und nicht mehr sichtbar. Daher können sie nicht für neuropathologische Merkmale bewertet werden, weil unser Assay die Prozentsätze der gebrochenen oder blöbenden Kommissuren aus der Gesamtzahl der beobachteten Kommissuren misst. In diesen Fällen könnte der Commissure-Assay die Wirkung des RAN-Peptids unterschätzen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in diesem Papier beschriebenen Assays nützlich sind, um die Toxizität zu messen, die durch RAN-Peptide in C. elegansverursacht wird. Die Verwendung von gfp(RNAi) zur Regulierung der Expression der Proteine ermöglicht die Beobachtung post-entwicklungshnotypischer Phänotypen. Unsere Ansätze können leicht angepasst werden, um groß angelegte genetische Bildschirme für Unterdrücker oder Toxizitätsverstärker durchzuführen. Sekundäre Assays, wie der Paralyse-Assay und der Commissure-Assay, können bestätigen, dass Toxizität post-entwicklungsfördernd unterdrückt wird, und testen, ob der Mechanismus der Unterdrückung in Neuronen konserviert wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

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Biologie Ausgabe 158 Neurodegeneration ALS Huntington-Krankheit C9orf72 Proteotoxizität Wiederholte Expansionsstörungen
Messung der RAN-Peptidtoxizität in <em>C. elegans</em>
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Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

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